תהליך המפלצת הירוקה לדור של זני שמרי נשיאת מחיקות Gene מרובות

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק זני שמרים הנושאים מחיקות מרובות המסומנות על ידי גן דגל של חלבון פלואורסצנטי ירוק. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת מוטנטים בודדים הפלואידיים המכונה "pro monsters", שכל אחד מהם נושא קסטת מחיקה של GFP במקום אחד מהגנים המטרה. השלב השני הוא מיון המחיקות באמצעות הזיווג והפרייה של זני השמרים, תוך שימוש בשתי קבוצות של סמני ברירה דיפלואידיים והפלואידיים המכונות GM toolkit A ו-GM toolkit alpha, אשר נמצאים גם הם בזני ה-pro monster.

בשלב הבא, תאים בעלי פלואורסצנציה גבוהה נבחרים מתוך האוכלוסייה המיוטית באמצעות ציטומטריה של זרימה (flow cytometry) כדי להעשיר זנים הנושאים שתי מחיקות. השלב הסופי הוא אישור הגנוטיפים של הזנים הממוינים. בסופו של דבר, סבבים חוזרים של השבחה באמצעות הזדווגות והעשרה בציטומטריה של זרימה, החל עם הזנים שהתקבלו, מובילים ליצירת זנים בעלי מספר רב יותר של מחיקות.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטת ה-G לשימוש חוזר בסמנים ומחיקה רצפית של גנים, הוא שניתן להשיג מספר מחיקות במחזור אחד, מה שמוביל להרכבה מהירה יותר של מוטנטים מרובי-גנים. לאחר יצירת ה-pro monsters כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף לסרטון זה, התחל את המחזור המיני על ידי הכנת תרביות של זני מחיקת ה-GFP pro monster המבוססים בתוך מבחנה מסוג Eppendorf בנפח 1.6 מיליליטר. הכן זן מחיקה מסוג הזיווג A ב-100 µL של מצע סינתטי מלא חסר היסטמין, המכונה מצע minus his. כמו כן, הכן זן מחיקה מסוג הזיווג alpha ב-100 µL של מצע סינתטי מלא חסר לוסין, או מצע minus lu, במבחנה מסוג Eppendorf בנפח 1.6 מיליליטר לצורך חילופי אוויר.

ביצעו חורים בפקקי המבחנות באמצעות סיכה שעובדה ב-70%ethanol. סובבו את המבחנות באופן אופקי בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך הלילה. ציר הסיבוב חייב להיות מקביל לציר האורכי של המבחנה.

בהערכה לפי צפיפות אופטית, ערבבו בערך 250,000 תאים haplo ו-250,000 תאים alpha haplo מזני GFP deletion בתוך מבחנת Eppendorf בנפח 1.6 מיליליטר. מספר תאים זה תואם בדרך כלל לשבעה µL מכל תרבית לילה, לאחר ערבוב ב-vortex. הכינו את התאים על ידי סבוב ראשוני בצנטריפוגה ב-800 G למשך שתי דקות.

לאחר הסרת ה-supinate, צרו חור במכסה באמצעות סיכה שעברה טיפול ב-70% ethanol. כדי לאפשר חילוף אוויר, הוסיפו 50 µL של מצע YPDA, ולאחר vortex מהיר, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-800 G למשך חמש דקות. לאחר מכן, הניחו את המבחנה בתוך תיבה לחה שהוכנה מקופסת טיפים ריקה, מעמד טיפים קטן ומגבון נייר רטוב.

דגרו את הקופסה למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C. העבירו 10 µL מתערובת ההכלאה ל-500 µL מצע GNA ללא אגר המכיל את האנטיביוטיקה G 4 1 8 ו-nat, לתוך מבחנה תרבית של 5 mL עם מכסה רופף; הצפיפות האופטית ההתחלתית ב-600 nm היא בערך 0.1. סובבו את התרבית בטמפרטורה של 30 °C למשך 24 שעות.

דבר זה מאפשר בחירה של דיפלואידים, מכיוון שרק דיפלואידים המכילים הן את MX4 בערכת GM toolkit A והן את nat MX4 בערכת GM toolkit Alpha יכולים לגדול בנוכחות של G418 ו-Nat. העבירו 20 µL מתרבית בת יום ל-500 µL של מצע GN טרי המכיל G418 ו-Nat. הצפיפות האופטית ההתחלתית ב-600 nm היא בערך 0.2.

סובב את המבחנה בטמפרטורה של 30 °C למשך חמש שעות כדי להביא את התאים לשלב הלוגריטמי. כדי לסנכרן את הדיפלואידים ולהבדיל את הספורות, פעל לפי הנוהל המתואר בפרוטוקול הכתוב.

המשיכו בפיצול של תרחיף התאים הקשורים ל-SPO לשני חלקים של 300 µL והעבירו כל חלק למבחנה נפרדת מסוג 1.5 mL. צנטריפוגו את המבחנות ב-800 G למשך חמש דקות. לאחר הסרת העל-מצוף, צרו חור במכסה של כל מבחנה.

בעזרת פיפט, הוסף 100 µL של מצע minus his למשקע באחד השפופרות. כדי לבחור haplos מסוג PT בשפופרת השנייה, הוסף 100 µL של מצע minus loo. כדי לבחור alpha haplos.

סובבו את המבחנות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך הלילה. הצפיפות האופטית הסופית ב-600 nanometers צריכה להיות נמוכה מ-0.5. אם הצפיפות האופטית ב-600 nanometers נוטה להיות גבוהה מדי, בצעו תרסול בטמפרטורת החדר.

כדי להשרות את ה-GFP, הוסיפו 100 µL של מצע fresh minus hiss או minus LU טרי המכיל 20 µg/mL doxycycline למאבקים השונים. הריכוז הסופי של doxycycline הוא 10 µg/mL. ערבבו את המבחנה ב-Vortex והסיבבו בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים.

כדי להתחיל את הציטומטריה עם זרימה, הוסיפו 900 µL של באפר TE מסונן מראש לשפופרת פוליפרופילן של 5 mL, כאשר המכסה הוחלף במכסה עם מסננת תאים משפופרת פוליסטירן של 5 mL. שפופרות פוליפרופילן מתאימות לציטומטריה עם זרימה. המכסה עם המסננת נדרש לצורך הסרת חלקיקים גדולים.

הניחו בעדינות 75 µL מהבופר על מכסה מסנן התאים. הוסיפו 25 µL מהתאים המושרים לתמיסה שעל המכסה, תוך כדי לחיצה של קצה הפפטה אל מול הרשת. דחפו את כל התמיסה המשולבת דרך המסנן.

לחצו על מכסה המסנן וערבלו את המבחנה במיקסר (vortex). הכינו את מבחנות האיסוף, מבחנות fendor בנפח 1.6 milliliter הממולאות ב-200 microliters של מצע minus hiss או minus lube. הפעילו את ממיאנם התאים (cell sorter) וכווןנו את ההגדרות בהתאם למדריך היצרן.

שקשקו (Vortex) את מבחנות האיסוף כדי לצפות את הדפנות במצע. כמו כן, שקשקו את המבחנה המכילה את התאים לפני טעינתם לממיין התאים. רכשו נתוני ציטומטריה של זרימה של הדגימה.

זן ללא GFP יכול לשמש כביקורת שלילית. הגדירו שערים למיון כדי להימנע מצבורי תאים, שעלולים להפגין עוצמת GFP גבוהה. השמיכו חריגים עם רוחב פולס או שטח פולס גדולים באופן לא פרופורציונלי עבור פיזור קדמי (Forward Scatter), המסומן כ-FSC, באמצעות תרשים של רוחב הפולס וגובה הפולס, או תרשים של שטח ה-FSC וגובה ה-FSC.

מכיוון שצפוי FSC גבוה עבור אגרגטים של תאים, יש לבחור רק תאים ב-20% התחתונים של ה-FSC. הימנע מאזורים עם הערכים הנמוכים ביותר של FSC ופיזור צדי או SSC, שבהם נמצאים לעיתים קרובות שיירי תאים. אות ה-SSC ואות ה-GFP נמצאים לרוב במתאם חיובי.

כדי למנוע העשרה של תאים בעלי ערך SSC גבוה יותר, יש לסמן שער (gate) לאורך פרימטר האוכלוסייה באמצעות תרשים של עוצמת GFP ו-SSC, וזאת כדי לדגום אחוז דומה של התאים הזוהרים ביותר מכל נקודה לאורך ציר ה-SSC באופן כולל. יש לסמן למיון 0.1% עד 1% מהתת-אוכלוסייה שנבחרה באמצעות שערי FSC ו-SSC לפני שלב זה, ולמיין 200 תאים אל מבחנת האיסוף. יש לנער את מבחנת האיסוף במכשיר vortex כדי לכסות את התאים הממוינים במדיום, ולאחר מכן להעביר לצלחת גידול.

תת-קבוצה של תאים על מצע A-Y-P-D-A לצורך גנוטייפינג. דגרו את המצע בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים לאחר ההדגרה. הכינו ליזט עבור כ-12 מושבות.

פעלו לפי השלבים המפורטים בפרוטוקול הכתוב לגנוטיפיקה. נתחו מיקרוליטר אחד של ליזאט מדולל באמצעות תגובת PCR של 10 מיקרוליטר עם פריימר קדמי. פריימר זה נקשר לאזור השוליים שמעלה (upstream) של כל גן שנמחק, ומצומד לפריימר משותף הנקשר בתוך כל אתרי המחיקה.

ניתן לבצע את ה-PCR בפורמט של 96 או 384 בארות. לאחר ההגברה, יש לנתח את תוצרי ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה.

זהו את ההפלו-טיפים (haplos) שסביר להניח שיש להם את הגנוטיפים הרצויים. העבירו זנים אלו לצלחת חדשה. בנוסף, הקפיאו אותם ב-25% glycerol בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.

מומלץ לבצע בדיקות נוספות, כגון אישור היעדרויותן של רצפי סוג בר (wild type) עבור גנים שנמחקו, וביצוע אלקטרופורזה של ג'ל שדה (field gel electrophoresis). יש לחזור על מחזורי ההחלפה המינית עם זנים יעילים. צאצאים הפלואידיים מהכלאה של שני זנים הונחו לבטא GFP.

בכל מחיקת גן נעשה שימוש בקסטת GFP; באמצעות שערים (gates) בציטומטר זרימה, נבחרה אוכלוסייה של התאים שהתקבלו. סביר להניח שבאוכלוסייה זו לא יהיו שרידים או צברי תאים. 1% מהתאים בעלי העוצמה הגבוהה ביותר מויו בסדר (sorted) ונשמרו על ידי הגדרת שערים לתאים על בסיס שטח הפיזור קדימה (forward scatter area) וגובה הפיזור קדימה (forward scatter height).

מקבצי תאים, הנוטים להפגין שטח פיזור קדמי (forward scatter) גדול באופן לא פרופורציונלי, הוצאו; תאים שסוננו על בסיס פיזור קדמי ופיזור צדי (side scatter) בטווח של 20% התחתון בפיזור הקדמי התקבלו, בעוד שפסולת מהיום הוצאה על ידי סינון התאים על בסיס פיזור צדי ואות GFP הנמוכים ביותר בפיזור הקדמי והצדי. התאים הפלואורסצנטיים יותר מבין אלו שבטווח פיזור צדי נתון נבחרו כדי לאפשר השוואה בין התערובת המיוטית לבין דגימת הביקורת השלילית שאינה מבטאת GFP. GA זהה לזה ששימש לבחירת אוכלוסיית P three מוצג בדיאגרמה. תאים שנבחרו באופן דומה מהביקורת השלילית ב-haplos נפרד נותחו באמצעות PCR לאחר שהודו להביע GFP וסוננו על בסיס פלואורסצנציה. מספר המחיקות הצפוי עבור תא שלא עבר מיון כתוצאה מסגריגציה אקראית היה 7.5.

בניסוי ספציפי זה, לתאים הממוינים היה מספר מחיקות ממוצע של 8.8 פלוס או מינוס 0.3, כולל חמישה תאים שהכילו 10 מחיקות. גנוטיפ DO. מיון זני PCL בוצע באמצעות פריימר הפוך.

הפריימר That 10 נקשר לאזור השכבה (flanking region) במורד הזרם, בשילוב עם פריימר קדמי. הפריימר That 10 נקשר לקצה הקסטה. נוכחות של פס บיטוי מעידה על נוכחות קסטת ה-GFP.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו משתמשים בשיטת ה-green Monster כדי להנדס מחיקות (deletions) בשמרים.