Name: ננו פאם: לוקליזציה חלבון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה מופעלת ומיקרוסקופי אלקטרונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: למד לוקליזציה של חלבונים במיקרוגרפיות אלקטרוניות באמצעות שיטת ננו פאם. השיטה משתמשת בחלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית בנמטודות טרנסגניות לדיוק מרבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים הרלד הס ואריק Betzig עבור גישה למיקרוסקופ PALM לניסויי הוכחה של עיקרון, ריצ&#39;רד פעטער לשיתוף פרוטוקולי קיבעון, ריאגנטים ועידוד. אנו מודים למיכאל דוידסון, ג&#39;רלדין סייד, סטפן Eimer, רודולף Leube, קית&#39; Nehrke, כריסטיאן Frøkjr-ג&#39;נסן, אוד עדת נגואמה ומארק Hammarlund למבני DNA. כמו כן, אנו מודים Carl Zeiss Inc למתן גישה לZeiss PAL-M, גרסת הבטא של מיקרוסקופ Zeiss ELYRA P.1 PALM.

<ol><li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 148, 45-58 (2000).</li>
<li>Oberti, D., Kirschmann, M. A., Hahnloser, R. H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy+of+densely+labeled+projection+neurons+using+neural+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy of densely labeled projection neurons using neural tracers.</a> Front. Neuroanat. 4, 24(2010).</li>
<li>Bishop, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+branding+efficiently+correlates+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Near-infrared branding efficiently correlates light and electron microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 568-570 (2011).</li>
<li>Sims, P. A., Hardin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-integrated+transmission+electron+microscopy+images%3A+integrating+fluorescence+microscopy+with+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-integrated transmission electron microscopy images: integrating fluorescence microscopy with transmission electron microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 369, 291-308 (2007).</li>
<li>Micheva, K., Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+tomography%3A+a+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55, 25-36 (2007).</li>
<li>Nixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+method+for+cryofixation+and+correlative+light%2C+electron+microscopy+and+tomography+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos.</a> Traffic. 10, 131-136 (2009).</li>
<li>Kukulski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+fluorescence+and+3D+electron+microscopy+with+high+sensitivity+and+spatial+precision%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision.</a> J. Cell Biol. 192, 111-119 (2011).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Weibull, C., Christiansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+proteins+and+membrane+lipids+during+low+temperature+embedding+of+biological+material+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of biological material for electron microscopy.</a> J. Microsc. 142, 79-86 (1986).</li>
<li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li>
<li>F lling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+nanoscopy+by+ground-state+depletion+and+single-molecule+return%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return.</a> Nat. Methods. 5, 943-945 (2008).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li>
<li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nature Methods. 7, 717-719 (2010).</li>
<li>Dertinger, T., Colyer, R., Iyer, G., Weiss, S., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+background-free%2C+3D+super-resolution+optical+fluctuation+imaging+%28SOFI%29%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Fast, background-free, 3D super-resolution optical fluctuation imaging (SOFI).</a> PNAS. 106, 22287-22292 (2009).</li>
<li>Burnette, D. T., Sengupta, P., Dai, Y., Lippincott-Schwartz, J., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleaching%2Fblinking+assisted+localization+microscopy+for+superresolution+imaging+using+standard+fluorescent+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Bleaching/blinking assisted localization microscopy for superresolution imaging using standard fluorescent molecules.</a> PNAS. , (2011).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li>
</ol>

הייצור והגישה חופשיה למאמר זה הוא בחסות Carl Zeiss, Inc

כאן אנו מתארים כיצד לשמר חלבוני ניאון בפלסטיק, למקם את חלבוני ניאון בחלקים, ותמונת ultrastructure באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. חלבונים היו נקודות מתחת לגבול ההשתברות באמצעות מיקרוסקופ PALM לרזולוצית ננומטר. כדי להתאים פרוטוקול זה לדגימות מסוימות, את הפרמטרים הבאים צריכים להיחשב: fluorophore, כימות, ויישור. הבחירה של חלבון פלואורסצנטי או fluorophore האורגני תלויה ביישום ומערכת המודל. בדקנו מגוון רחב של חלבוני ניאון, כולל EGFP, YFP, סיטרין, mEosFP, mEos2, tdEos, mOrange, רשות mCherry, ו12 Dendra. שימור פלואורסצנטי מכל fluorophore היה דומה, מה שמרמז שכל חלבוני הניאון יכולים להישמר בשיטה שתוארה. גם אנחנו בחרנו tdEos כי זה בא לידי ביטוי בג elegans, חלבונים נשארו פונקציונליים כאשר התמזגו לtdEos, ובגללהמאפייני תמונה, הפעלה היו אופטימליים למיקרוסקופיה PALM. עם זאת, ביטוי צבירה או כושל של tdEos נצפה מדי פעם 12. בהתאם ליישום, fluorophore שונה עשוי להיות מתאים יותר. במקרים רבים, אין זה הכרחי להשתמש בחלבון פלואורסצנטי צילום פעיל. מיקרוסקופ אלקטרוני פלואורסצנטי פשוט מתאם אינו דורש חלבון פלואורסצנטי צילום פעיל. ניתן להשתמש GFP או צבעים אורגניים לפלואורסצנטי תמונה מחלבונים מתויגים בסעיפים לעיל לגבול ההשתברות. לדוגמה, אחד יכול תמונת האקסון בneuropil באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולתאם את אות פלואורסצנטי עם האקסון בפרט במיקרוסקופ אלקטרונים על ידי הדמיה את הקרינה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. טכניקות ברזולוצית סופר אחרים, כגון מיקרוסקופיה מגורה פליטת דלדול (STED) 12, מיקרוסקופיה דלדול מדינת הקרקע אחרי חזרת מולקולה בודדה (GSDIM) 13, ומיקרוסקופיה המובנהית תאורה (SIM) 14, אינה דורשת חלבוני ניאון צילום הופעל. יתר על כן, שיטות הדמיה ברזולוצית הסופר שמשתמשות בצבעים אורגניים 9,15,16 או רכוש המהותי של בדיקות ניאון 17 הן ברצון ישימות. בכף היד, את מספר המולקולות ניתן לכמת משום שקרינה של כל מולקולה היא מופרד מרחב ובזמן. עם זאת, כימות עשוי להיות מטעה מארבע סיבות: חמצון, undercounting, overcounting, וביטוי יתר. ראשית, חלק קטן מן חלבוני הניאון ניתן מפוגל או מתחמצן במהלך עיבוד מדגם 5,12. למרות ~ 90% של אות פלואורסצנציה נשמרו באמצעות קיבוע והטבעה בפרוטוקול שלנו, חמצון של החלבון פלואורסצנטי עלול להתרחש לאחר הדגימה כבר מחולקת והמשטח נחשף לחמצן. שנית, ההפעלה של חלבוני צילום activatable היא אקראית, ובכך מולקולות מרובות יכולות להיותהופעל במקום מוגבל עקיף ניתן 8. קרינה מן המולקולות המרובות תופיע כנקודה אחת, ולכן המספר הכולל של חלבונים יהיה undercounted. שלישית, בעיה דומה יכולה להוביל לovercounting. בכף יד, כל חלבון פלואורסצנטי הוא מקומי ולאחר מכן &quot;נמחק&quot; על ידי לבן. עם זאת, חלבוני ניאון יכולים לחזור מהמדינה החשוכה מבלי להיות לצמיתות מולבנות 18. מולקולות כאלה ואז תיספרנה מספר פעמים. רביעי, חלבונים מתויגים מבוטאים כמושתלים ולעתים קרובות להציג בעותקים רבים, אשר יכול להוביל לביטוי יתר. לכן, כימות מPALM ניתן להשתמש כדי להעריך אבל לא בדיוק לקבוע את מספר המולקולות במקום מסוים. היישור של תמונת PALM עם מיקרוסקופ אלקטרונים גם יכול להיות מאתגר בגלל השוני ברזולוציה מיקרוסקופית ועיוות אור ואלקטרונים הנגרמים על ידי קרן האלקטרונים. חלקיקי זהב משמשים כחוזקה localized סמני fiducial בmicrographs אלקטרונים. עם זאת, fluoresecence מחלקיקי זהב הוא לא צילום שהופעל, ומופיע ככתם גדול העקיף מוגבל. לכן, המיקום של תמונת פלואורסצנטי על מיקרוסקופ אלקטרונים הוא הערכה בלבד. עיוותים יכולות גם לנבוע מאינטראקציות של אלקטרונים עם סעיף הפלסטיק. רפים אקריליים כגון GMA הם פחות יציבים תחת אלומת האלקטרונים, ואת הממדים של הפלסטיק ניתן לשנות. בנסיבות אלה, יישור פלואורסצנטי עם ultrastructure עשויה לדרוש שינוי הבלתי ליניארי של סמני fiducial.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שמו של המגיב או ציוד </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> מקפיא בלחץ גבוה </td><td> אברה </td><td> HPM 010 </td><td> EMPact וHPM 100 מיקה או hpf-01 מWohlwend יכולים לשמש גם. </td></tr><tr><td> יחידת הקפאת החלפה אוטומטית </td><td> ליקה </td><td> AFS 2 </td><td> 1 AFS יכול לשמש גם. </td></tr><tr><td> Zeiss PALM </td><td> Zeiss </td><td> ELYRA P.1 </td><td> ניקון וVutara גם למכור מיקרוסקופי PALM מסחריים. </td></tr><tr><td> סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> פיי </td><td> נובה ננו </td><td> מיקרוסקופי SEM אחרים ברזולוציה גבוהה ניתן להשתמש. </td></tr><tr><td> אצטון </td><td> EMS </td><td> RT10016 </td><td></td></tr><tr><td> אתנול </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> 459844-1L </td><td></td></tr><tr><td> אוסמיום tetroxide </td><td> EMS </td><td> RT19134 </td><td></td></tr><tr><td> פרמנגנט האשלגן </td><td> EMS </td><td> RT20200 </td><td></td></tr><tr><td> אלבומין מסרום שור </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A3059-50 </td><td></td></tr><tr><td> תצטט Uranyl </td><td> Polysciences </td><td> 21447-25 </td><td> ה-pH של יצטט uranyl מחברה זו היא מעט גבוהה יותר. </td></tr><tr><td> methacrylate גליקול (GMA) </td><td> SPI </td><td> 02630-AA </td><td> חומצה נמוכה, כיתת TEM. </td></tr><tr><td> N, N-דימתיל-p-toluidine </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> D9912 </td><td></td></tr><tr><td> בקבוקוני cryo </td><td> Nalgene </td><td> 5000-0020 </td><td></td></tr><tr><td> בקבוקוני זכוכית </td><td> EMS </td><td> 72632 </td><td></td></tr><tr><td> סרט Aclar </td><td> EMS </td><td> 50425-10 </td><td></td></tr><tr><td> BEEM כמוסה </td><td> EBSciences </td><td> TC </td><td> פוליפרופילן </td></tr><tr><td> 3/8 &quot;אגרופי DISC </td><td> טד פלה </td><td> 54741 </td><td></td></tr><tr><td> חלקיקי זהב </td><td> microspheres-nanospheres.com </td><td> 790122-010 </td><td> לבקש פתרון מרוכז 2x </td></tr></tbody></table>

ננו פאם: לוקליזציה חלבון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה מופעלת ומיקרוסקופי אלקטרונים

Nano-fEM: Protein Localization Using Photo-activated Localization Microscopy and Electron Microscopy

מיפוי החלוקה של חלבונים חיוני להבנת תפקודם של חלבונים בתא. מיקרוסקופ פלואורסצנטי נעשה שימוש נרחב ללוקליזציה חלבון, אך הקשר subcellular הוא לעתים קרובות חסר בתמונות פלואורסצנציה. מיקרוסקופיה חיסונית אלקטרון, לעומת זאת, יכולה למקם חלבונים, אבל הטכניקה היא מוגבלת על ידי חוסר נוגדנים תואמים, שימור לקוי של מורפולוגיה וכי רוב אנטיגנים אינם חשופים על פני שטח הדגימה. גישות המצטרפות יכולות לרכוש את תמונת פלואורסצנטי מכל תא הראשון, או מחיסוני פלואורסצנטי או חלבונים מתויגים גנטי. אז המדגם קבוע ומשובץ למיקרוסקופ אלקטרונים, ואת התמונות מתואמות 1-3. עם זאת, תמונת פלואורסצנטי הרזולוציה נמוכה והמחסור בסמני fiducial ימנעו לוקליזציה המדויקת של חלבונים. לחלופין, דימות פלואורסצנטי יכולה להיעשות לאחר שימור הדגימה בפלסטיק. בתוךגישה זו, היא הבלוק נותח, ותמונות פלואורסצנציה וmicrographs אלקטרונים של אותו הסעיף, מתואמות 4-7. עם זאת, גבול השתברות אור בתמונת קורלציה מטשטש את המיקומים של מולקולות בודדות, ואת הקרינה לעתים קרובות משתרעת מעבר לגבול של התא. מיקרוסקופ אלקטרוני פלואורסצנטי ננו רזולוציה (ננו פאם) נועד למקם חלבונים בקנה מידת ננו ידי הדמיה את אותם קטעים באמצעות מיקרוסקופ תמונה הופעל לוקליזציה (PALM) ומיקרוסקופ אלקטרונים. PALM מתגבר על גבול ההשתברות ידי חלבוני ניאון בודדים הדמיה ולאחר מכן מיפוי centroid של כל 8-10 ספוט ניאון. אנחנו נתווה את טכניקת ננו Fem בחמש שלבים. ראשית, המדגם קבוע ומוטבע באמצעות תנאים המשמרים את הקרינה של חלבונים מתויגים. שנית, את אובניים השרף הוא מחולק למקטעי Ultrathin (70-80 ננומטר) שהם רכוביםעל מכסה זכוכית. שלישית, פלואורסצנטי הוא צלם בקטעים אלה באמצעות מיקרוסקופ PALM Zeiss. רביעית, מבנים צפופים אלקטרונים הם צלמו באותם סעיפים אלה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורקים. החמישי, micrographs הקרינה ואלקטרונים מיושרים באמצעות חלקיקי זהב כסמני fiducial. לסיכום, לוקליזציה subcellular של חלבונים מתויגים fluorescently ניתן לקבוע ברזולוצית ננומטר כבשבוע.

אנו מתארים שיטה לאיתור חלבונים מתויגים fluorescently בmicrographs אלקטרונים. פלואורסצנטי הוא מקומי הראשון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה המופעל על חלקי Ultrathin. תמונות אלה אז מיושר לmicrographs אלקטרונים של אותו הסעיף.

מיפוי פיזורם של חלבונים חיוני להבנת תפקודם של חלבונים בתא. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית נמצאת בשימוש נרחב עבור...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לאתר חלבונים במיקרוגרפים אלקטרוניים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ואלקטרונית מקושרת. שיטה זו, הידועה כ-nano FEM, משמשת לאיתור חלבונים ב-C. elegans. ראשית, תולעת טרנסגנית המבטאת histone TdTomato מוטמעת בפלסטיק ונחתכת לפרוסות.כל חתך נדגם הן באמצעות מיקרוסקופיית לוקליזציה מופעלת-פוטונית (PALM) והן באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת. שתי התמונות המיקרוסקופיות עבור כל חתך מיושרות באמצעות סימני ייחוס (fiducial markers) בתוכנת Photoshop. התמונה הקורלטיבית מראה את הלוקליזציה של מולקולות היסטון בגרעין.אם כן, היתרון המרכזי של הטכניקה שנתאר היום הוא שבמקום להשתמש ב-immuno EM, אנו משתמשים בחלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית, כך שכל חלבון מקושר לחלבון פלואורסצנטי. בעבודה עם immuno EM, נוגדנים רבים אינם יכולים להגיב עם פלסטיק. הדבר פשוט אינו תואם, ואם הוא תואם, הנוגדנים אינם מסוגלים לחדור עמוק לתוך החתך שבו נמצאים האנטיגנים.באמצעות שימוש בחלבונים פלואורסצנטיים, כל חלבון מסומן בفلואורופור. היום, shige wbi ידגים טכניקה זו. הפרוצדורה הבאה תוצג באמצעות נמטודות טרנסגניות המבטאות היסטונים המסומנים בחלבון הפלואורסצנטי TDE os.להדגמה זו, נשתמש בחומר קריו-פרוטקטור, אך ניתן להשתמש גם ב-20% BSA להקפאת sea elegance. שעה לפני תהליך ההחלפה בהקפאה (freeze substitution), מלאו את מכשיר ה-freeze substitution האוטומטי או מכשיר FS בחנקן נוזלי. כמו כן, הכינו מראש את המקבעים הדרושים בהתאם להוראות במסמך המצורף, אחסנו את המקבעים באליקוטיים של 1 mL בתוך מבחנות קריו, והניחו אותם בחנקן נוזלי עד למועד השימוש.השתמשו במברשת צבע כדי לאסוף בעלי חיים משטח גידול של חיידקים והעבירו אותם למנשאת דגימות של 100 מיקרון. מלאו את הכוס מעט מעבר לקו המילוי כדי להבטיח שאין בתוכה בועות אוויר. לאחר מכן, הניחו את כוס הדגימה בזרוע של מקפיא בלחץ גבוה כדי להקפיא אותה. מיד לאחר מכן, העבירו את הדגימה לאמבט חנקן נוזלי הסמוך לתא ההקפאה.בשלב הבא, העבירו את הדגימה באמצעות פיפטה ופינצטה אל מבחנה לקריו המכילה חומרי קיבוע. ודאו שהדגימה נשארת בתוך החנקן הנוזלי בכל עת. חזרו על תהליך זה עבור כל דגימה, ולאחר מכן העבירו את כל מבחנות הקריו ליחידת FS.לאחר שכל מבחנות הקריו (cryo vials) הוצבו ביחידת ה-FS, הפעל את התוכנית. פרוטוקול ההקפאה והעיבוד מוצג בדיאגרמה זו. במהלך הדגירה הראשונית ב-90°C-, הקרח הזכוכיתי מוחלף במקבע באצטון.לאחר מכן, עם עליית טמפרטורת הדגימה, המקבע באצטון הנוזלי יוצר קשרי צילוב בדגימה כדי לשמר את המבנה. כאשר הטמפרטורה ביחידת ה-FS מגיעה ל-60°C-, הניחו מבחנות סינטילציה המכילות 20 milliliters של 95%acetone בתוך ה-FS לקירורן. לאחר מכן, כאשר הטמפרטורה מגיעה ל-50°C-, השתמשו בפיפט פסטור עם טיפ P 200 כדי להסיר את המקבע ולהוסיף כ-1 milliliter של 95%acetone שקולל מראש לכל דגימה של Bile.חזור על תהליך זה מדי 20 דקות במשך שעתיים. כמו כן, במהלך הדגירה ב-50- °C, הנח מבחנת סינטילציה המכילה 20 milliliters של 0.1%urinal acetate ב-95%acetone בתוך תא ה-FS כדי לקירר אותה מראש ל-50- °C. לאחר מכן, לאחר שטיפת ה-acetone האחרונה, הוסף כ-one milliliter של תמיסת urinal acetate לכל מבחנה כדי לצבוע את הדגימה ולהגביר את הניגודיות של הממברנה.אם התוכנית הופסקה, הפעילו אותה מחדש. כאשר הטמפרטורה מגיעה ל-40°C-, הניחו במערכת ה-FS מבחנות סינצילציה המכילות 95% ethanol. כאשר הטמפרטורה מגיעה ל-30°C-, השתמשו בפיפט פסטור כדי להחליף את ה-urinal acetate ב-95% ethanol בכל 20 דקות למשך שעתיים.חשוב להשתמש באתנול בשלב זה מכיוון שהשרף לא יעבור פולימריזציה בנוכחות של אצטון. בחלקו הבא של הפרוטוקול, הדגימות מוטמעות בפלסטיק בעודן בטמפרטורה של 30- מעלות צלזיוס. ב-FS, החליפו את ה-95% ethanol בשרף 30% glycol methacrylate מקורר מראש, או GMA ב-95% ethanol; לאחר שלוש עד חמש שעות החליפו את ה-30% GMA ב-70% GMA; לאחר ארבע עד שש שעות, הסירו את ה-70% GMA והדגירו את הדגימות ב-97% GMA למשך הלילה.העלייה המדורגת בריכוז ה-GMA מאפשרת חדירה של התווך לרקמות. שימו לב כי מכיוון שנוסף 3% water לשרף ה-GMA, ה-97%GMA אינו מדולל. למחרת, עם אתנול, העבירו את הדגימות לתבנית שיקוע ב-A FS באמצעות פיפט פסטור; הניחו את הדגימות בתבנית השיקוע, ולאחר מכן החליפו את ה-97%GMA ב-GMA שהוכן טרי שלוש פעמים לאורך שש שעות בטמפרטורה של minus 30 degrees celsius.לאחר ההחלפה השלישית, הקש על מטריצת החיידקים כדי להפריד את הדגימה מחומר ההגנה בקריו (cryoprotectant). הוסף את המשרה nn dimethyl udine ל-97%GMA בתוך מבחנה עם אוורור. כמות המשרה המוספת היא 1.5 µL לכל 1 mL של GMA. הוסף מיד את תמיסת ה-GMA לכל תבנית שיכון ומקם את בעלי החיים בתבנית כך שיהיו במרווחים שווים.הפעילו מחדש את התוכנית כך שהטמפרטורה תעלה ל-20- °C. למרות שהשרף פולימריזציה במהירות תוך שעה אחת, השאירו את הפלסטיק להתקשות במהלך הלילה ב-20- °C, כדי להבטיח שהוא עבר פולימריזציה מלאה.לאחר שהפלסטיק התקשח, יש לאחסן את הדגימה בשקית ואקום ממולאת בגז חנקן בטמפרטורה של 20°C- . חיתוך של דגימה הטמיעה ב-GMA צריך להתבצע כפי שמתואר במסמך הנלווה עבור מיקרוסקופיית לוקליזציה מופעלת-פוטונית או דימוי PALM. יש להגדיר את מערכת המיקרוסקופ כך שמצלמת ה-E-M-C-C-D תהיה מכוונת ל-70°C- או פחות.באמצעות פיפטה, יש להוסיף לדגימה המיועדת לדימוי כ-50 µL של תמיסת חלקיקי זהב בגודל 100 nm בריכוז של 1×10¹⁰ חלקיקים למיליליטר. יש להניח כיסוי שחור מעל הדגימות ולהמתין 30 שניות כדי שהתמיסה תישאר על זכוכית המכסה. להסרת תמיסת הזהב, יש לדחוף אותה לקצה זכוכית המכסה ולספוג את התמיסה באמצעות נייר Kim wipe.לאחר מכן, מרחו גריז ואקום על מחזיק לזכוכית כיסוי עגולה והכניסו את זכוכית הכיסוי. מרחו שמן טבילה בחלק התחתון של הכיסוי. החליקו אותו ישירות מתחת לדגימה.הכנס את מחזיק הדגימה לתוך החריץ שעל בסיס המיקרוסקופ וכוון אותו כך שיהיה הדוק ומרכז את החתכים מעל העדשה. הקפד במיוחד שלא לגעת בעדשות. לאחר מכן, באמצעות תאורת שדה בהיר (brightfield), אתר את החתכים באמצעות עדשה עם הגדלה של 10x.לאחר מכן, עברו לעדשה עם הגדלה של 100x ומקדו את המבט על הדגימה. במידת הצורך, עברו לתאורת פלואורסצנציה באמצעות לייזר של 488 nanometer בעוצמה המוגדרת ל-10%. המתינו חמש דקות כדי שטמפרטורת הדגימה תתייצב. לאחר מכן, זהו את האזורים עם הפלואורסצנציה העזה ביותר ומקדו אותם.העבירו את הלייזרים ל-561 nanometers והגבירו את העוצמה ל-100%. כדי להסיר את האוטופלורסצנציה של הרקע, בצעו הלבנה (bleaching) של הדגימה למשך כשתי דקות. אם המיקוד משתנה במהלך ההלבנה, המתינו חמש דקות לפני כיוון המיקוד וצילום התמונות. עם סיום ההלבנה, הפעילו את הלייזר של 405 nanometer והגדירו אותו לעוצמה הנמוכה ביותר.התחילו באיסוף התמונות בקצב של 20 פריימים לשנייה. אספו מספיק פריימים כדי להשיג את מטרת הניסוי. 5,000 עד 6,000 פריימים נלקחים כדי לקבוע את הלוקליזציה של 584 חלבוני היסטון בתוך גרעין.לאחר איסוף 5,000 פריימים, כל המולקולות מזוהות וממופות על ידי תוכנת הדימוג. תמונת הפלואורסצנציה הסופית, או מה שנקרא תמונת some turf, היא קומפוזיציה של כל הפלואורסצנציה שזוהתה במצלמה. לעומת זאת, תמונת ה-palm ממפה את ה-OID של כל נקודה פלואורסצנטית ומציינת רק היכן ממוקם כל חלבון.לפני הדמיה ב-SEM, צבע את החתכים באמצעות 2.5% urinal acetate במים למשך ארבע דקות. שטוף את ה-urinal acetate ביסודיות עם מי milli QE מסוננים. לאחר ייבוש החתכים, השתמש בספוטר לציפוי פחמן של זכוכית הכיסוי עד שצבעה יהיה כהה למדי.הדביקו סרט פחמן מוליך בקצה אחד של לבישת הכיסוי ובקצה השני על הבסיס המתכתי (stub), כך שהאלקטרונים הנצברים על פני לבישת הכיסוי יקורקעו. התקינו את לבישת הכיסוי בתא ה-SEM ואתרו את הדגימה במיקרוסקופ. צלמו תמונה של הדגימה בהגדלה נמוכה, ולאחר מכן התמקדו באזור הרלוונטי והוציאו תמונות בהגדלה גבוהה.חזור על תהליך זה עם חיתוך חדש עד שכל החיתוכים דוגמו. לאחר מכן, יש לבצע יישור בין תמונות ה-palm לתמונות ה-EM. כדי לעשות זאת, פתח תחילה את תמונות ה-SEM שהושגו בתוכנת Photoshop.צרו חלון חדש בממדים של 5,000 על 5,000 פיקסלים וברזולוציה של 300 פיקסלים לאינץ'. העתיקו את תמונת ה-SEM בהגדלה העמוסה אל החלון החדש. השתמשו בפקודת ה-free transform הנמצאת תחת תפריט העריכה (edit) כדי לשנות את קנה מידה של התמונה כך שתמלא את החלון כולו.לאחר מכן העתיקו את תמונות ה-SEM בהגדלה גבוהה יותר, ובצעו קנה מידה וטרנספורמציה לפי הצורך. בחרו בסיבוב תמונה מתפריט נשלט של התמונות והפכו את תמונת ה-sum turf באופן אופקי. העתיקו והדביקו את תמונת ה-sum turf לשכבה חדשה.השתמש בפקודת ה-free transform הנמצאת תחת תפריט העריכה (edit) כדי לשנות את קנה המידה של התמונה, כך שגודלה יהיה בקירוב דומה לגודלה של מיקרוגרפ האלקטרונים בהגדלה נמוכה. לאחר מכן, סובב את התמונה כפי שנדרש כדי להתאים את הפלואורסצנציה של חלקיקי הזהב למבנים התואמים שנצפו ב-SEM. בשלב הבא, העתק את תמונת כף היד לשכבה חדשה והחל את אותה התמרה כדי להפיק תמונה בהגדלה גבוהה יותר.בצעו זום לאזור העניין והעתיקו את תמונת כף היד מהאזור. הדביקו את התמונה לתוך תמונת SEM ברזולוציה גבוהה יותר לצורך הצגה. יש להחיל שקיפות מדורגת (gradient transparency) על תמונת כף היד, כך שרק הרקע השחור יהיה שקוף, ולא אותות כף היד.העתיקו את תמונת כף היד שעברה טרנספורמציה לשכבה חדשה. בחרו את אותות כף היד ללא הרקע באמצעות אפשרות Color Range בתפריט הבחירה (Select). לאחר מכן, בחרו פיקסל מהרקע כנקודת ייחוס והפעילו את אפשרות ההיפוך (Invert).גזרו את אותות כף היד הרצויים והדביקו אותם לשכבה חדשה. החילו שקיפות על שכבת הרקע והגדירו אותה ל-10% כדי לאפשר ויזואליזציה של אותות כף היד על ידי הפיכת הרקע לשקוף מבלי לפגוע בעוצמה. חלבון היסטון.His11 tagged TD eos התבטא באופן יציב בנמטודה c elgan, והחיות הטרנסגניות עובדו ודוגמו באמצעות הפרוטוקול המתואר בסרטון זה. מיקרוגרפים של פלואורסנציה ומיקרוגרפים אלקטרוניים נרכשו מאותו נתח. ננו-חלקיקי הזהב, המופיעים הן במיקרוגרפים הפלואורסצנטיים והן במיקרוגרפים האלקטרוניים, שימשו לאחר מכן ליישור של שתי התמונות.כאן אנו מתמקדים באזור סמוך לקצה העליון של המיקרוגרף. כפי שניתן לראות כאן, פרטים תת-תאיים כגון גרעין.ניתן להבחין בגרעין, בנקבוביות הגרעין ובסרטו endoplasmic reticulum. עם זאת, מולקולות ההיסטון המסומנות ממוקמות באופן בלעדי בתוך הגרעין, אך לא ב-nucleus. כצפוי, המיקרוסקופיה האלקטרונית וה-palm הקורלטיבית מאפשרות אפוא למיקום חלבונים ברזולוציה הגבוהה ביותר. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לקחת את החתכים הללו עם התפלגות החלבונים ולערם באמצעות טומוגרפיה של מערכים (array tomography) כך שניתן יהיה ליצור מבנה תלת-ממדי, המראה היכן החלבונים מפוזרים בתא.וזכרו כי בעת שימוש באוסמיום טטראוקסיד, מדובר בחומר כימי מסוכן מאוד, ויש להרכיב כפפות תמיד.

nano-fem-protein-localization-using-photo-activated-localization

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מתאר את BiFC-PALM - שילוב של מיקרוסקופ לוקליזציה פוטואקטיבי והשלמה פלואורסצנטית דו-מולקולרית - כדי להעריך אינטראקציות חלבון-חלבון. BiFC כרוך באיחוי של שני מקטעי חלבון פלואורסצנטיים עם שני חלבונים בעלי אינטראקציה. כאשר שני החלבונים מתקשרים, המקטעים מובאים לקרבה, מה שמאפשר לשני החלקים להתאחד וליצור מחדש חלבון פלואורסצנטי פונקציונלי. הפלואורסצנטיות של פלואורופור יחיד ממוקמת ברמת מולקולה בודדת בתוך תאים על ידי PALM.

מיקרוסקופ לוקליזציה פוטואקטיבי מצומד פלואורסצנטי דו-מולקולרי

אנו מדגימים את השימוש במיקרוסקופ לוקליזציה של הפעלת פוטו פלואורסצנטי (FPALM) כדי לדמות בו זמנית סוגים מרובים של מולקולות המסומנות באופן פלואורסצנטי בתוך התאים. הטכניקות המתוארות מניבות לוקליזציה של אלפי עד מאות אלפי חלבונים בודדים המסומנים בסימון פלואורסצנטי, עם דיוק של עשרות ננומטרים בתוך תאים בודדים.

הדמיה סימולטנית רב-צבעונית של מבנים ביולוגיים עם מיקרוסקופ לוקליזציה של פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית

מיקרוסקופיה photoactivated הלוקליזציה (PALM) בשילוב עם מעקב מולקולה בודדת מאפשרת התבוננות ישירה וכימות של אינטראקציות החלבון-DNA בתאי חיידקי Escherichia חיים.

לדמיין אינטראקציות החלבון-DNA בתאים חיידקיים בשידור חי באמצעות מעקב מולקולה בודדת photoactivated

יכול להיות מקומי fluorophores יחיד עם דיוק ננומטר באמצעות פיונה. הנה סיכום של טכניקת FIONA מדווח, וכיצד לבצע את ניסויי FIONA מתואר.

דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחת ננומטר (FIONA)

אינטראקציות חלבון-חלבון מוצגות בתאים עם רזולוציה מרחבית ננומטרית על ידי שילוב של השלמת פלואורסצנטיות דו-מולקולרית (BiFC) עם מיקרוסקופ לוקליזציה פוטו-אקטיבי (PALM). מתואר כאן השימוש ב-BiFC-PALM להדמיית אינטראקציות Ras-Raf בתאי U2OS להמחשת אשכולות ודיפוזיה בקנה מידה ננומטרי של קומפלקסים בודדים של Ras-Raf.

Photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופית עם bimolecular פלואורסצנטי השלמה (BiFC-PALM)

כאן אנחנו מדגימים כיצד מולקולה בודדת לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ יכול להתבצע על הטרמינל עצבים מוטוריים של חיים דרוזופילה melanogaster השלישי instar זחל.

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

נתאר כמה מיקרו - photomanipulation טכניקות כגון FRAP photoactivation לאפשר קביעת פרמטרים תנועתיות ואת הדינמיקות ייתכן של חלבונים בתוך מעביר תאים. ניסיוני הקריאות הבאות כוללות דינמיקה subcellular מחזור של הרגולטורים תנועתיות או של שלד התא המשמש כבסיס של אקטין.

בטכניקות המיקרומניפולציה המאפשר ניתוח של דינמיקה Morphogenetic מחזור של הרגולטורים Cytoskeletal

כאן, אנו מציגים עבור צבע רב לוקליזציה של חלבוני ממברנה בודדת פרוטוקול organelles של תאים חיים. כדי לצרף fluorophores, משמשים החלבונים תיוג עצמי. חלבונים, במיקום שונה ממברנות תאי האברון המשמש אותו, יכול להיות מקומי עם דיוק של ~ 18 ננומטר.

צבע רב לוקליזציה מיקרוסקופיה של חלבוני ממברנה בודדת ב- Organelles של תאים בתרבית של חיים

פרוטוקול זה מתאר את שיטת ה-קריואיפקס, בה חלבון ממברנה APEX2 מתויג יכול להיות מקומי על ידי שידור אלקטרון מיקרוסקופ בתוך מבנה מיטבי משומר התא.

שיטת ה-קריואיפקס לניתוח מיקרוסקופ אלקטרוני של לוקליזציה של חלבון ממברנה בתוך תאים שהשתמרו באופן מבנית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכנולוגיית תיוג מיקרוסקופיית אלקטרונים ניתנת לשיבוט לגילוי חלבונים מתויגים במתכות בתאים באמצעות טכניקת סינתזת ננו-חלקיקי זהב חדשנית המבוססת על מנגנון דיכוי אוטו-נוקלציה.

סינתזה ישירה של ננו-חלקיקי זהב גלויים EM בתאים לניתוח לוקליזציה של חלבונים עם מבנה אולטרה שמור היטב

למד לוקליזציה של חלבונים במיקרוגרפיות אלקטרוניות באמצעות שיטת ננו פאם. השיטה משתמשת בחלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית בנמטודות טרנסגניות לדיוק מרבי.

ננו פאם: לוקליזציה חלבון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה מופעלת ומיקרוסקופי אלקטרונים

גלה סרטונים נוספים