Nafion הידרופובי מלח, שונה עבור Immobilization האנזים ייצוב

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לסנתז פולימר למסעים תאיים, לקיבוע ואילוז של אנזימים. כדי להשיג זאת, ראשית, ערבבו את ת сусפנסיית ה-nafion עם מלח Ammonium bromide, ובצעו vortex לתערובת כדי להחליף את הצורה הפרוטונית של ה-nafion במלחים של אמוניום. השלב השני הוא ייבוש הפולימר שנוצר על ידי מזיגת התערובת לכלי מעבדה (weigh boat) והמתנה להתאיידות הממיסים.

בשלב הבא, השרו את הפולימר במים דאיוניים למשך 12 עד 24 שעות כדי להסיר עודפי מלח. לאחר הוצאת המלח, שטפו את הפולימר במים ולאחר מכן אפשרו לפולימר להתייבש לחלוטין על ידי התאייה. השלב הסופי הוא להעביר את הפולימר לבקבוקון נקי ולערבב אותו מחדש בממס לשימוש בקיבוע אנזימים. בסופו של דבר, פולימר זה לקיבוע אנזימים משמש לשיפור היציבות של אנזימים בבדיקות פעילות.

באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בשיטה זו יתקשו, כיוון שההליך נראה פשוט ביותר, אך הליך הייבוש הוא קריטי ליצירת פולימר פונקציונלי. הדגמת ההליך תבוצע על ידי סטודנט לתואר שני במעבדתי. כדי להתחיל את הליך שינוי ה-nafion באמצעות מלחים של Nerium ammonium, יש למדוד כמות של עודף מולרי פי שלושה ביחס לקבוצות ה-sul acid בפולימר ה-nafion של מלח ה-alk ammonium bromide.

העבירו את מלח ה-alk ammonium bromide לבקבוק זכוכית בעוצמה. נערו בקבוק של תמיסת nafion בריכוז 5% weight per volume למשך כ-30 שניות כדי להבטיח שה-neon סuspended באופן אחיד בתמיסה. שאיבו באמצעות פיפט שני מיליליטרים של ה-nafion לאחר השספנסיה והוסיפו אותם לבקבוק הזכוכית המכיל את מלח ה-AGU ammonium bromide.

ערבבו את הבקבוק במערבל וורטקס (vortex) במהירות של 900 RPM למשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן, שפכו את התמיסה הצמיגית לתוך מגש שקילה מפלסטיק והשתמשו בפיפטה כדי להעביר כל שארית של תמיסה מהבקבוק אל מגש השקילה. בדוגמה זו, כלי השקילה מכוסה באופן חלקי ומושאר על שולחן המעבדה כדי לאפשר לממיסים להתאדות לחלוטין ממגש השקילה בקצב התאדות שארך יותר משישה שעות.

אידוי מלא של כל הממס בקצב האידוי המתאים אמור להשאיר שכבה שקופה בצבע צהוב או חום בתחתית מגש השקילה, כפי שמוצג כאן. אם הממס מתאדה מהר מדי, ייווצר חומר קשרי או גבישי במקום שכבה שקופה, דבר המעיד על כך שמבנה המיסלה של הפולימר נהרס. אם אידוי הממס איטי מדי, או אם מלח האמוניום מגיב זמן רב מדי וסופג כמות גדולה מדי של אדי מים, ייווצר ג'ל כתום דביק או חומר גבישי לבן.

בכל אחד מהמקרים, יש להתחיל את הפרוצדורה מחדש. לאחר שכל הממיס התאדה בקצב האידוי המתאים, מלאו את מגש השקילה ב-10 עד 20 milliliters של מים דאיוניים בדרגת 18 mega ohm centimeter עד לכיסוי מלא, והשרו למשך 12 עד 24 שעות כדי להסיר עודפי מלחים של alk ammonium bromide ו-HBR. לאחר 12 עד 24 שעות, שאבו את המים באמצעות פיפט והוסיפו מספיק מים דאיוניים כדי למלא את המגש. הקפידו תמיד לשאוב את הנוזלים הרחק מסרט הפולימר כדי למנוע אובדן של חלקים ממנו.

שטפו סה"כ שלוש פעמים לאחר השטיפות. השאירו את מגש השקילה ללא כיסוי עד שהפולימר יתייבש לחלוטין. כאשר הוא יבש לחלוטין, הפולימר אמור להיות קרום פלסטיק שקוף ושביר למדי.

לעומת זאת, לפולימרים שלא יובשו כראוי יהיה מראה שונה מאוד לאחר חילוץ מלח, כפי שמוצג כאן. הסירו בזהירות באמצעות שפכטל את הסרט היבש מהמשטח השוקל והעבירו אותו לבקבוק זכוכית נקי. הוסיפו two milliliters של ethanol ושלושה כדורי ערבוב קרמיים, ובצעו vortex במשך ארבע שעות או עד שהסרט הפולימרי יתססן מחדש לחלוטין.

תמיסת ה-nathe המודגשת ב-alk ammonium מוכנה כעת לשימוש עבור קיבוּע אנזימים. אם האנזים המיועד לקיבוּע הוא אנזים יבש, שקלו מיליגרם אחד של האנזים לתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר והוסיפו מיליליטר אחד של בופר פוספאט בריכוז 100 millimolar וב-pH 7 כדי להכין תמיסת אנזים בריכוז 1 mg/mL. העבירו 120 µL מתמיסת האנזים בריכוז 1 mg/mL למבחנה חדשה.

הוסף 60 µL של תמיסת nafion modified ammonium ALK וערבב במכשיר vortex למשך 10 שניות. יש לשמור על יחס של שניים לאחד בין האנזים לתמיסת הפולימר במידה ויש צורך להגדיל את כמות התערובת למספר רב של חזרות. לבסוף, טפטף באמצעות פיפט 60 µL של תמיסת האנזים-פולימר לתחתית כל אחת משלוש קוביות (cuvettes) נפרדות בגודל של 1 סמ"ר, והשאר אותן להתייבש במהלך הלילה.

ניתן להעריך את יציבות האנזים בתוך קרום הפולימר באמצעות בדיקות פעילות אנזימטית כפי שהודגם. כדי להתחיל בבדיקה זו, יש להוסיף את הרכיבים הבאים לתוך ה-vet co שהוטבע עם פולימר nafion המודגש ואנזים dehydrogenase תלוי NAD: 1.3 milliliters של 50 millimolar sodium pyrophosphate, 1.5 milliliters של nicotinamide adenine dinucleotide או NAD בריכוז 15 millimolar שהוכן זה עתה, ו-0.1 milliliters של מים.

הניחו את ה-vete בספקטרופוטומטר UV-visible המכוון לאורך גל של 340 nanometers והגדירו נקודת אפס. לספקטרומטר הוסיפו 0.1 milliliters של אתנול לתוך ה-vete וערבבו את הריאגנטים על ידי פיפוט עדין של התמיסה למעלה ולמטה חמש פעמים; עבור דגימת ביקורת (blank) השתמשו ב-0.1 milliliters של מים נוספים במקום ה-0.1 milliliters של אתנול. חמש דקות לאחר הוספת הריאגנטים ל-vete, רשמו את הבליעה (absorbance) באורך גל של 340 nanometers.

רשמו שוב את הבליעה 20 דקות לאחר הוספת הריאגנטים ל-qve; שתי נקודות נתונים אלו יסורסמו כדי לקבל שיפוע שניתן להשתמש בו לחישוב הפעילות, לצורך בדיקת הפעילות האנזימטית הספציפית של pq שסומך. דהידרוגנאזות תלויות-PQQ; פפטי את הריאגנטים הללו לתוך ה-qve שיוצק יחד עם פולימר nafion משופר ודהידרוגנאז תלויה-PQQ. 1.5 milliliters של נתרן פוספט ו-200 microliters של 600 micromolar pH methyls sulfate או PMS.

מקם את ה-vete בספקטרופוטומטר UV-visible המכוון לאורך גל של 600 ננומטר ובצע איפוס. הוסף לספקטרומטר 100 מיקרוליטר של תערובת המורכבת מ-700 מיקרוליטר של six chloro endemol או DCIP ו-200 מיקרוליטר של הסובסטרט הרלוונטי. ערבב את הרכיבים על ידי שאיבה והזרקה עדינה של התמיסה בעזרת פפית חמש פעמים עבור דגימת בקרה (blank).

השתמש ב-200 µL מים במקום בתסבסב הרלוונטי. חמש דקות לאחר הוספת הרכיבים, רשום את הבליעה באורך גל של 600 nm.

יש למדוד שוב את הבליעה 20 דקות לאחר הוספת הרכיבים לתחילת הבדיקה. יש להוסיף ל-Q VET שיוצק יחד עם פולימר nafion משוער ו-glucose oxidase שני מיליליטר של תמיסה המכילה את הרכיבים הבאים: 0.2 molar para hydroxy benzoic acid, 0.02% Sodium azide, 128 units של peroxidase, 0.3 millimolar 4-aminophenazone, 1 molar potassium phosphate ו-50 millimolars של glucose.

הכינו את התמיסה על ידי פיפוט למעלה ולמטה חמש פעמים. הניחו את ה-Q vet בספקטרופוטומטר UV-visible המכוון לאורך גל של 510 nanometers. חמש דקות לאחר הוספת הריאגנטים ל-qve.

מדדו את הבליעה באורך גל של 510 nanometers. לאחר מכן, מדדו שוב את הבליעה 20 דקות לאחר הוספת הרכיבים. טבלה זו מציגה את תוצאות הבדיקה של פעילות glucose dehydrogenase התלויה ב-NAD המקובעת על פולימרי nafion שונים שעברו מודיפיקציה.

נצפה כי ל-glucose dehydrogenase תלוי-NAD המטמע היה פעילות סגולית נמוכה יותר מאשר לאנזים ולתמיסת הבאפר. זאת מכיוון שקרומי פולימר מפחיתים את ההסעה של מולקולות גדולות, ואף על פי שגלוקוז, הסובסטרט עבור הבדיקה, הוא קטן, הקו-אנזים NAD צריך לדפף לתוך הקרומ וממנו. עבור dehydrogenase תלוי-NAD, מגבלת ההסעה הנובעת מהטמעה בפולימר מפחיתה את הפעילות האנזיםטית הנצפית.

הטבלה הבאה מציגה תוצאות בדיקה של פעילות גלוקוז דהידרוגנאז תלויית PQQ המקובעת על פולימרים של nafion משופרים שנבחרו. חשוב לציין כאן את הפעילות הגבוהה יותר של האנזימים המקובעים על מרבית שכבות ה-nafion בהשוואה לאנזימים בתמיסת בופר. מכיוון שגלוקוז דהידרוגנאז תלויית PQQ היא חלבון הקשור לממברנה, ה-nafion המשופר ההידרופובי מספק סביבה הדומית יותר לממברנה מאשר בופר לצורך ייצוב גלוקוז דהידרוגנאז תלויית PQQ פעילה, ובכך מגביר את פעילות האנזים.

לבסוף, מוצגות בטבלה זו תוצאות בדיקה מייצגות של הפעילות הסגולית של גלוקוז אוקסידאז. בטבלה מופיעים פולימרים של nafion שעברו שינוי ונבחרו לה immobilization. הבדיקות האנזימתיות עבור כל אחד מהפולימרים עם כל אחד משלושת האנזימים מראות כי המגמות בפעילות הסגולית היחסית בהשוואה לאנזים ולתמיסה הן פונקציה של מערכת האנזימים.

כתוצאה מכך, יש לבצע אופטימיזציה לסוג הפולימר המדויק הדרוש עבור כל אנזימ. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי שלב הייבוש הוא קריטי לפרוטוקול ספציפי זה.