דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים
29 בנובמבר 2012
תאי גזע pluripotent מושרה קווים מניבים (iPSC) מייצרים שורות של פוטנציאל ההתפתחותי שונים גם כאשר הם עוברים בדיקות תקן לpluripotency. כאן אנו מתארים פרוטוקול לייצר עכברים נגזרים לחלוטין מiPSCs, המגדיר את קווי iPSC כבעל pluripotency המלא 1.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור עכברים בוגרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, או I PSCs על ידי השלמת עובר טטרפלואידי. זה מושג על ידי הגעה ראשונה. I PSCs מפיברובלסטים עובריים של עכברים המשתמשים ב-lentivirus, הנושאים OCT 4, SOX 2, KLA 4 ו-cmic ומשלימים את המדיה עם חומצה ולפרואית או VPA.
לאחר יצירת ה-IPC, הם מאופיינים בצביעה חיסונית, ספירת כרומוזומים ויצירת גוף עוברי. השלב הבא הוא לייצר סיוע בפיצוץ טטרפלואיד נמען באמצעות היתוך ותרבית במבחנה. לאחר מכן, ה-IPSC מוזרקים לסיוע בפיצוץ טטרפלואיד וסיוע פיצוץ משלים מושתלים לנקבות מקבלות להריון.
בשלב האחרון, בעלי חיים לטווח מלא נולדים בניתוח קיסרי ולאמהות פונדקאיות. כך שניתן לעקוב אחר ההתפתחות לאחר הלידה. בסופו של דבר אם נוצרים בעלי חיים ברי קיימא לטווח מלא.
קו הבדיקה IPSC נחשב לפלוריפוטנטי לחלוטין. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות ליצירת I PSCs הוא שהשיטה שלנו מייצרת באופן שחזורי קווי תאי IPS פלוריפוטנטיים לחלוטין קווי תאי IPS שנוצרו בשיטות אלה עשויים להיות שימושיים לחוקרים אחרים המעוניינים להשוות את הפלוריפוטנטיות של תאי ה-IPS שלהם או לבסס את השקילות של שיטות תכנות מחדש אחרות. שיטות אלו יהיו שימושיות עבור חוקרים המעוניינים ליצור קווי תאי IPS פלוריפוטנטיים לחלוטין עבור יישומים ספציפיים במורד הזרם כגון מבחני התמיינות במבחנה.
בהמשך הדור של כל עכברי IPSC. שימוש בהשלמת טלו עשוי לשמש כאמצעי שימושי לקביעת היציבות הגנטית והאפיגנטית של קווי תאים שונים. מניפולציות המיקרום המעורבות בהשלמת עוברים טטרפלואידים מאתגרות מבחינה טכנית.
ייתכן שיחלפו מספר חודשים עד שמישהו יתמקצע בטכניקות IPSC שפותח בטכניקה זו דורש תנאי תרבית דומים לאלה המשמשים בניסויי מיקוד גנים ESL מסורתיים. 24 שעות לאחר טרנספקציה של תאי HEC 2 9 3 T עם lentivirus. הסר את מצע הגידול והחלף אותו ב -25 מיליליטר של טכנולוגיה טרייה מחממת.
החזרת משושה בינונית לאינקובטור למשך 24 שעות, 48 שעות לאחר טרנספקציה של תאי HEC 2 9 3 T עם לנטי-וירוס אוספים מדיום גידול המכיל חלקיקים לנטי-ויראלים מהתאים המועברים. הסר פסולת חלקיקים מהנגיף המכיל מדיה על ידי צנטריפוגה ב-3000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, רכזו את הנגיף על ידי אולטרה-צנטריפוגה דרך כרית סוכרוז של 20% למשך שעתיים ב-112,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס.
שפכו בזהירות את הכדור למיכל פסולת לטיהור מבלי להפריע לגלולה הנגיפית. השעו מחדש את הגלולה הנגיפית ב-0.4 מיליליטר של מדיום פיברובלסטים עוברי של עכבר ואטמו את הצינור. לאחר מכן נדנד אותו בעדינות בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 עד 30 דקות.
אחסן חלקיקים נגיפיים ופריטים חד פעמיים במינוס 80 מעלות צלזיוס.IPSC. קווים נגזרים מפיברובלסטים עובריים של עכברים, או תאי מת'. ברגע שלמושבות IPSC יש גבול שבירה בהיר ומוגדר היטב ומכילות 30 עד 50 תאים, הן מוכנות לבחירה ידנית ולהרחבה כקווי IPSC עצמאיים.
בחר מושבות בודדות עם קצה פיפטה לטעינת ג'ל והעביר כל מושבה ישירות לבאר אחת של צלחת U תחתונה 96 באר המכילה 20 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין EDTA דוגר על מושבות קטפות וטריפסין למשך כשמונה דקות ב -37 מעלות צלזיוס או עד שהמושבות מתפרקות לתאים בודדים. עקוב אחר התקדמות הדיסוציאציה על ידי מיקרוסקופ אור. ייתכן שיהיה צורך בטיפול עדין.
העבר את תרחיף התאים המנותק לצלחת של 96 בארות המכילה שכבת הזנה ו-150 מיקרוליטר של מדיום ESC בתוספת דוקסיציקלין ו-VPA כאשר מושבות IPSC מופיעות מחדש בכל באר מפוצלת לבארות גדולות יותר לניתוח ובנקאות תאים באמצעות נהלי גזירה סטנדרטיים של ESC ותרבית תאים כדי להתחיל בהליך ליצירת סיוע פיצוץ טטרפלואידי. עוברי תא אחד שנאספו מעכברים נקבות עוברים תרבית לשני עוברי תאים בן לילה ב-KSOM ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למחרת. הניחו מגלשת מיקרו BTX בצלחת פטרי של 10 סנטימטרים.
יוצקים מספיק מדיה אלקטרו היתוך בטמפרטורת החדר כדי להטביע את השקופית בתמיסה, אך לא עד כדי כך שקוטבי האלקטרודה שקועים לחלוטין. הפעל את מניפולטור התאים החשמליים BTX ECM 2001 ומשפר BTX 400. חבר את כבלי ה-ECM לאלקטרודה של מיקרו שקופיות וקבע את הכבלים לצד צלחת הפטרי כדי למנוע תנועה לא מכוונת של המגלשה.
הפעל דופק ידני אחד כדי לקבל קריאה על משפר ה-BTX ושים לב למתח של זרמי ה-DC המופעלים. זרם ה-AC ישלוט במהירות שבה העוברים מתיישרים בין האלקטרודות. זרם ה-DC ימזג את המגדפים וזמן הדופק יקבע את אורך דופק ה-DC.
נקודת התחלה טובה היא AC שלושה וולט DC 100 וולט ופעמים 0.05 מילי-שניות. ה- DC האופטימלי משתנה בתחום של 90 עד 150 וולט. בעזרת פיפטה בפה.
קח 30 עד 42 עוברי תאים מתרבית KSOM והעביר אותם לטיפה של היתוך אלקטרו. שטיפה בינונית דרך כמה טיפות של מדיום היתוך אלקטרו. לאחר מכן, משוך מדיום אלקטרו פיוז'ן טרי מצלחת המיקרו לתוך פיפטת הפה.
קח עוברים שטופים והניח אותם ברווח של מילימטר אחד בין האלקטרודות בשקופית המיקרו. היזהר שהעוברים מיושרים באמצע הפער ואינם במגע זה עם זה. הפעל זרם AC על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה הידנית.
העוברים יסתובבו בשדה AC עד שמישור המגע של הבלזר יהיה מקביל לאלקטרודות. אם העוברים אינם מיושרים תוך מספר שניות, הגדל את הגדרת AC. לאחר שהעוברים התיישרו, לחץ שוב על לחצן ההתחלה הידני כדי להפעיל את דופק ה-DC עם מדיום היתוך חשמלי בפיפטה.
אסוף את העוברים מהמגלשה המיקרו, שטוף את העוברים דרך מספר טיפות של מדיום KSOM ולאחר מכן תרבית עוברים ב-KSOM תחת שמן מינרלי ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. היתוך הפיצוץ אמור להסתיים תוך פחות מ-30 דקות. בתרבית, עקוב ובחר בהצלחה עוברים עם בלסטומרים מאוחדים.
עוברים מאוחים ייראו בשלב תא אחד שהושלכו ושני עוברי תאים לאחר 30 דקות בתרבית, המשיכו לתרבית עוברים מאוחים במיקרו טיפות של KSOM מתחת לשמן מינרלי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. 5% פחמן דו חמצני להכנת IPCs להזרקת פיצוץ מפשיר IPCs שאוחסנו בעבר וצלחת אותם על מזינים במעבר בינוני ESC לתאים לפחות פעם אחת על מזינים. לאחר ההפשרה לפני השימוש להזרקה.
באר אחת של צלחת שש בארות המכילה 70 עד 80% IPCs קונפלואנטים תספק יותר ממספר מספיק של תאים להזרקה, תשאב את מדיום הגידול ותשטוף את התאים בשלושה מיליליטר PBS ללא סידן או מגנזיום ב-0.5 מיליליטר של חימום מוקדם, 0.05% טריפסין EDTA לתאים ותדגור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם נדנוד מדי פעם ב-3.0 מיליליטר של מדיום ESC ויחזור על עצמו כדי לקבל יחיד מתלה תאים. התבונן בתאים על ידי מיקרוסקופ אור כדי להבטיח תרחיף תא בודד, מושבות או אגרגטים של תאים יסתמו את פיפטת ההזרקה. לאחר שהושג תרחיף תא בודד, הוסף מיליליטר אחד של מדיום ESC לבאר והחזיר את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס.
דגירה למשך כ-15 דקות או עד שרוב תאי ההזנה החלו להידבק, הסר בעדינות את המדיום המכיל את ה-IPC. הקפדה לא לעקור את תאי ההזנה הדבקים השבועיים. הנח את ה-IPCs בצינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של צנטריפוגה בינונית ESC ב-200 Gs למשך חמש דקות.
שאפו את הסופרנטנט והסר את שארית מדיום ה- ESC בעזרת מיקרו פיפטה. הקש על הצינור כדי לעקור את הגלולה ולהשעות בעדינות את התאים ב-0.2 עד 0.5 מיליליטר של מדיום FHM מקורר מראש. אחסן את התאים על קרח עד ובמהלך ההזרקה לתוך עזרי פיצוץ טטרפלואידים לפרוטוקול להזרקת סיוע בפיצוץ, אנא עיין בכתב היד הנלווה למאמר זה ובמאמר שפורסם בעבר, שקטע ממנו מוצג על המסך כאן.
דוגמאות להתקדמות המורפולוגית ממושבות פיברובלסטים למושבות IPSC במהלך ניסוי תכנות מחדש מוצגות בתמונות אלה. יש להבחין בהטרוגניות מורפולוגית ובהיווצרות מושבת IPSC שתוכנתה מחדש חלקית החל מארבעה עד חמישה ימים לאחר מהדורת דוקסיציקלין VPA כפי שמוצג בפאנלים B עד EESC. בדומה ל-IPSC, מושבות צריכות להופיע בין שבעה ל-10 ימים כפי שמוצג בפאנל F.ייצור עוברי טלו של תא אחד על ידי איחוי חשמלי של עוברי שני תאים דיפלואידים הוא יעיל ביותר.
זה שגרתי לצפות בעד 95% מעוברי שני התאים שטופלו התמזגו בהצלחה לייצור עוברי תא אחד טטרפלואידים. הפרוטוקול המשמש בניסוי זה להזרקת IPSC לסיוע בפיצוץ טטרפלואידי דומה לפרוטוקול להזרקת E SES לסיוע בפיצוץ דיפלואידי ליצירת עכברים כימריים כדי לשלול בקלות יצירת כימרה דיפלואידית, הפיגמנטציה של זני העכברים המשמשים ליצירת IPS ועוברים טטרפלואידים נבחרים בקפידה במידת האפשר. בדוגמה זו, עוברים טטרפלואידים מיוצרים מזן לבקן ו-IPSC נוצרים מזן פיגמנטי.
לפיכך, עכברי IPSC שזה עתה נולדו מציגים עיניים פיגמנטיות וצבע פרווה פיגמנטי אחיד בבגרותם, בעוד שקירות דיפלואידיות יציגו צבע לבקן ופיגמנטי מעורב. מספר הגורים החיים שנולדים תלוי בקו התאים כפי שמוצג בטבלה זו. עבור קו IPSC טוב ממוצע, הנסיינים צריכים לצפות שבין 1% ל-10% מסיוע הפיצוץ המוזרק יניב גורים חיים שזה עתה נולדו.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להפיק תאי IPS פלוריפוטנטיים לחלוטין וגם כיצד לאמת את הפוטנציאל ההתפתחותי שלהם. שימוש במבחן ההשלמה הטטרפלואידית לאחר שליטה בטכניקה זו מגזירת MES ל-IPSC שזה עתה נולד, ניתן להשלים עכברים בין חודשיים לשלושה חודשים. פיתוח ותחזוקה של I PSCs דורשים רמה גבוהה של טכניקת תרבית תאים.
ניסיון קודם עם תרבות ESL הוא חיוני. אל תשכח שעבודה עם lentivirus, במיוחד lentivirus מרוכז יכול להיות מסוכן ביותר. יש ללבוש תמיד את ציוד המיגון האישי הנדרש על ידי המוסד ולהקפיד לטפל בכל מה שבא במגע עם הנגיף, עם 10% אקונומיקה למשך 20 דקות לפחות לאחר הליך זה.
ניתן לנתח את כל עכברי ה- IPSC והרקמות שלהם עבור פנוטיפים פיזיולוגיים, פתולוגיים והתנהגותיים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת עכברים בוגרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושראים (iPSCs) באמצעות השלמה של עוברים טטרהפלואידיים. שיטה זו נועדה לבסס את הפלוריפוטנטיות המלאה של שורות iPSC, שעשויות להשתנות למרות מעבר של בדיקות סטנדרטיות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של תאי גזע
- ביולוגיה התפתחותית
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- ניתן להפיק תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים (iPSCs) מתאים סומטיים.
- אפיון של iPSCs חיוני כדי לאשר את הפלוריפוטנטיות שלהם.
- השלמה של עוברים טטרהפלואידיים היא טכניקה המשמשת להערכת הפוטנציאל ההתפתחותי של iPSCs.
- יצירת בעלי חיים בשלים מה-iPSCs מעידה על תכנות מחדש ופלוריפוטנטיות מוצלחים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה ליצירת קווי iPSC פלוריפוטנטיים באופן מלא.
- אספקת פרוטוקול שניתן לשחזור על ידי חוקרים אחרים.
- הערכת היציבות הגנטית והאפיגנטית של קווי iPSC שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הסבה של iPSCs מפיברובלסטים עובריים של עכבר באמצעות טרנסדוקציה לנטיוויראלית.
- אפיון של iPSCs באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית ויצירת גופי עוברים (embryo bodies).
- יצירת בלאסטוציסטות טטרהפלואידיות באמצעות אלקטרו-פיוזיה.
- הזרקת iPSCs לבלאסטוציסטות טטרהפלואידיות לצורך הריון באמה חורגות.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של עכברים בוגרים מ-iPSCs מעידה על פלוּריפוטנטיות מלאה.
- הפרוטוקול מאפשר הפקה הדירה של שורות iPSC.
- בעלי חיים בריאים שהגיעו לגיל בגרות מעידים על יעילותה של שיטת ההשלמה הטטראפלואידית.
- טכניקות אפיון מאשרות את הפלוּריפוטנטיות של שורות iPSC הגזורות.
מסקנות
- הפרוטוקול המתואר הוא כלי בעל ערך עבור חוקרים בביולוגיה של תאי גזע.
- הוא מספק תובנות לגבי היציבות והיישומים הפוטנציאליים של קווי iPSC.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בשיטה זו כדי לבחון טכניקות תכנות מחדש שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מובילה
ביסוס הפלוריפוטנציאליות המלאה של קווי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושאיים (iPSC) מהווה נקודת מפנה קריטית בשלב הגילוי של רפואה רגנרטיבית ומידול מחלות. בדיקת השלמה של עובר טטרהפלואידי (TEC) מספקת את התיקוף התפקודי המחמיר ביותר לפוטנציאל הפיתוח של iPSC, ובכך משפיעה ישירות על הביטחון החזוי ועל הפחתת הסיכונים המכניסטיים עבור יישומים בהמשך התהליך. יצירה אמינה של עכברים המורכבים כולית מ-iPSC מאפשרת מיון יעיל של תיקי פרויקטים ותומכת בקבלת החלטות ברמת הארגון בנוגע לפרוטוקולי תכנות מחדש ובחירת קווי תאים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה קפדנית של הפלוריפוטנציות ויכולת הפיתוח של iPSC.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי אישור היכולת להפיק את כל הרקמות הסומטיות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים של פרוטוקולי תכנות מחדש ומקורי תאי תורמים.
- מספק מדד להשוואת שיטות חדשות להפקה ובחירה של iPSC.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין שורות iPSC עוברות תיקוף לשימוש במבחני בידול in vitro ובבדיקות למידול מחלות.
- מסטנדרט את הערכת הפלוריפוטנציאליות, ובכך משפר את השחזוריות בין צוותי מו"פ.
- מאפשר השוואה כמותית של שורות iPSC בהתבסס על יעילות TEC ותוצאות התפתחותיות.
- תומך בסריקה ניתנת להרחבה (scalable) של שיטות תכנות מחדש לבחירת שורת התאים האופטימלית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים את בחירת קו ה-iPSC לדרישות של ביומרקרים תרגומיים ומודלים רלוונטיים למחלה.
- מבטיח רציפות משלב תיקוף של שלב הגילוי ועד לפיתוח מודלים פרה-קלניים.
- מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים על ידי אישור יציבות גנטית ואפיגנטית in vivo.
- מספק פלטפורמה להערכת פנוטיפים פיזיולוגיים, פתולוגיים והתנהגותיים בעכברי "all-iPSC".
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
בדיקת ה-TEC מציבה את תיקוף ה-iPSC בנקודת המפגש בין גילוי מוקדם, זיהוי מובילים (lead identification) ופיתוח מודלים פרה-קליניים, ובכך משמשת כשומר סף קריטי עבור יישומים המשכיים.
- ביולוגיה של גילוי: מאשר פוטנציאל התפתחותי מלא ותומך בבחירה של קווי iPSC המונחית על ידי היפותזה.
- סריקה: מספקת תוצרים כמותיים (למשל, תפוקת גורים חיים) לצורך ביסום (benchmarking) של פלוריפוטנטיות בין קווים ופרוטוקולים שונים.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של יעילויות תכנון מחדש (reprogramming efficiencies) ותוצאות התפתחותיות.
- מחקר תרגומי: מגשר בין בדיקות פלוריפוטנטיות in vitro לאימות פונקציונלי in vivo לצורך רציפות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה שמימה, בעלת רגישות גבוהה, להערכה שוטפת של קווי iPSC ולאופטימיזציה של פרוטוקולים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ממקסם את הביטחון החזוי במודלים מבוססי iPSC ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: מסנכרן את תיקוף הפלוריפוטנטיות ותומך בתהליכי עבודה הניתנים לשחזור ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go לקידום קווי iPSC ואימוץ פרוטוקולים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של קווי תאים ואסטרטגיות תכנות מחדש עבור צינורות מו"פ מגוונים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות מתקדמת בתרביות תאי גזע, מיקרומניפולציה וטיפול בעובריים.
- נדרשת גישה למכשור ייעודי לאלקטרופיוזן והעברת עובריים.
- נדרש סטנדרטיזציה קפדאית בין צוותים עבור בדיקות פלוריפוטנציה ומדדי תוצאה.
- התאמה למקורות תאים תורמים שונים ולפרוטוקולי תכנות מחדש עשויה להשפיע על היעילות.
- מורכבות טכנית ודרישות הכשרה עשויות להגביל את התפוקה ואת היכולת להרחבה (scalability).
