מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב חיידקי Escherichia באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

מטרת הליך זה היא לחקור את הקשרים התפקודיים בין גנים ומסלולים של חיידקים. זה מושג על ידי הכנת מערכים של ceia coli, זנים מוטנטיים בודדים שיוצמדו או יזדווגו. השלב השני הוא להצמיד את המוטאנטים הבודדים בפורמט מערך על לוחות.

לאחר מכן, המוטציות הכפולות נבחרות. השלב האחרון הוא לדמות את לוחות המוטאנטים הכפולים ולכמת מושבות מוטנטיות כפולות כדי לקבוע את כושר הזן. בסופו של דבר, נתוני גודל המושבה מנותחים כדי לחשב ציוני אינטראקציה גנטית ולזהות גנים, מסלולים ותהליכים הפועלים באינטראקציה תפקודית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מוטגנזה אקראית, הוא שניתן ליצור זנים מוטנטיים כפולים בודדים רבים. יתר על כן, ניתן להעריך את האינטראקציות בין גנים רבים בו זמנית ללא קשר לגודל הגן, חיוניות או התאמה מוטנטית של גן בודד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של המערכות, כגון אלה הנוגעות לתפקודי גנים ודיבור צולב תפקודי בין מסלולים ותהליכים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בזיהומים חיידקיים מכיוון שהידע על רוב הגנים והתהליכים המרכזיים מבחינה תפקודית, כמו גם ההבנה אילו שילובים של גנים, מסלולים ותהליכים חיידקיים כאשר הם מופרעים משפרים או מפחיתים את כושר החיידקים יעזרו לפתח את אסטרטגיות ההתערבות היעילות ביותר כדי להתחיל בפרוטוקול זה. שני שלבים מקוננים. הגברת PCR משמשת להחלפת מסגרת הקריאה הפתוחה של היעד בסמן התנגדות כלורמפניקול מהפלסמיד PKD שלוש כמתואר בנוהל הכתוב.

אשר את המוצר הצפוי ו-PCR לטהר את השבר שהתקבל בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר סילוק תוצר ה-PCR ב-30 מיקרוליטר מים מזוקקים סטריליים יש לדלל לכ-50 מיליגרם לריכוז מיקרוליטר. המוצר המטוהר מאוחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס לפני השינוי.

לאחר מכן, הכינו את התדירות הגבוהה של רקומבינציה או תאים מוכשרים HFR Caval לבניית תורם. ראשית יש לחסן מיליליטר אחד של תרבית לילה רוויה של זן HFR Cavalli לתוך 70 מיליליטר של מדיום LB טרי עם 35 מיקרוליטר של 50 מיליגרם למיליליטר. אמפיצילין בבקבוק של 250 מיליליטר.

דגרו את התרבית ב-32 מעלות צלזיוס על ידי ניעור עדין ב-220 סל"ד עד לקבלת צפיפות אופטית של כ-0.5 עד 0.6. לאחר מכן העבירו את התרבית לאמבט מים לאינדוקציה בחום של מערכת Lambda Red Recombination ב-42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עם ניעור ב-160 סל"ד כדי לעצור את האינדוקציה. העבירו את התרבית לאמבטיית מים קרח צוננת למשך 10 עד 20 דקות ב-160 סל"ד.

הקפידו לשמור על התאים קרים עד לאחר הטרנספורמציה. לאחר שטיפה וקצירת התאים על ידי צנטריפוגה כמתואר בפרוטוקול הכתוב, יש לשפוך את הסנה ולהשעות את הגלולה ב-500 מיקרוליטר קר כקרח, 10% גליצרול Eloqua. התאים בנפחים של 50 מיקרוליטר לצינורות מיקרו צנטרי בודדים מקוררים מראש של 1.5 מיליליטר וממשיכים מיד לטרנספורמציה.

הוסף 100 ננוגרם של מחיקת גנים מטוהרים, קלטת לתאים המוכשרים. החלק את הצינור ואפשר למתלה לשבת על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן העבירו את התרחיף לאלקטרופורציה מקוררת מראש, הפעילו את תערובת התאים מיד.

הוסף מיליליטר אחד של מדיום SOC בטמפרטורת החדר, והעביר את התאים האלקטרופוטיים במדיום לתוך צינור תרבית של 15 מיליליטר. דגרו על התאים ב-32 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת עם טלטול אורביטלי ב-220 סל"ד. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את התאים של 4, 400 פעמים G למשך חמש דקות.

בטמפרטורת החדר, הסר כ-850 מיקרוליטר מהסופינאט והשהה מחדש את כדור התא בנוזל שנותר. מורחים את התאים על לוחות LB המכילים 17 מיקרוגרם למיליליטר, כלורמפניקול ודוגרים בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת הוציא שני שנאים בודדים על לוחות כלורמפניקול LB לאישור מוטציות פס את אותם שנאים על לוחות LB can mycin כדי לאשר שהזנים אינם עמידים בפני מיצין.

לאחר מכן, ה-DNA מוגבר עם שלוש קבוצות שונות של פריימרים לאישור נוקאאוט כמתואר בפרוטוקול הכתוב. ערכת הפריימר הראשונה מורכבת מפריימר של 20 נוקלאוטידים המאגפים קדימה הממוקמים 200 זוגות בסיסים במעלה הזרם של אזור המטרה, ופריימר הפוך, המשלים את קלטת העמידות לכלורמפניקול. הגברה זו צפויה לייצר מגבר 445 נוקלאוטידים.

הסט השני כולל פריימר קדמי, כריעה לרצף קלטות ההתנגדות לכלורמפניקול, ופריימר אישור הפוך, שנועד לכלול 200 זוגות בסיסים במורד הזרם של שלושת הקצוות הראשוניים של הגן שנמחק. תגובת הגברה זו צפויה לייצר מגבר נוקלאוטיד 309. ה-PCR השלישי מכיל פריימרים מאגפים במעלה הזרם ובמורד הזרם.

תגובה זו נדרשת כדי לאשר שהזן שנבחר אינו דיפלואיד מח עם לוקוס גן אחד שהוחלף בקלטת ועותק גן משוכפל אחר, אך עדיין קיים. הגברה זו צפויה לייצר מוצר של 1.4 KB. אוסף המוטנטים היחיד של מחיקת גנים לא חיוניים הוא העתק רובוטי ל-24,384.

ובכן, מיקרופלייט המכיל 80 מיקרוליטר מדיום LB נוזלי לבאר. בתוספת של 50 מיקרוגרם למיליליטר יכול מיצין כדי לפנות מקום לזן בקרת הגבולות, שהיה חסר כבקרה חיובית וסיוע בנורמליזציה של לוחות כמו גם בקוונטיזציה אוטומטית של מושבות. הסר את המדיה המחוסנת מהבארות החיצוניות ביותר של כל צלחת והעביר אותה לצלחות חדשות, והשאיר את הבארות החיצוניות ריקות.

כמו כן, צור נקודות בקרה שליליות על ידי הסרת כל שני זנים ממיקום אחר בתוך כל צלחת והעברת הזנים לצלחת חדשה. לאחר מכן, מלאו את הבארות הריקות, כולל בארות ביקורת הגבולות ובארות הבקרה השליליות במדיה LV המכילה 17 מיקרוגרם למיליליטר כלורמפניקול. נקודות בקרה שליליות אלה צפויות להיות ריקות בנמען ולכן לוחות מוטנטיים כפולים.

הם משמשים כדי להבטיח שלא היו שגיאות עיבוד או טיפול בלוחות בעת מספור הדמיה או הצמדת הלוחות. לאחר הכנת הזן החיובי הגבולי כמתואר בנוהל הכתוב, זני המערך כמו גם הזן החיובי הגבולי גדלים בן לילה ב-32 מעלות צלזיוס עם טלטול אורביטלי של 190 סל"ד למחרת, וממלאים את בארות הגבול בכ-80 מיקרוליטר של תרבית לילה. הלוחות המורכבים עשויים לשמש להזדווגות כמתואר בסעיף הבא.

לחלופין, לאחסון לטווח ארוך, כל באר בצלחות הנמענות מתווספת ב-15% גליצרול והמדיה והגליצרול מעורבבים. לאחר מכן הלוחות מאוחסנים במינוס 80 מעלות צלזיוס. התחל את הליך ההזדווגות על ידי גידול זן תורם HFR, הנושא את מחיקת גן השאילתה המסומנת בקלטת עמידות לכלורמפניקול למשך הלילה ב-32 מעלות צלזיוס במדיום נוזלי עשיר ב-LB עם 17 מיקרוגרם למיליליטר של סיכת כלורמפניקול.

ה-TH הורה על איסוף מוטאנטים של הנמען בצפיפות מושבה של 3,84 על לוחות LB מוצקים. בתוספת 50 מיקרוגרם למיליליטר של פחית מיצין. במקביל הצמד את הזן המוטנטי של שאילתת התורם בצפיפות מושבה של 3 84 על אותו מספר של לוחות LB.

בתוספת 17 מיקרוגרם למיליליטר כלורמפניקול. דגרו את הצלחות למשך הלילה ב-32 מעלות צלזיוס כדי להצמיד את הזנים. הצמד את התורם מ-3 84 צלחות תורם הלילה של המושבה על צלחות LB מוצקות.

לאחר מכן הצמידו את הזנים מצלחת אחת של 3 84 מושבות לילה מעל התורמים הטריים. דגרו את לוחות ההטמיה המוצמדים בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 24 שעות. לאחר מכן, הצמד כל לוחית צימוד בצפיפות 384 על לוחית LB מוצקה אחת המכילה כלורמפניקול.

והאם מיצין יכול לחזור על התהליך הזה עד שכל לוחות ההטמיה יוצמדו? דגרו את צלחות הבחירה הראשונות המוצמדות הטריות למשך 16 עד 36 שעות בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הצמד מחדש כל לוחית בחירה ראשונה ללוחית בחירת תרופות כפולה שנייה בפורמט 1536 SPOT כך שכל מושבת בחירה ראשונה מיוצגת על ידי ארבע מושבות.

על צלחת הבחירה השנייה, דגרו את הצלחות למשך 16 עד 36 שעות. ב-32 מעלות צלם את לוחות הבחירה הכפולים הסופיים כדי למדוד כמותית את כושר הגדילה של המוטאנטים ולנתח את האינטראקציות בין זוגות גנים. מכיוון שגנים באותו מסלול מציגים דפוסי GI בקורלציה הדוקה, ניתן לקבץ גנים הקשורים מבחינה תפקודית על ידי קיבוץ שלהם לפי הדמיון הכולל של פרופילי ציון ה-S שלהם.

הדמיון בפרופיל מערכת העיכול מייצג את ההתאמה של הפנוטיפים עם מוטציה של שני גנים ואמור להצביע אם שני הגנים פועלים באותו מסלול או חופף. מוצגת כאן התפלגות מקדמי המתאם בין פרופילי ה-GI של זוגות גנים המקודדים חלבונים המקיימים אינטראקציה פיזית לעומת זוגות גנים שנמשכו באופן אקראי. דוגמה לתרשים פיזור של פרופילים גנטיים מתואמים עבור שני טרנספורטרים היוצרים קומפלקס הטרוטרימרי הנדרש להפרשת זרע מוצגת כמו עם הצגת גן אקוליין שמרים.

הקלה על אינטראקציות עם פרופילי GI בקורלציה גבוהה נוטה לקודד מסלולים הקשורים פיזית או הפועלים באופן קוהרנטי במסלול ביוכימי משותף. כאן מוצגת דוגמה מייצגת שבה מרכיבי מסלולי הביוסינתזה של גופרית ברזל ISC ו-SUF המיותרים מבחינה תפקודית, המשתתפים במשותף בתהליך חיוני יוצרים אשכולות נפרדים המקושרים זה לזה על ידי אינטראקציות מחמירות נרחבות. ניתן להשתמש במדד סטטיסטי כדי למצוא העשרה משמעותית לאינטראקציות בין שילובים ספציפיים של מסלולים, אינטגרציה של רשתות GI עם אינטראקציות פיזיות ונתוני אסוציאציות פונקציונליות אחרות, כגון הקשר גנומי.

קשרים יכולים לחשוף את הארגון של מודולים פונקציונליים מסדר גבוה יותר המגדירים מערכות ביולוגיות מרכזיות בחיידקים. ניתן ליישם ניתוח אשכולות גם על רשתות GI כדי לחזות את הפונקציות של גנים מבוארים. מכיוון שאלגוריתמי אשכולות משתנים.

עם זאת, הקצאות פונקציונליות משוערות שנקבעו באמצעות אשכולות דורשות אימות ניסיוני עצמאי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לכלול את כל החיובי והשלילי הדרושים בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו פרוטאומיקה, ניסויי מעקב ביוכימיים וגנומיקה כימית על מנת לענות על שאלות נוספות על תפקודי גנים ספציפיים כמו גם על אופי היחסים התפקודיים בין גנים ומסלולים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבנות זנים מוטנטיים כפולים, להרכיב מערכי נמענים ולבצע מסכי ESGA לחקירת הקשרים התפקודיים בין גנים ותהליכים באי קולי.