הזיקה של רטיבות פעילים Rho-GEFs שימוש GST-מתויג מוטנטי חלבון Rho (GST-RhoA (G17A)) מ lysates תא אפיתל

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לעקוב אחר הפעלה של RO, גורמי חליפה ספציפיים של G-D-P-G-T-P או gafs בתאים שהוצאו לתרבית, באמצעות שימוש בחלבון שילוב GST של מוטנט RO A בעל זיקה גבוהה ל-gs פעילים. הדבר מושג תחילה על ידי ייצור החלבון המוטנטי row המסומן ב-GST בחיידקים. לאחר מכן, מטהה את row A ה-GST המחובר לחרוזי ספוג.

לאחר מכן, נבחנים הטוהר והריכוז של חלבון ה-GST RO A באמצעות SDS page. לבסוף, מכינים ליזאט תאים ומבצעים בדיקת שיקוע GEF עם חלבון ה-GST RO A. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות שיקוע מוגבר של GS מופעל בתאים שעברו טיפול, באמצעות ניתוח western blot של החלבונים ששקעו עם נוגדן anti GF ספציפי וכמימות באמצעות דנסוסיטומטריה.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה למספר שאלות מרגשות בתחום ה-GTPS הגולמי, כגון כיצד מווסרגים גורמי חילוף G-D-P-G-T-P רבים באופן ספציפי לאות, וכיצד מתואשמת פעילותם? באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשרו בתחילה, מכיוון שהחלבון GST RO G 17 A אינו יציב יחסית ועשוי להתפרק במהלך ההכנה. חשוב לזכור לבצע את בדיקת השקיעה של GF במהירות ובעקביות. את הפרוצדורה זו יעגיל Pfizer Vahid, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי, לצורך טרנספורמציה של e coli.

העבר במהירות כמות של 25 µL של תאי DH5α kompetent למסבך קרח והוסף 1 µL של DNA של pX-row AG17A בריכוז של 25 עד 50 ng/µL. נער את המבחנה בטפיחות כדי לערבב והדגר על קרח למשך 30 דקות. בצע Heat shock לתאים בטמפרטורה של 42 °C למשך 45 שניות והחזר אותם לקרח למשך שתי דקות.

הוסיפו 900 µL של מצע SOC וגדלו למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור. בעזרת פיפטת פסטור סטרילית וכפופה, פזרו 50 עד 100 µL של החיידקים שעברו טרנספורמציה על מצע LB agar ו-persin שהוכן מראש. דגרו את הפתחית במצב זקוף באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות, ולאחר מכן הפכו אותה וגדלו למשך הלילה.

בחר מושבה מבודדת היטב של חיידקים שעברו טרנספורמציה והשתמש בה כדי להחדיר Inoculate למחזור של 50 milliliters של LB עם ampicillin. גדל למשך הלילה בטמפרטורה של 37 degrees SIUs עם ערבוב. כאשר התרבית תגיע לצפיפות מלאה, דלל אותה עם 450 milliliters של LB ampicillin וגדל אותה למשך 30 דקות נוספות. בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, השרה על החיידקים לייצר row protein על ידי הוספת 500 microliters של 100 millimolar IPTG לתרבית של 500 milliliter.

הפחית את הטמפרטורה ל-22 עד 24 °C והגדל למשך כ-16 שעות. סבב את התרבית ב-3,600 ×g למשך 10 דקות ב-4 °C. הקפא את המשקעים למשך שעה אחת לפחות, או רצוי למשך לילה, ב-80- °C.

לאחר הכנת 200 מיליליטר של באפר ליזיס כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב, הכינו "באפר ליזיס פלוס" על ידי תוספת של 1mM DTT, 1mM PMSF וטבלית אחת של מעכב פרוטאז (protease inhibitor) ל-10 מיליליטר של הבאפר, כאשר העבודה מתבצעת על קרח. הוסיפו 10 מיליליטר של באפר ליזיס פלוס לכדורי ה-Thor וערבבו היטב באמצעות פיפטינג ווורטקס. בצעו סוניקציה לתמיחה על קרח למשך דקה אחת בהגדרה 4 עם 50% pulse.

סובבו את הליזט שעבר סוניקציה ב-15,000 עד 20,000 ×g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C והעבירו את הסוניקציה המזוכללת למבחנה סטרילית עם פקק בנפח 15 מיליליטר. הכינו את חרוזי ה-glutathione sphero על ידי ערבוב עדין של תמיסת ה-slurry בריכוז 75% והעברה של 335 µL למבחנה בנפח 15 מיליליטר באמצעות טיפ רחב (wide bore tip). הוסיפו 10 מיליליטר של PBS קר וסובב אותו ב-500 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4°C.

שפכו את הנוזל העליון. הוסיפו מיליליטר אחד של lysis buffer plus לחרוזים וסובבו שוב במערכת הצנטריפוגה. שפכו שוב את הנוזל העליון והוסיפו lysis buffer.

בנוסף, כדי להכין תמיסת חרוזיים (slurry) בריכוז 50%, ערבבו 50 µL פעמיים של תמיסת חרוזיים מאוזנת עם העליון (supernatant) שהוכן. סובבו בטמפרטורה של 4 °C למשך 45 דקות. הכינו HBS plus על ידי תוספת של 5 mM מגנזיום כלוריד ו-1 mM DTT ל-100 mL של בופר HBS; סבבו במאיץ (centrifuge) את העליון ואת החרוזיים ב-500 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C.

שפכו את הנוזל העליון ושטפו את החרוזים פעמיים עם 10 milliliters של lysis buffer plus ופעמיים עם 10 milliliters של HBS plus. לאחר השטיפה האחרונה, הכינו תרחיף של 50% על ידי השהיית החרוזים ב-HBS plus המועשר במעכב פרוטאז. דללו 10 microliters מההכנה הסופית של החרוזים עם two times lam ly sample buffer המכיל beamr cap two ethanol.

לאחר מכן, הכינו שלוש דגימות סטנדרט של BSA על ידי ערבוב של 10 µL, 5 µL ו-2.5 µL של תמיסת סטוק של BSA בריכוז 2 mg/mL עם 10 µL של lammy buffer.

הרתיחו את הדגימות למשך חמש דקות, לאחר מכן סבבו אותן קצרע (spin) והריצו את כולן עם סרגל משקל מולקולרי על ג'ל פוליאקרילמיד SDS בריכוז 10%. לאחר הצביעה ודה-סטיינינג (desaining) של הג'ל, העריכו את שורת ה-GST A G 17 A באמצעות סטנדרטים של BSA כנקודת ייחוס. העבירו נפח שווה של חרוזיs המכילים כ-10 עד 15 µg של חלבון למבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL. כדי להכין את בדיגת ה-GF pull down, גדלו את התאים שבהם תשתמשו עד להגעה לקונפלואנס (confluence) בצלחות בקוטר 10 cm, והרעילו אותם מסרום למשך שלוש שעות לפחות לפני הבדיקה.

ממש לפני תחילת הבדיקה, הכין תמיסת ליזיס פלוס עם מעכבי פרוטאז על קרח. הסר את מצע התרבית מהצלחות ושטוף ב-HBS קר מאוד.

הסיר את כל ה-HBS והוסף 700 microliters של lysis Buffer plus לכל צלחון. התז את הפלטות כדי לכסות את כל השטחים.

לאחר מכן, גרדו ואספו את הליזאטים למבחנות של 1.5 מיליליטר ממוספרות. צנטריפוגו ב-15,000 ×g למשך דקה אחת בטמפרטורה של 4°C. שמרו את הסופרנאטנאט עבור הבדיקה; אם מספר התאים היה שווה בכל צלחת, הסירו 30 µL מכל סופרנאטנאט וערבבו עם 30 µL של בופר לדגימות (sample buffer) במכפלה של 2X עם חומר מחזר.

לאחר מכן הרתיחו והניחו על קרח. הוסיפו את שאר הנוזלים העליונים (supernatants) למשקיות של חרוזי GST row a G 17 A וסובבו במשך 45 דקות בטמפרטורה של 4 °C. סובבו את החרוצים בצנטריפוגה במהירות של 6,800 ×g למשך 10 שניות בטמפרטורה של 4 °C.

שפכו את הנוזל העליון (supernatant) ושטפו את החרוזיים שלוש פעמים עם בופר ליזיס. בעזרת מזרק בנפח 1 CC המצויד במחט במידה 30, הסירו לחלוטין את השטיפה האחרונה והוסיפו 20 µL של בופר דגימה לליזיס מרחף (reducing lysis sample buffer) בריכוז פי 2. הרתיחו את הדגימות למשך חמש דקות, סובבו בצנטריפוגה להשקעת החרוזיים, והריצו את ליזאטי התאים הכוללים ואת דגימות החלבון המשקועות על ג'ל SDS-PAGE באחוזים המתאימים לגודל ה-GF הנלמד.

לבסוף, בצעו western blotting כדי לזהות את ה-GFA הרלוונטי בבדיקת GF מוצלחת. זיהוי של הפעלה של גורם החילוף GFH one מוצג כאן. חלבון row A G 17 A לוכד חלק מה-GFH one מליסיות תאי הבקרה, מה שמעיד על כך של-GFH one יש פעילות בסיסית.

עם זאת, כמות המשקע עלתה בתאים שטופלו בציטוקין הדלקתי tumor necrosis factor alpha, בדומה להנחה ש-TNF alpha מפעיל את G FH one. באופן חשוב, הליזט התאי הכולל מראה כמויות דומות של gfh one בדגימה הבקרה ובדגימה המטופלת, מה שמעיד כי הטיפול לא שינה את רמות ה-G FH one וכי כמות החומר שהוכנסה לבדיקה הייתה שווה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשמור על חלבון ה-GSE RO G 17 A ועל ה-CELLIS eights על קרח.

בצעו את בדיקת ה-GF במהירות ובעקביות, והשתמשו בביקורות חיוביות הולמות שיאפשרו ביטול תוצאות ופתרון בעיות.