מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב

מטרת פרוצדורה זו היא לחקור את הקשרים התפקודיים בין גנים ומסלולים בקטריאליים. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת מערכים של ceia coli, זני מוטציה בודדת שיעברו קוניוגציה או הזיווג. השלב השני הוא ביצוע קוניוגציה של המוטנטים הבודדים בפורמט של מערך על פלטות.

בשלב הבא, נבצעו ברירה של המוטנטים הכפולים. השלב הסופי הוא הדמיה של צלחות המוטנטים הכפולים וכמתית של מושבות המוטנטים הכפולים כדי לקבוע את כשירות הזן. לבסוף, ננתחו את נתוני גודל המושבות כדי לחשב ציוני אינטראקציה גנטית ולזהות גנים, מסלולים ותהליכים בעלי אינטראקציה תפקודית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מוטגנזה אקראית, הוא שניתן ליצור זנים רבים של מוטנטים כפולים בודדים. יתרה מכך, ניתן להעריך בו-זמנית את האינטראקציות בין גנים רבים ללא קשר לגודל הגן, חיוניותו או כושר ההישרדות (fitness) של מוטנט הגן הבודד. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה של המערכות, כגון שאלות הנוגעות לתפקודי גנים ולדיאלוג תפקודי (crosstalk) בין מסלולים ותהליכים.

להשלכות של טכניקה זו יש חשיבות עבור טיפול בזיהומים חיידקיים, מכיוון שידע על מרבית הגנים והתהליכים המרכזיים מבחינה תפקודית, כמו גם הבנה אילו שילובים של גנים, מסלולים ותהליכים חיידקיים משפיעים בשיבושם על שיפור או הפחתה של הכושר של החיידק (bacterial fitness), יעזרו בפיתוח אסטרטגיות ההתערבות היעילות ביותר. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בהגברה ב-PCR מקונן בשני שלבים כדי להחליף את מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של המטרה בסימון עמידות לכלורמפניקול מהפלסמיד PKD3, כפי שמתואר בהליך הכתוב.

יש לאשש את המוצר הצפוי ולבצע טיהור PCR של המקטע שהתקבל בהתאם לפרוטוקול היצרן. לאחר אלואציה של תוצר ה-PCR ב-30 µL של מים מזוקקים סטריליים, יש לדלל אותו לריכוז של כ-50 mg/µL. את המוצר המטוהר יש לאחסן בטמפרטורה של 20°C- לפני ביצוע הטרנספורמציה.

בשלב הבא, הכינו תאי Caval kompetent בעלי תדירות רקומבינציה גבוהה (HFR) לצורך בניית התורם. ראשית, תחילו מיליליטר אחד של תרבית רוויה שגדלה באופן לילה בזן ה-HFR Cavalli לתוך 70 מיליליטר של מצע LB טרי עם 35 µL של Ampicillin בריכוז 50 mg/mL בבקבוק של 250 מיליליטר.

דגרו את התרבית בטמפרטורה של 32 °C תוך ניעור עדין ב-220 RPM עד להשגת צפיפות אופטית של כ-0.5 עד 0.6. לאחר מכן, העבירו את התרבית למקלח מים לצורך השראה תרמית של מערכת הרקומבינציה Lambda Red בטמפרטורה של 42 °C למשך 15 דקות עם ניעור ב-160 RPM כדי להפסיק את ההשראה. העבירו את התרבית למקלח מים עם קרח גרוס למשך 10 עד 20 דקות ב-160 RPM.

יש לוודא שהתאים נשמרים בקירור עד לאחר הטרנספורמציה. לאחר שטיפה ואיסוף של התאים על ידי סנטריפוגציה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, יש לשפוך את הנוזל ולהמיס מחדש את המשקע ב-500 µL של Eloqua עם 10% glycerol קר מאוד. יש לחלק את התאים לנפחים של 50 µL לתוך מבחנות מיקרו-סנטריפוגה של 1.5 mL שקוללו מראש, ולהמשיך מיד לטרנספורמציה.

הוסף 100 nanograms של קסטת מחיקת גן מטוהרת לתאים הקומפטנטיים. נער את המבחנה בתנועות קלות (Flick) והשאר את התוך על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן, העבר את התוך למבחנת אלקטרופורציה שקוללה מראש ובצע אלקטרופורציה לתערובת התאים באופן מיידי.

הוסיפו 1 mL של מצע SOC בטמפרטורת החדר, והעבירו את התאים שעברו אלקטרופורציה בתוך המצע למבחנת תרבית של 15 mL. דגרו את התאים בטמפרטורה של 32 °C למשך שעה אחת תוך ניעור אורביטלי ב-220 RPM. לאחר הדגירה, סנטריפוגו את התאים ב-4,400 ×g למשך חמש דקות.

בטמפרטורת החדר, הסירו כ-850 µL מהנוזל העליון (supernatant) ותלו את משקע התאים בנוזל שנותר. פזרו את התאים על צלחות LB המכילות 17 µg/mL chloramphenicol והדגירו בטמפרטורה של 32 °C למשך לילה. למחרת, בצעו מריחה של שני טרנספורמנטים בודדים על צלחות LB chloramphenicol לאישור המוטציה; בצעו מריחה של אותם טרנספורמנטים על צלחות LB kanamycin כדי לוודא שהזנים אינם עמידים ל-kanamycin.

בשלב הבא, ה-DNA מועשר באמצעות שלושה סטים שונים של פריימרים לאישור נשקיות (knockout), כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. סט הפריימרים הראשון כולל פריימר קדמי שולי (flanking forward primer) של 20 נוקלאוטידים הממוקם 200 זוגות בסיסים במעלה הזרם (upstream) מהאזור הממוקד, ופריימר אחורי המשלימי לקסטת העמידות לכלורמפניקול. הגברה זו צפויה להניב אמפליקון של 445 נוקלאוטידים.

הסט השני כולל פריימר קדמי (forward primer), הנצמד לרצף קסטת העמידות לכלורמפניקול, ופריימר אישור אחורי (reverse flanking confirmation primer), שתוכנן להגיע ל-200 זוגות בסיסים במורד הקצה ' שלו של הגן שנמחק. תגובת הגברה זו צפויה להפיק אמפליקון של 309 נוקלאוטידים. ה-PCR השלישי מכיל פריימרים פלנקינג (flanking primers) הן במעלה הזרם והן במורד הזרם.

תגובה זו נדרשת כדי לאשר שהזן שנבחר אינו דיפלואיד של חוט השדרה שבו לוקוס גן אחד הוחלף על ידי הקסטה, אך עותק גן אחר המשוכפל, שמעבר לכך הוא מסוג פרא, עדיין נוכח. הגברה זו צפויה להניב תוצר של 1.4 KB. אוסף מוטנטים של מחיקה של גן בודד שאינו חיוני מ-e coli ke io הועתק באופן רובוטי ל-24 384.

מלאו מיקרופלטה ב-80 µL של מצע LB נוזלי לכל באר. הוסיפו 50 µg/mL של קנמיצין כדי לפנות מקום עבור זן ביקורת השוליים, אשר שימש כביקורת חיובית ועזר בנרמול הפלטה ובכימות אוטומטי של מושבות. הסירו את המצע המוחדר מהבארה החיצוניות ביותר של כל פלטה והעבירו אותו לפלטות חדשות, תוך השארת הבארה החיצוניות ביותר ריקות.

באופן דומה, צרו נקודות ביקורת שליליות על ידי הסרת כל שני זנים ממיקום שונה בתוך כל צלחת והעברת הזנים לצלחת חדשה. לאחר מכן, מלאו את הבארות הריקות, כולל בארות ביקורת השוליים ובארות הביקורת השליליות, במצע LV המכיל 17 micrograms per milliliter של chloramphenicol. נקודות ביקורת שליליות אלו צפויות להיות ריקות במקבל ובשלב זה גם בצלחות המוטנטים הכפולים.

הן משמשות כדי להבטיח שלא חלו שגיאות בעיבוד או בטיפול בלוחיות בעת מספורן, דימוין או סימנונן. לאחר הכנת זן הביקורת החיובית בשוליים כפי שמתואר בנוהל הכתוב, מזקינים את זני המערך ואת זן הביקורת החיובית למשך לילה בטמפרטורה של 32 °C עם ניעור אורביטלי ב-190 RPM; למחרת, ממלאים את בארות השוליים בכ-80 µL מתרבית הלילה. ניתן להשתמש בלוחיות המורכבות לביצוע הזיווג כפי שמתואר בסעיף הבא.

לחלופין, לאחסון לטווח ארוך, כל באער בפלטות המקבלות מועשר ב-15% glycerol והמדיום וה-glycerol מעורבבים. לאחר מכן, הפלטות מאוחסנות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. יש להתחיל את הליך ההזדווגות על ידי גידול של זן התורם HFR, הנושא את מחיקת הגן הנחקר המסומנת בקסטת עמידות ל-chloramphenicol, למשך לילה בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס במדיום נוזלי עשיר LB עם 17 micrograms per milliliter של chloramphenicol pin.

העבירו את אוסף מוטנטים המקבלים שהוזמן מ-TH בצפיפות של 384 מושבות על גבי פלטות LB מוצקות, המועשרות ב-50 µg/mL של kanamycin. במקביל, העבירו בעזרת פין את זן מוטנט השאילתה התורם בצפיפות של 384 מושבות על מספר זהה של פלטות LB.

מועשר ב-17 µg/mL של chloramphenicol. דגרו את הצלחות לילה שלם ב-32 °C כדי להשיג צימוד של הזנים. העבירו את התורם מתוך צלחות התורמים עם 84 מושבות שדגרו לילה שלם אל צלחות LB מוצקות.

לאחר מכן, העבירו באמצעות פין את הזנים מלוח מקבל בודד של 384 מושבות שגדל באופן לילה מעל התורמים שהועברו זה עתה. דגרו את לוחות הקונזוגציה שהועברו בפין בטמפרטורה של 32 degrees Celsius למשך 16 עד 24 שעות. לאחר מכן, העבירו בפין כל לוח קונזוגציה בצפיפות של 384 ללוח LB מוצק בודד המכיל chloramphenicol.

ניתן לחזור על תהליך זה עד שכל צלחות הקונג'וגציה יעברו דגימה. דגרו את צלחות הבחירה הראשונות שנדגמו זה עתה למשך 16 עד 36 שעות בטמפרטורה של 32 °C. לאחר הדגירה, דגמו שוב כל צלחת בחירה ראשונה אל צלחת בחירה שנייה עם כפל תרופות בפורמט 1536 SPOT, כך שכל מושבה מהבחירה הראשונה תיוצג על ידי ארבע מושבות.

בצלחת הברירה השנייה, דגרו את הצלחות למשך 16 עד 36 שעות. בטמפרטורה של 32 °C צלמו את צלחות הברירה הסופיות של המוטנטים הכפולים כדי למדוד כמותית את כשירות הגדילה של המוטנטים ולנתח את האינטראקציות בין זוגות הגנים. כיוון שגנים באותו מסלול מראים דפוסי GI בעלי מתאם הדוק, ניתן לקבץ גנים הקשורים תפקודית על ידי הצמדתם בהתאם לדמיון הכללי של פרופילי ה-S score שלהם.

דמיון פרופיל ה-GI מייצג את התאימות של הפנוטיפים בעקבות מוטציה של שני גנים, ואמור להוות אינדיקציה לשאלה האם שני הגנים פועלים במסלול זהה או חופף. מוצגת כאן התפלגות מקדמי המתאם בין פרופילי ה-GI של זוגות גנים המקודדים לחלבונים בעלי אינטראקציה פיזית, לעומת זוגות גנים שנבחרו באופן אקראי. דוגמה לתרשים פיזור של פרופילים גנטיים מתואמים עבור שני נשאי חומרים (transporters) היוצרים קומפלקס הטרוטרימרי הדרוש להפרשת זרע מוצגת כפי שמוצג עבור גן yeast ecoline.

אינטראקציות מקלות עם פרופילי GI בעלי קורלציה גבוהה נוטות לקודד מסלולים הקשורים פיזית או הפועלים באופן קוהרנטי במסלול ביוכימי משותף. כאן מוצגת דוגמה מייצגת שבה רכיבי מסלולי הביוסינתזה של ברזל-גופרית ISC ו-SUF, שהם רדונדנטיים תפקודית ומשתתפים יחד בתהליך חיוני, יוצרים אשכולות נפרדים המקושרים ביניהם על ידי אינטראקציות מחמירות נרחבות. ניתן להשתמש במדד סטטיסטי כדי למצוא העשרה משמעותית כלשהי של אינטראקציות בין שילובים ספציפיים של מסלולים, אינטגרציה של רשתות GI עם אינטראקציות פיזיות ונתוני קישור תפקודיים אחרים, כגון הקשר גנומי.

קשרים עשויים לחשוף את הארגון של מודולים פונקציונליים מסדר גבוה המגדירים מערכות ביולוגיות ליבתיות בחיידקים. ניתן להחיל ניתוח אשכולות (Cluster analysis) גם על רשתות של איים גנומיים (GI) כדי לחזות את התפקודים של גנים מאויינים. מכיוון שאלגוריתמי האשכולה משתנים.

עם זאת, השיוכים התפקודיים המשוערים שנקבעו באמצעות קיבץ (clustering) דורשים אישור ניסיוני עצמאי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לכלול את כל הביקורות החיוביות והשליליות הדרושות בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כגון פרוטאומיקה, ניסויי מעקב ביוכימיים וגנומיקה כימית כדי לענות על שאלות נוספות לגבי תפקודי גנים ספציפיים וכן לגבי אופי הקשרים התפקודיים בין גנים ומסלולים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן בניית זני מוטנט כפולים, הרכבת מערכי מקבלים (recipient arrays) וביצוע סריקות ESGA לבחינת הקשרים התפקודיים בין גנים ותהליכים ב-e coli.