פרוטאז וחומצת קטליזאטור זרימות עבודת תיוג המעסיק

מצגת זו מדגימה תהליכי עבודה לסימון באיזוטופים יציבים של עיקולי חלבונים ופפטידים סינתטיים באמצעות מים מועשרים ב-oxygen 18; ראשית, בניסוי של מסלול זמן פלאאו המזורז על ידי פרוטאז, מדגירים את הסובסטרט ואת הפרוטאז בנוכחות 50% מים מועשרים ב-oxygen 18 כדי להטמיע אטומי oxygen 18; לאחר מכן, עבור פרוטאז המסוגל לסימון כפול, חוזרים על הדגירה של תוצרי השבירה שלאחר העיכול עם הפרוטאז הרלוונטי בנוכחות 50% מים מועשרים ב-oxygen 18.

סבב העבודה של ה-EO מבצע שילוב של אטומי חמצן 18 בקבוצות פונקציונליות בפרקי זמן קצובים באמצעות קטליזה חומצית. הנחת מנות (aliquots) של תערובות התגובה עם מטריצה על לוחות מטרה בעת רכישת נתונים בספקטרומטריית מסות, יוצרת תרשימי זמן ספקטרליים של תגובות פירוק הפפטידים, וכן תרשימי שילוב חמצן 18. מוצרי פירוק מסומנים של מיני פפטידים בודדים נבחרים לצורך זיהוי רצף מבוסס MS/MS. בסופו של דבר, סבבי עבודה אלו מציעים כלים רב-גוניים למחקרי פרוטאומיקה כמותיים ואיכותיים.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מחקר הפרוטאזים, כגון זיהוי קצב, שלבים מגבילים ותוצרי ביניים של תגובות במסלולים פרוטאוליטיים מורכבים. חתימות פרוטאוליטיות שזוהו באמצעות סדר הזמנים הפליאו-כימי (paleo time course) מספקות נתונים חשובים בנוגע לספציפיות של הסובסטרט. בנוסף, נתוני התזמון עושים שימוש במידע קינטי.

פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי ידגים כעת את הפרוצדורה. זרימת העבודה של paleo time course מנטרת דינמיקה של תגובות פירוק פרוטאוליטי על בסיס שילוב של חמצן 18 המזורז על ידי פרוטאז; עבור תגובה בנפח 20 µL, הוסף את הפפטידים של הדגימה למסייד תגובה של פרוטאז המכיל מים מועשירים בחמצן 18; ערבב 0.5 µL מתערובת התגובה עם 0.5 µL של מטריצה, הנח אותם על לוח MALDI target מסוג opti to 3 84 והשאר את טיפות הממס בטמפרטורת החדר עד לייבושן. בינתיים, פצל את תערובת התגובה לשתי מבחנות.

ביקורת ומדגם עבור מבחנת הדגימה. הוסף את הפרוטאז הרלוונטי והדגר בטמפרטורת התגובה האנזימטית המומלצת. הוסף בנקודות זמן מוגדרות.

הסר מנה של 0.5 microliter כדי לערבב עם 0.5 microliters של מטריצה והנח אותה על פלטת ה-multi targett. המשך בניתוח הדינמיקה של התגובה באמצעות MALDI toff ms MS כפי שמתואר בהמשך בזרימת העבודה זו של סימון לאחר עיכול פלאאו. פרוטאזות כמו trypsin מזרזות את תגובת חילוף החמצן הקרבוקסיל כדי לשלב oxygen.18. לאחר ביצוע עיכול חלבונים ללא סימון ב-oxygen 18, העבר את תוצרי השבירה דרך עמודת סינון pep clean C 18 כדי להסיר פעילות פרוטאזה שיורית.

לאחר מכן, השביה מחדש את הדגימות ב-20 µL של חוצץ לתגובת tripsin המכיל מים מועשירים ב-oxygen 18. העבר אליקוט של 0.5 µL ועזבב עם נפח שווה של מטריקס. לאחר מכן, טפטף על לוח מטרה opti off 3 84 maldi לייבוש באוויר.

בשלב הבא, חלק את תמיסת התגובה למבחורי ביקורת ומבחורי דגימה עבור מבחור הדגימה. הוסף trypsin והדגר בטמפרטורה של 37 °C. כדי לנטר את התגובה, הוצא אליקוט של 0.5 µL.

ערבב עם 0.5 µL של מטריצה והנח טיפה על לוח מטריצה. נתח את הדינמיקה של תגובת חילוף חמצן הקרבוקסיל באמצעות אנליזת Maldi Toof MSM S. זרימת העבודה של IEO Time course מתבססת על תגובות חילוף חמצן קרבוקסיל המזורזות בחומצה של קבוצות קצה ושל שרשראות צד של פפטידים חומציים.

ראשית, דגרו 50 nanomolar של פפטידים בודדים עם מים מועשרים בחמצן 18 ביחס של אחד לאחד, בנוכחות או בהיעדר של 0.1% חומצה טריכלוראצטית (trichloroacetic acid). דגמו מדי יום במשך 48 ימים מנות של 0.5 microliter מהתגובה, והעבירו אותן ישירות יחד עם המטריצה ללוחית MALDI. העבירו באופן קבוע את לוחית ה-MALDI לאנליזה באמצעות MALDI TOF MS MS. חלק זה מפורט בכתב היד המצורף.

ראשית, רכשו ספקטרומי MS בשלוש חזרות במצב יונים חיובי. לאחר כיול המכפלה (multipl) והגדרת רכישת ה-MS, רכשו מיצויים בודדים (single shots) עבור ספקטרומי משנה. לאחר מכן, ייצאו את קבצי נתוני ה-MS מתוכנת רכישת הנתונים Explorer מסדרת 4,000.

לאחר מכן, ייבא את הנתונים למערכת מידע פנימית המשתמשת בתוכנת mascot distiller לעיבוד ספקטרלי וזיהוי שיאים. בצע דקונבולוציה למעטפות האיזוטופיות וקבע באופן אוטומטי את יחסי ההטמעה של oxygen 18; רשום את יחסי ההטמעה של oxygen 18 כתרומות יחסיות של מיני פפטיד איזוטופיים בודדים למעטפה האיזוטופית השלמה. סנן את רשימת ה-bins ובצע bin ללפחות שלושה ערכים ברוחב מסה של 100 PP m עבור כל ניסוי של סדרת זמנים.

חלץ את המסות המולקולריות עבור כל מיני הפפטידים שזוהו מקבצי נתוני ה-MS הנלווים. כעת, השתמש ב-X pacey find pep set עם סבילות לקבלת שגיאת מסה של 200 PPM. השווה את רשימת הסלים (bin list) לנתונים של תוצרי הפירוק הפרוטאוליטי שנחזו מרצף הפפטיד של הסובסטרט.

המשיכו ברכישת ספקטרי msms עבור כל ערכי המסה של תוצרי הפירוק שנחזו על ידי כלי ה-find pep ועבור ערכי bin שיש להם שילובים של oxygen 18. אספו נתוני MSMS של 50 יריות בתבנית אקראית לכל תת-ספקטרום עם עד 40 תת-ספקטרים לנקודה, וייצאו את קובצי ה-msms. לאחר מכן, ייצאו את קובצי נתוני ה-MSMS למערכת הניתוח לצורך זיהוי שיאים ורשימות שיאי MSMS המשויכות לנתוני bend MS המתאימים לזיהוי פפטידים.

הגדירו את פרמטרי החיפוש הבאים במנוע החיפוש mascot: ללא ספציפיות לאנזימים (no enzyme specificity), סובלנות מסה של 150 PPM עבור יון הפרקורסור (precursor ion) ו-0.2 Dalton עבור יוני הפרגמנט (fragment ion). בצעו חיפוש של רשימות ה-M-S-M-S-P מול מאגר הנתונים Swiss Pro. ניתן לתקף בנוסף את זיהויי הפפטידים באמצעות תוכנת data explorer, על ידי אישור דפוסי ההטמעה האופייניים של oxygen 18 לאורך יוני הפרגמנט עבור תרשימי זמן ספקטרליים.

ייצאו את קובצי נתוני ה-MS עבור כל נקודת זמן של התגובה מקובצי ה-ASCI של תוכנת ה-data explorer באמצעות מאקרו. לאחר מכן, ייבאו את הקבצים לתוכנה לניתוח נתונים וגרפיקה והציגו אותם כגרפי מפל (waterfall plots) כדי ליצור גרפים של התמזגות oxygen 18 עבור כל כיפוף. עבור תוצרי הפיצול של הפפטיד, חלצו את התרומות היחסיות של מיני איזוטופים של פפטידים בודדים לאורך כל נקודות הזמן של התגובה, ולאחר מכן פלטו אותם כנגד הזמן.

תרשימי זמן ספקטרליים, כגון זה, מציגים את הדינמיקה של תגובות פירוק פרוטאוליטי. ניסוי זה מנתח את הפירוק של הפפטיד הביואקטיבי endo and C על ידי האנזים endothelium converting enzyme one. סידור במבנה של מפל מים מציג את ספקטרי ה-MS של ניסויי מהלך הזמן כדי לנטר בו-זמנית את הפירוק של הסובסטרט ואת הופעתם של מוצרי ביניים ומוצרים סופיים.

תוצרי השבירה מזוהים באמצעות MSMS ומעטפת האיזוטופים המאופיינת בחתימות של שילוב oxygen 18. מנגנון תגובה זה של טריפסין מעיד על כך שפרוטאזות שורפות מתווכות שילוב של עד שני אטומי oxygen 18 לתוך תוצרי שבירה של פפטידים. בזרימת העבודה של סימון מבוסס פרוטאז, תגובת שבירת הקשר הפפטידי גורמת ליחס שילוב של oxygen 18 בודד של 50% עבור תוצרי שבירה של פפטידים שנוצרו acabado; פרוטאזות כמו טריפסין, הנקשרות מחדש לתוצרי התגובה, מקטליות באופן נוסף את שילובו של אטום oxygen 18 שני באמצעות תגובת חילוף חמצן קרבוקסילי.

במצב שיווי משקל, תגית ה-oxygen 18 מתחלקת ביחס של אחד לשניים לאחד במוצרים לא מתויגים, מתויגים בודדים ומתויגים כפולים. בזרימת העבודה של תיוג טרמינוסים פרוטאוליטיים לפני עיכול, לא מתרחשים שבירות של קשרי פפטיד. במקום זאת, ההטמעה של עד שני אטומי oxygen 18 מבוססת אך ורק על תגובת חילוף החמצן הקרבוקסיל.

לפיכך, שילוב של חמצן 18 מתרחש רק עם פרוטאזות שנקשרות מחדש לתוצרי הפיצול הפפטידיים שלהן. סימון בחמצן 18 המזורז על ידי חומצה מוביל לשילוב של שני אטומי חמצן 18 לכל קבוצת קרבוקסיל. במהלך ניסוי זה, ניתן למפות את הזזות המסה של כפולות של שני דלטון במעטפת האיזוטופית של angiotensin one באמצעות ספיגת אטומי חמצן 18.

על ידי שילוב של סימון OPE וספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה באופן רזולוציית-זמן, שיטת מסלול הזמן הפליאו (paleo time course) מאפשרת ניתוח דינמי של יצירת תוצרי פפטידים. ניתן להשתמש במערך זה כדי לייצר פפטידים מסומנים טופית ומיוצבים למחקרים פרוטאומיים כמותיים ואיכותיים, וכדי להעריך את הקינטיקה שבה נוצרים פפטידים פרוטופיים (Protopic peptides).

מהלך הזמן של Paleo נועד להעריך מסלולים פרוטאוליטיים בתנאים רלוונטיים פיזיולוגית. טכניקה זו סללה את הדרך לסקר האחרון שלנו של תהליכי ליזה במיקרו-סביבות של סרטן בבני אדם.