ננו פאם: לוקליזציה חלבון באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה תמונה מופעלת ומיקרוסקופי אלקטרונים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לאתר חלבונים במיקרוגרפים אלקטרוניים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ואלקטרונית מקושרת. שיטה זו, הידועה כ-nano FEM, משמשת לאיתור חלבונים ב-C. elegans. ראשית, תולעת טרנסגנית המבטאת histone TdTomato מוטמעת בפלסטיק ונחתכת לפרוסות.

כל חתך נדגם הן באמצעות מיקרוסקופיית לוקליזציה מופעלת-פוטונית (PALM) והן באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת. שתי התמונות המיקרוסקופיות עבור כל חתך מיושרות באמצעות סימני ייחוס (fiducial markers) בתוכנת Photoshop. התמונה הקורלטיבית מראה את הלוקליזציה של מולקולות היסטון בגרעין.

אם כן, היתרון המרכזי של הטכניקה שנתאר היום הוא שבמקום להשתמש ב-immuno EM, אנו משתמשים בחלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית, כך שכל חלבון מקושר לחלבון פלואורסצנטי. בעבודה עם immuno EM, נוגדנים רבים אינם יכולים להגיב עם פלסטיק. הדבר פשוט אינו תואם, ואם הוא תואם, הנוגדנים אינם מסוגלים לחדור עמוק לתוך החתך שבו נמצאים האנטיגנים.

באמצעות שימוש בחלבונים פלואורסצנטיים, כל חלבון מסומן בفلואורופור. היום, shige wbi ידגים טכניקה זו. הפרוצדורה הבאה תוצג באמצעות נמטודות טרנסגניות המבטאות היסטונים המסומנים בחלבון הפלואורסצנטי TDE os.

להדגמה זו, נשתמש בחומר קריו-פרוטקטור, אך ניתן להשתמש גם ב-20% BSA להקפאת sea elegance. שעה לפני תהליך ההחלפה בהקפאה (freeze substitution), מלאו את מכשיר ה-freeze substitution האוטומטי או מכשיר FS בחנקן נוזלי. כמו כן, הכינו מראש את המקבעים הדרושים בהתאם להוראות במסמך המצורף, אחסנו את המקבעים באליקוטיים של 1 mL בתוך מבחנות קריו, והניחו אותם בחנקן נוזלי עד למועד השימוש.

השתמשו במברשת צבע כדי לאסוף בעלי חיים משטח גידול של חיידקים והעבירו אותם למנשאת דגימות של 100 מיקרון. מלאו את הכוס מעט מעבר לקו המילוי כדי להבטיח שאין בתוכה בועות אוויר. לאחר מכן, הניחו את כוס הדגימה בזרוע של מקפיא בלחץ גבוה כדי להקפיא אותה. מיד לאחר מכן, העבירו את הדגימה לאמבט חנקן נוזלי הסמוך לתא ההקפאה.

בשלב הבא, העבירו את הדגימה באמצעות פיפטה ופינצטה אל מבחנה לקריו המכילה חומרי קיבוע. ודאו שהדגימה נשארת בתוך החנקן הנוזלי בכל עת. חזרו על תהליך זה עבור כל דגימה, ולאחר מכן העבירו את כל מבחנות הקריו ליחידת FS.

לאחר שכל מבחנות הקריו (cryo vials) הוצבו ביחידת ה-FS, הפעל את התוכנית. פרוטוקול ההקפאה והעיבוד מוצג בדיאגרמה זו. במהלך הדגירה הראשונית ב-90°C-, הקרח הזכוכיתי מוחלף במקבע באצטון.

לאחר מכן, עם עליית טמפרטורת הדגימה, המקבע באצטון הנוזלי יוצר קשרי צילוב בדגימה כדי לשמר את המבנה. כאשר הטמפרטורה ביחידת ה-FS מגיעה ל-60°C-, הניחו מבחנות סינטילציה המכילות 20 milliliters של 95%acetone בתוך ה-FS לקירורן. לאחר מכן, כאשר הטמפרטורה מגיעה ל-50°C-, השתמשו בפיפט פסטור עם טיפ P 200 כדי להסיר את המקבע ולהוסיף כ-1 milliliter של 95%acetone שקולל מראש לכל דגימה של Bile.

חזור על תהליך זה מדי 20 דקות במשך שעתיים. כמו כן, במהלך הדגירה ב-50- °C, הנח מבחנת סינטילציה המכילה 20 milliliters של 0.1%urinal acetate ב-95%acetone בתוך תא ה-FS כדי לקירר אותה מראש ל-50- °C. לאחר מכן, לאחר שטיפת ה-acetone האחרונה, הוסף כ-one milliliter של תמיסת urinal acetate לכל מבחנה כדי לצבוע את הדגימה ולהגביר את הניגודיות של הממברנה.

אם התוכנית הופסקה, הפעילו אותה מחדש. כאשר הטמפרטורה מגיעה ל-40°C-, הניחו במערכת ה-FS מבחנות סינצילציה המכילות 95% ethanol. כאשר הטמפרטורה מגיעה ל-30°C-, השתמשו בפיפט פסטור כדי להחליף את ה-urinal acetate ב-95% ethanol בכל 20 דקות למשך שעתיים.

חשוב להשתמש באתנול בשלב זה מכיוון שהשרף לא יעבור פולימריזציה בנוכחות של אצטון. בחלקו הבא של הפרוטוקול, הדגימות מוטמעות בפלסטיק בעודן בטמפרטורה של 30- מעלות צלזיוס. ב-FS, החליפו את ה-95% ethanol בשרף 30% glycol methacrylate מקורר מראש, או GMA ב-95% ethanol; לאחר שלוש עד חמש שעות החליפו את ה-30% GMA ב-70% GMA; לאחר ארבע עד שש שעות, הסירו את ה-70% GMA והדגירו את הדגימות ב-97% GMA למשך הלילה.

העלייה המדורגת בריכוז ה-GMA מאפשרת חדירה של התווך לרקמות. שימו לב כי מכיוון שנוסף 3% water לשרף ה-GMA, ה-97%GMA אינו מדולל. למחרת, עם אתנול, העבירו את הדגימות לתבנית שיקוע ב-A FS באמצעות פיפט פסטור; הניחו את הדגימות בתבנית השיקוע, ולאחר מכן החליפו את ה-97%GMA ב-GMA שהוכן טרי שלוש פעמים לאורך שש שעות בטמפרטורה של minus 30 degrees celsius.

לאחר ההחלפה השלישית, הקש על מטריצת החיידקים כדי להפריד את הדגימה מחומר ההגנה בקריו (cryoprotectant). הוסף את המשרה nn dimethyl udine ל-97%GMA בתוך מבחנה עם אוורור. כמות המשרה המוספת היא 1.5 µL לכל 1 mL של GMA. הוסף מיד את תמיסת ה-GMA לכל תבנית שיכון ומקם את בעלי החיים בתבנית כך שיהיו במרווחים שווים.

הפעילו מחדש את התוכנית כך שהטמפרטורה תעלה ל-20- °C. למרות שהשרף פולימריזציה במהירות תוך שעה אחת, השאירו את הפלסטיק להתקשות במהלך הלילה ב-20- °C, כדי להבטיח שהוא עבר פולימריזציה מלאה.

לאחר שהפלסטיק התקשח, יש לאחסן את הדגימה בשקית ואקום ממולאת בגז חנקן בטמפרטורה של 20°C- . חיתוך של דגימה הטמיעה ב-GMA צריך להתבצע כפי שמתואר במסמך הנלווה עבור מיקרוסקופיית לוקליזציה מופעלת-פוטונית או דימוי PALM. יש להגדיר את מערכת המיקרוסקופ כך שמצלמת ה-E-M-C-C-D תהיה מכוונת ל-70°C- או פחות.

באמצעות פיפטה, יש להוסיף לדגימה המיועדת לדימוי כ-50 µL של תמיסת חלקיקי זהב בגודל 100 nm בריכוז של 1×10¹⁰ חלקיקים למיליליטר. יש להניח כיסוי שחור מעל הדגימות ולהמתין 30 שניות כדי שהתמיסה תישאר על זכוכית המכסה. להסרת תמיסת הזהב, יש לדחוף אותה לקצה זכוכית המכסה ולספוג את התמיסה באמצעות נייר Kim wipe.

לאחר מכן, מרחו גריז ואקום על מחזיק לזכוכית כיסוי עגולה והכניסו את זכוכית הכיסוי. מרחו שמן טבילה בחלק התחתון של הכיסוי. החליקו אותו ישירות מתחת לדגימה.

הכנס את מחזיק הדגימה לתוך החריץ שעל בסיס המיקרוסקופ וכוון אותו כך שיהיה הדוק ומרכז את החתכים מעל העדשה. הקפד במיוחד שלא לגעת בעדשות. לאחר מכן, באמצעות תאורת שדה בהיר (brightfield), אתר את החתכים באמצעות עדשה עם הגדלה של 10x.

לאחר מכן, עברו לעדשה עם הגדלה של 100x ומקדו את המבט על הדגימה. במידת הצורך, עברו לתאורת פלואורסצנציה באמצעות לייזר של 488 nanometer בעוצמה המוגדרת ל-10%. המתינו חמש דקות כדי שטמפרטורת הדגימה תתייצב. לאחר מכן, זהו את האזורים עם הפלואורסצנציה העזה ביותר ומקדו אותם.

העבירו את הלייזרים ל-561 nanometers והגבירו את העוצמה ל-100%. כדי להסיר את האוטופלורסצנציה של הרקע, בצעו הלבנה (bleaching) של הדגימה למשך כשתי דקות. אם המיקוד משתנה במהלך ההלבנה, המתינו חמש דקות לפני כיוון המיקוד וצילום התמונות. עם סיום ההלבנה, הפעילו את הלייזר של 405 nanometer והגדירו אותו לעוצמה הנמוכה ביותר.

התחילו באיסוף התמונות בקצב של 20 פריימים לשנייה. אספו מספיק פריימים כדי להשיג את מטרת הניסוי. 5,000 עד 6,000 פריימים נלקחים כדי לקבוע את הלוקליזציה של 584 חלבוני היסטון בתוך גרעין.

לאחר איסוף 5,000 פריימים, כל המולקולות מזוהות וממופות על ידי תוכנת הדימוג. תמונת הפלואורסצנציה הסופית, או מה שנקרא תמונת some turf, היא קומפוזיציה של כל הפלואורסצנציה שזוהתה במצלמה. לעומת זאת, תמונת ה-palm ממפה את ה-OID של כל נקודה פלואורסצנטית ומציינת רק היכן ממוקם כל חלבון.

לפני הדמיה ב-SEM, צבע את החתכים באמצעות 2.5% urinal acetate במים למשך ארבע דקות. שטוף את ה-urinal acetate ביסודיות עם מי milli QE מסוננים. לאחר ייבוש החתכים, השתמש בספוטר לציפוי פחמן של זכוכית הכיסוי עד שצבעה יהיה כהה למדי.

הדביקו סרט פחמן מוליך בקצה אחד של לבישת הכיסוי ובקצה השני על הבסיס המתכתי (stub), כך שהאלקטרונים הנצברים על פני לבישת הכיסוי יקורקעו. התקינו את לבישת הכיסוי בתא ה-SEM ואתרו את הדגימה במיקרוסקופ. צלמו תמונה של הדגימה בהגדלה נמוכה, ולאחר מכן התמקדו באזור הרלוונטי והוציאו תמונות בהגדלה גבוהה.

חזור על תהליך זה עם חיתוך חדש עד שכל החיתוכים דוגמו. לאחר מכן, יש לבצע יישור בין תמונות ה-palm לתמונות ה-EM. כדי לעשות זאת, פתח תחילה את תמונות ה-SEM שהושגו בתוכנת Photoshop.

צרו חלון חדש בממדים של 5,000 על 5,000 פיקסלים וברזולוציה של 300 פיקסלים לאינץ'. העתיקו את תמונת ה-SEM בהגדלה העמוסה אל החלון החדש. השתמשו בפקודת ה-free transform הנמצאת תחת תפריט העריכה (edit) כדי לשנות את קנה מידה של התמונה כך שתמלא את החלון כולו.

לאחר מכן העתיקו את תמונות ה-SEM בהגדלה גבוהה יותר, ובצעו קנה מידה וטרנספורמציה לפי הצורך. בחרו בסיבוב תמונה מתפריט נשלט של התמונות והפכו את תמונת ה-sum turf באופן אופקי. העתיקו והדביקו את תמונת ה-sum turf לשכבה חדשה.

השתמש בפקודת ה-free transform הנמצאת תחת תפריט העריכה (edit) כדי לשנות את קנה המידה של התמונה, כך שגודלה יהיה בקירוב דומה לגודלה של מיקרוגרפ האלקטרונים בהגדלה נמוכה. לאחר מכן, סובב את התמונה כפי שנדרש כדי להתאים את הפלואורסצנציה של חלקיקי הזהב למבנים התואמים שנצפו ב-SEM. בשלב הבא, העתק את תמונת כף היד לשכבה חדשה והחל את אותה התמרה כדי להפיק תמונה בהגדלה גבוהה יותר.

בצעו זום לאזור העניין והעתיקו את תמונת כף היד מהאזור. הדביקו את התמונה לתוך תמונת SEM ברזולוציה גבוהה יותר לצורך הצגה. יש להחיל שקיפות מדורגת (gradient transparency) על תמונת כף היד, כך שרק הרקע השחור יהיה שקוף, ולא אותות כף היד.

העתיקו את תמונת כף היד שעברה טרנספורמציה לשכבה חדשה. בחרו את אותות כף היד ללא הרקע באמצעות אפשרות Color Range בתפריט הבחירה (Select). לאחר מכן, בחרו פיקסל מהרקע כנקודת ייחוס והפעילו את אפשרות ההיפוך (Invert).

גזרו את אותות כף היד הרצויים והדביקו אותם לשכבה חדשה. החילו שקיפות על שכבת הרקע והגדירו אותה ל-10% כדי לאפשר ויזואליזציה של אותות כף היד על ידי הפיכת הרקע לשקוף מבלי לפגוע בעוצמה. חלבון היסטון.

His11 tagged TD eos התבטא באופן יציב בנמטודה c elgan, והחיות הטרנסגניות עובדו ודוגמו באמצעות הפרוטוקול המתואר בסרטון זה. מיקרוגרפים של פלואורסנציה ומיקרוגרפים אלקטרוניים נרכשו מאותו נתח. ננו-חלקיקי הזהב, המופיעים הן במיקרוגרפים הפלואורסצנטיים והן במיקרוגרפים האלקטרוניים, שימשו לאחר מכן ליישור של שתי התמונות.

כאן אנו מתמקדים באזור סמוך לקצה העליון של המיקרוגרף. כפי שניתן לראות כאן, פרטים תת-תאיים כגון גרעין.

ניתן להבחין בגרעין, בנקבוביות הגרעין ובסרטו endoplasmic reticulum. עם זאת, מולקולות ההיסטון המסומנות ממוקמות באופן בלעדי בתוך הגרעין, אך לא ב-nucleus. כצפוי, המיקרוסקופיה האלקטרונית וה-palm הקורלטיבית מאפשרות אפוא למיקום חלבונים ברזולוציה הגבוהה ביותר. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לקחת את החתכים הללו עם התפלגות החלבונים ולערם באמצעות טומוגרפיה של מערכים (array tomography) כך שניתן יהיה ליצור מבנה תלת-ממדי, המראה היכן החלבונים מפוזרים בתא.

וזכרו כי בעת שימוש באוסמיום טטראוקסיד, מדובר בחומר כימי מסוכן מאוד, ויש להרכיב כפפות תמיד.