Name: תהליך המפלצת הירוקה לדור של זני שמרי נשיאת מחיקות Gene מרובות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-15T15:03:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: למדו את שיטת Green Monster להנדסת שמרים עם מחיקות גנים מרובות באמצעות GFP וציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת הרכבה יעילה של זני שמרים לחקר גנטיקה ומניפולציה גנטית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי חוזה ההגנה האמריקנית המחקר המתקדם פרויקטי סוכנות N66001-12-C-4039 לי&quot;ש, מענק של פ אלפרד סלואן הקרן לRSL, והמוסד אמריקאי הלאומי לבריאות מענקי R01 HG003224 וR21 CA130266 לFPRFPR היה גם נתמך על ידי מלגה מהמכון הקנדי למחקר מתקדם ועל ידי תכנית מחקר כיסאות אקסלנס קנדה.

<ol><li>Tong, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+STKE%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science's STKE. 294, 2364-23 (2001).</li>
<li>Hillenmeyer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320, 362-365 (2008).</li>
<li>Beh, C. T., Cool, L., Phillips, J., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+functions+of+the+yeast+oxysterol-binding+protein+homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Overlapping functions of the yeast oxysterol-binding protein homologues.</a> Genetics. 157, 1117(2001).</li>
<li>Wieczorke, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+knock-out+of+at+least+20+transporter+genes+is+required+to+block+uptake+of+hexoses+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS letters. 464, 123-128 (1999).</li>
<li>Alani, E., Cao, L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+gene+disruption+that+allows+repeated+use+of+URA3+selection+in+the+construction+of+multiply+disrupted+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains.</a> Genetics. 116, 541-545 (1987).</li>
<li>Akada, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+seamless+gene+deletion+and+marker+recycling+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated seamless gene deletion and marker recycling in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 399-405 (2006).</li>
<li>Guldener, U., Heck, S., Fielder, T., Beinhauer, J., Hegemann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+efficient+gene+disruption+cassette+for+repeated+use+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast.</a> Nucleic acids research. 24, 2519(1996).</li>
<li>Delneri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+redundancy+in+the+yeast+genome%3A+an+improved+strategy+for+use+of+the+cre-loxP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Exploring redundancy in the yeast genome: an improved strategy for use of the cre-loxP system.</a> Gene. 252, 127-135 (2000).</li>
<li>Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+site-directed+mutagenesis+using+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides.</a> Nat. Biotech. 19, 773-776 (2001).</li>
<li>Noskov, V. N., Segall-Shapiro, T. H., Chuang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+repeat+coupled+with+endonuclease+cleavage+%28TREC%29%3A+a+seamless+modification+tool+for+genome+engineering+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tandem repeat coupled with endonuclease cleavage (TREC): a seamless modification tool for genome engineering in yeast.</a> Nucl. Acids Res. 38, 2570-2576 (2010).</li>
<li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knocking+out+multigene+redundancies+via+cycles+of+sexual+assortment+and+fluorescence+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Knocking out multigene redundancies via cycles of sexual assortment and fluorescence selection.</a> Nat. Methods. 8, 159-164 (2011).</li>
<li>Winzeler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Characterization+of+the+S.+Genome+by+Gene+Deletion+and+Parallel+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional Characterization of the S. Genome by Gene Deletion and Parallel Analysis.</a> Science. 285, 901-906 (1999).</li>
<li>Woods, R. A., Gietz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+plasmid+DNA+into+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of plasmid DNA into yeast.</a> Methods Mol. Biol. 177, 85-97 (2001).</li>
<li>Hughes, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+aneuploidy+revealed+by+DNA+microarray+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread aneuploidy revealed by DNA microarray expression profiling.</a> Nature. 25, 333-337 (2000).</li>
<li>Goldstein, A. L., McCusker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+new+dominant+drug+resistance+cassettes+for+gene+disruption+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 15, 1541-1553 (1999).</li>
<li>Newman, J. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+analysis+of+S.+cerevisiae+reveals+the+architecture+of+biological+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise.</a> Nature. 441, 840-846 (2006).</li>
<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962(2005).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

כפי שפתחנו את גישת המפלצת הירוקה, שהעסקנו אותנו לאפשרות של רקומבינציה בין קלטות החלפת GFP שונות, שהוביל לארגון מחדש הגנום. מקלים נגד האפשרות הזאת הוא הבחירה שלנו לתאים שעברו סבבים רבים של הזדווגות ומיוזה בהצלחה. תאים הנושאים הגנום סודר מחדש צפויים להיות בכושר ירוד לאחר הזדווגות לתאים בלי סידור מחדש זהה. ואכן, אנו לא צופים כל חוסר יציבות הגנום כתוצאה מרקומבינציה בין קלטות GFP 11. עם זאת, אנחנו לא יכולים לשלול לחלוטין את האפשרות הזאת, ולכן מומלץ שמשתמשת לבדוק את הזנים שנו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שמו של המגיב או המכשיר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> G418 </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> A1720 </td><td> מתמוסס במים ומסננים לעקר (מסנן 0.2-מיקרומטר). ריכוז המלאי: 200 מ&quot;ג / מ&quot;ל. לאחסן ב 4 ° C. </td></tr><tr><td> ClonNAT (nourseothricin) </td><td> Bioagents רנר </td><td> 5001000 </td><td> מתמוסס במים ומסננים לעקר (מסנן 0.2-מיקרומטר). ריכוז המלאי: 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל. לאחסן ב 4 ° C. </td></tr><tr><td> דוקסיציקלין </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> D9891 </td><td> להמס באתנול 50% ולסנן-לעקר (מסנן 0.2-מיקרומטר). ריכוז המלאי: 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל. הפוך טרי מדי ארבעה שבועות. חומה מאור עם רדיד אלומיניום ולאחסן ב 4 ° C. </td></tr><tr><td> Zymolyase </td><td> ZymoResearch </td><td> E1005 </td><td></td></tr><tr><td> Difco בסיס w / o חומצות אמין חנקן שמרים </td><td> BD </td><td> 291940 </td><td></td></tr><tr><td> (מסובב לצינורות) אקדח </td><td> Labnet </td><td> H5600 </td><td></td></tr><tr><td> יחידת אלקטרופורזה XL ג&#39;ל אנדורו </td><td> Labnet </td><td> E0160 </td><td></td></tr><tr><td> Sonifier 450 </td><td> ברנסון </td><td> 101-063-198 </td><td></td></tr><tr><td> Microtip לSonifier 450 </td><td> ברנסון </td><td> 101-148-062 </td><td></td></tr><tr><td> סדרן התא FACSAria </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> סדרן התא MoFlo </td><td> Beckman-קולטר </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX או רובוט מקביל </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> אופציונלי. להקמת PCRs genotyping. </td></tr></tbody> &lt;/ שולחן&gt;

תהליך המפלצת הירוקה לדור של זני שמרי נשיאת מחיקות gene מרובות

The Green Monster Process for the Generation of Yeast Strains Carrying Multiple Gene Deletions

פנוטיפים למחיקת גן לעתים קרובות מתגלים רק כאשר המוטציה נבדקת ברקע גנטי מסוים או 1,2 תנאי הסביבה. ישנן דוגמאות שבו גנים רבים זקוקות למחיקה לחשוף פונקציות גנים נסתרות 3,4. למרות הפוטנציאל לתגליות חשובות, אינטראקציות הקשורים בשלושה או יותר גנים נחקרו במידה רבה. חיפושים הממצים של אינטראקציות מרובות מוטציה יהיו מעשיים בשל המספר העצום של צירופים אפשריים של מחיקות. עם זאת, מחקרים של קבוצות נבחרות של גנים, כגון ערכות של paralogs עם יותר סיכוי מראש של שיתוף פעולה משותפת, יהיו אינפורמטיבי. בcerevisiae Saccharomyces השמרים, נוקאאוט הגן מושג על ידי החלפת גנים עם סמן בחירה באמצעות רקומבינציה הומולוגית. מכיוון שמספר הסמנים הוא מוגבל, פותחו שיטות להסרה ושימוש חוזר בסם<html> סמן הדואר 5,6,7,8,9,10. עם זאת, ברצף מוטציות רבות הנדסיות באמצעות שיטות אלה הן זמן רב משום שהזמן דרוש ליניארית קשקשים עם מספר המחיקות להיות שנוצר. כאן אנו מתארים שיטת המפלצת הירוקה להנדסת מחיקות מרובות באופן שגרתי בשמרי 11. בשיטה זו, כתב חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שולב מחיקות משמש לכמותית זני תווית בהתאם למספר של מחיקות כלולות בכל מאמץ (איור 1). סיבובים חוזרים ונשנים של מבחר של GFP-מסומנים מחיקות באמצעות הזדווגות שמרים ומיוזה יחד עם העשרת הזרימה cytometric של זנים נושאים יותר של המחיקות הללו מובילות להצטברות של מחיקות בזנים (איור 2). ביצוע מספר רבים של תהליכים במקבילים, כאשר כל תהליך שילוב מחיקות אחד או יותר בכל סבב, מפחית את הזמן הנדרש לבניית מתח. תוכן &quot;&gt; הצעד הראשון הוא יכין מוטציות בודדות ההפלואידים כינו &#39;ProMonsters,&quot; כל אחד מהם נושא את כתב ה-GFP במוקד נמחק ואחד&#39; ארגז הכלים &#39;הלוקוסים-או GMToolkit-המפלצת הירוקה או GMToolkit-α ב . Can1Δ לוקוס (איור 3) שימוש בזנים מאוסף מחיקת שמרי 12, מחיקות GFP-מסומנות יכול להיות שנוצר בנוחות על ידי החלפת KanMX4 הקלטת המשותפת קיימת בזנים אלה עם GFP אוניברסלי - URA3 בר כל GMToolkit מכיל:. או - או α-הזדווגות סוג ספציפי סמן הפלואידים בחירה 1 ובדיוק אחד משני הסמנים ש, כאשר שני GMToolkits נמצא, באופן קולקטיבי מאפשרים בחירה של diploids. הצעד השני הוא לבצע רכיבה המינית שדרכו ניתן לשלב לוקוסי מחיקה בתוך תא בודד על ידי מבחר האקראי ו / או recomb meioticination המלווה כל מחזור של הזדווגות ונביגה.

כאשר מתח-הפלואידים נושאים ארבע מחיקות מסומנות-GFP (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) נחצה עם מתח α-הפלואידים נושאים ארבע מחיקות (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ), עם שתי מחיקות (ycl033cΔ yer042wΔ) משותף לשני זנים, נציג תוצאה הושגה. תערובת ההזדווגות הייתה בתרבית במדיום המכיל YPDA G418 ונט כדי לבחור diploids. את diploids התוצאה הייתה בתרבית במדיום נביגה. הנבגים פוזרו על ידי הטיפול וsonication zymolyase, וניבטו בתקשורת בחירת ההפלואידים. התאים אז הם ש...

שיטת המפלצת הירוקה מאפשרת הרכבה המהירה של מחיקות מרובות מסומנות בחלבון כתב גן קידוד ירוק זרחני. שיטה זו מבוססת על נהיגת זני שמרים במחזורים חוזרים ונשנים של מגוון מיני של מחיקות והעשרה פלואורסצנטי המבוסס של תאים שנשאו יותר מחיקות.

תהליך המפלצת הירוקה לדור של זני שמרי נשיאת מחיקות Gene מרובות

פנוטיפים של מחיקת גן נחשפים לעיתים קרובות רק כאשר המוטציה נבדקת ברקע גנטי מסוים או בתנאי סביבה מסוימים1,2. ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק זני שמרים הנושאים מחיקות מרובות המסומנות על ידי גן דגל של חלבון פלואורסצנטי ירוק. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת מוטנטים בודדים הפלואידיים המכונה "pro monsters", שכל אחד מהם נושא קסטת מחיקה של GFP במקום אחד מהגנים המטרה. השלב השני הוא מיון המחיקות באמצעות הזיווג והפרייה של זני השמרים, תוך שימוש בשתי קבוצות של סמני ברירה דיפלואידיים והפלואידיים המכונות GM toolkit A ו-GM toolkit alpha, אשר נמצאים גם הם בזני ה-pro monster.בשלב הבא, תאים בעלי פלואורסצנציה גבוהה נבחרים מתוך האוכלוסייה המיוטית באמצעות ציטומטריה של זרימה (flow cytometry) כדי להעשיר זנים הנושאים שתי מחיקות. השלב הסופי הוא אישור הגנוטיפים של הזנים הממוינים. בסופו של דבר, סבבים חוזרים של השבחה באמצעות הזדווגות והעשרה בציטומטריה של זרימה, החל עם הזנים שהתקבלו, מובילים ליצירת זנים בעלי מספר רב יותר של מחיקות.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון שיטת ה-G לשימוש חוזר בסמנים ומחיקה רצפית של גנים, הוא שניתן להשיג מספר מחיקות במחזור אחד, מה שמוביל להרכבה מהירה יותר של מוטנטים מרובי-גנים. לאחר יצירת ה-pro monsters כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב המצורף לסרטון זה, התחל את המחזור המיני על ידי הכנת תרביות של זני מחיקת ה-GFP pro monster המבוססים בתוך מבחנה מסוג Eppendorf בנפח 1.6 מיליליטר. הכן זן מחיקה מסוג הזיווג A ב-100 µL של מצע סינתטי מלא חסר היסטמין, המכונה מצע minus his. כמו כן, הכן זן מחיקה מסוג הזיווג alpha ב-100 µL של מצע סינתטי מלא חסר לוסין, או מצע minus lu, במבחנה מסוג Eppendorf בנפח 1.6 מיליליטר לצורך חילופי אוויר.ביצעו חורים בפקקי המבחנות באמצעות סיכה שעובדה ב-70%ethanol. סובבו את המבחנות באופן אופקי בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך הלילה. ציר הסיבוב חייב להיות מקביל לציר האורכי של המבחנה.בהערכה לפי צפיפות אופטית, ערבבו בערך 250,000 תאים haplo ו-250,000 תאים alpha haplo מזני GFP deletion בתוך מבחנת Eppendorf בנפח 1.6 מיליליטר. מספר תאים זה תואם בדרך כלל לשבעה µL מכל תרבית לילה, לאחר ערבוב ב-vortex. הכינו את התאים על ידי סבוב ראשוני בצנטריפוגה ב-800 G למשך שתי דקות.לאחר הסרת ה-supinate, צרו חור במכסה באמצעות סיכה שעברה טיפול ב-70% ethanol. כדי לאפשר חילוף אוויר, הוסיפו 50 µL של מצע YPDA, ולאחר vortex מהיר, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה ב-800 G למשך חמש דקות. לאחר מכן, הניחו את המבחנה בתוך תיבה לחה שהוכנה מקופסת טיפים ריקה, מעמד טיפים קטן ומגבון נייר רטוב.דגרו את הקופסה למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C. העבירו 10 µL מתערובת ההכלאה ל-500 µL מצע GNA ללא אגר המכיל את האנטיביוטיקה G 4 1 8 ו-nat, לתוך מבחנה תרבית של 5 mL עם מכסה רופף; הצפיפות האופטית ההתחלתית ב-600 nm היא בערך 0.1. סובבו את התרבית בטמפרטורה של 30 °C למשך 24 שעות.דבר זה מאפשר בחירה של דיפלואידים, מכיוון שרק דיפלואידים המכילים הן את MX4 בערכת GM toolkit A והן את nat MX4 בערכת GM toolkit Alpha יכולים לגדול בנוכחות של G418 ו-Nat. העבירו 20 µL מתרבית בת יום ל-500 µL של מצע GN טרי המכיל G418 ו-Nat. הצפיפות האופטית ההתחלתית ב-600 nm היא בערך 0.2.סובב את המבחנה בטמפרטורה של 30 °C למשך חמש שעות כדי להביא את התאים לשלב הלוגריטמי. כדי לסנכרן את הדיפלואידים ולהבדיל את הספורות, פעל לפי הנוהל המתואר בפרוטוקול הכתוב.המשיכו בפיצול של תרחיף התאים הקשורים ל-SPO לשני חלקים של 300 µL והעבירו כל חלק למבחנה נפרדת מסוג 1.5 mL. צנטריפוגו את המבחנות ב-800 G למשך חמש דקות. לאחר הסרת העל-מצוף, צרו חור במכסה של כל מבחנה.בעזרת פיפט, הוסף 100 µL של מצע minus his למשקע באחד השפופרות. כדי לבחור haplos מסוג PT בשפופרת השנייה, הוסף 100 µL של מצע minus loo. כדי לבחור alpha haplos.סובבו את המבחנות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius למשך הלילה. הצפיפות האופטית הסופית ב-600 nanometers צריכה להיות נמוכה מ-0.5. אם הצפיפות האופטית ב-600 nanometers נוטה להיות גבוהה מדי, בצעו תרסול בטמפרטורת החדר.כדי להשרות את ה-GFP, הוסיפו 100 µL של מצע fresh minus hiss או minus LU טרי המכיל 20 µg/mL doxycycline למאבקים השונים. הריכוז הסופי של doxycycline הוא 10 µg/mL. ערבבו את המבחנה ב-Vortex והסיבבו בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים.כדי להתחיל את הציטומטריה עם זרימה, הוסיפו 900 µL של באפר TE מסונן מראש לשפופרת פוליפרופילן של 5 mL, כאשר המכסה הוחלף במכסה עם מסננת תאים משפופרת פוליסטירן של 5 mL. שפופרות פוליפרופילן מתאימות לציטומטריה עם זרימה. המכסה עם המסננת נדרש לצורך הסרת חלקיקים גדולים.הניחו בעדינות 75 µL מהבופר על מכסה מסנן התאים. הוסיפו 25 µL מהתאים המושרים לתמיסה שעל המכסה, תוך כדי לחיצה של קצה הפפטה אל מול הרשת. דחפו את כל התמיסה המשולבת דרך המסנן.לחצו על מכסה המסנן וערבלו את המבחנה במיקסר (vortex). הכינו את מבחנות האיסוף, מבחנות fendor בנפח 1.6 milliliter הממולאות ב-200 microliters של מצע minus hiss או minus lube. הפעילו את ממיאנם התאים (cell sorter) וכווןנו את ההגדרות בהתאם למדריך היצרן.שקשקו (Vortex) את מבחנות האיסוף כדי לצפות את הדפנות במצע. כמו כן, שקשקו את המבחנה המכילה את התאים לפני טעינתם לממיין התאים. רכשו נתוני ציטומטריה של זרימה של הדגימה.זן ללא GFP יכול לשמש כביקורת שלילית. הגדירו שערים למיון כדי להימנע מצבורי תאים, שעלולים להפגין עוצמת GFP גבוהה. השמיכו חריגים עם רוחב פולס או שטח פולס גדולים באופן לא פרופורציונלי עבור פיזור קדמי (Forward Scatter), המסומן כ-FSC, באמצעות תרשים של רוחב הפולס וגובה הפולס, או תרשים של שטח ה-FSC וגובה ה-FSC.מכיוון שצפוי FSC גבוה עבור אגרגטים של תאים, יש לבחור רק תאים ב-20% התחתונים של ה-FSC. הימנע מאזורים עם הערכים הנמוכים ביותר של FSC ופיזור צדי או SSC, שבהם נמצאים לעיתים קרובות שיירי תאים. אות ה-SSC ואות ה-GFP נמצאים לרוב במתאם חיובי.כדי למנוע העשרה של תאים בעלי ערך SSC גבוה יותר, יש לסמן שער (gate) לאורך פרימטר האוכלוסייה באמצעות תרשים של עוצמת GFP ו-SSC, וזאת כדי לדגום אחוז דומה של התאים הזוהרים ביותר מכל נקודה לאורך ציר ה-SSC באופן כולל. יש לסמן למיון 0.1% עד 1% מהתת-אוכלוסייה שנבחרה באמצעות שערי FSC ו-SSC לפני שלב זה, ולמיין 200 תאים אל מבחנת האיסוף. יש לנער את מבחנת האיסוף במכשיר vortex כדי לכסות את התאים הממוינים במדיום, ולאחר מכן להעביר לצלחת גידול.תת-קבוצה של תאים על מצע A-Y-P-D-A לצורך גנוטייפינג. דגרו את המצע בטמפרטורה של 30 °C למשך יומיים לאחר ההדגרה. הכינו ליזט עבור כ-12 מושבות.פעלו לפי השלבים המפורטים בפרוטוקול הכתוב לגנוטיפיקה. נתחו מיקרוליטר אחד של ליזאט מדולל באמצעות תגובת PCR של 10 מיקרוליטר עם פריימר קדמי. פריימר זה נקשר לאזור השוליים שמעלה (upstream) של כל גן שנמחק, ומצומד לפריימר משותף הנקשר בתוך כל אתרי המחיקה.ניתן לבצע את ה-PCR בפורמט של 96 או 384 בארות. לאחר ההגברה, יש לנתח את תוצרי ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה.זהו את ההפלו-טיפים (haplos) שסביר להניח שיש להם את הגנוטיפים הרצויים. העבירו זנים אלו לצלחת חדשה. בנוסף, הקפיאו אותם ב-25% glycerol בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.מומלץ לבצע בדיקות נוספות, כגון אישור היעדרויותן של רצפי סוג בר (wild type) עבור גנים שנמחקו, וביצוע אלקטרופורזה של ג'ל שדה (field gel electrophoresis). יש לחזור על מחזורי ההחלפה המינית עם זנים יעילים. צאצאים הפלואידיים מהכלאה של שני זנים הונחו לבטא GFP.בכל מחיקת גן נעשה שימוש בקסטת GFP; באמצעות שערים (gates) בציטומטר זרימה, נבחרה אוכלוסייה של התאים שהתקבלו. סביר להניח שבאוכלוסייה זו לא יהיו שרידים או צברי תאים. 1% מהתאים בעלי העוצמה הגבוהה ביותר מויו בסדר (sorted) ונשמרו על ידי הגדרת שערים לתאים על בסיס שטח הפיזור קדימה (forward scatter area) וגובה הפיזור קדימה (forward scatter height).מקבצי תאים, הנוטים להפגין שטח פיזור קדמי (forward scatter) גדול באופן לא פרופורציונלי, הוצאו; תאים שסוננו על בסיס פיזור קדמי ופיזור צדי (side scatter) בטווח של 20% התחתון בפיזור הקדמי התקבלו, בעוד שפסולת מהיום הוצאה על ידי סינון התאים על בסיס פיזור צדי ואות GFP הנמוכים ביותר בפיזור הקדמי והצדי. התאים הפלואורסצנטיים יותר מבין אלו שבטווח פיזור צדי נתון נבחרו כדי לאפשר השוואה בין התערובת המיוטית לבין דגימת הביקורת השלילית שאינה מבטאת GFP. GA זהה לזה ששימש לבחירת אוכלוסיית P three מוצג בדיאגרמה. תאים שנבחרו באופן דומה מהביקורת השלילית ב-haplos נפרד נותחו באמצעות PCR לאחר שהודו להביע GFP וסוננו על בסיס פלואורסצנציה. מספר המחיקות הצפוי עבור תא שלא עבר מיון כתוצאה מסגריגציה אקראית היה 7.5.בניסוי ספציפי זה, לתאים הממוינים היה מספר מחיקות ממוצע של 8.8 פלוס או מינוס 0.3, כולל חמישה תאים שהכילו 10 מחיקות. גנוטיפ DO. מיון זני PCL בוצע באמצעות פריימר הפוך.הפריימר That 10 נקשר לאזור השכבה (flanking region) במורד הזרם, בשילוב עם פריימר קדמי. הפריימר That 10 נקשר לקצה הקסטה. נוכחות של פס บיטוי מעידה על נוכחות קסטת ה-GFP.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו משתמשים בשיטת ה-green Monster כדי להנדס מחיקות (deletions) בשמרים.

the-green-monster-process-for-generation-yeast-strains-carrying

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

GFP-Fusion חלבונים נמצאים בשימוש נרחב כדי להמחיש האברונים ידי מיקרוסקופיה confocal. אולם, ההקרנה של מוטציות המשפיעות על המורפולוגיה של האברונים בדרך כלל דורש mutagenesis הפרט היא זמן רב. הנה, אנחנו מדגימים שיטה לשלב בו זמנית אברון-GFP סמנים כמעט 5,000 שאינם חיוניים גנים בשמרים.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

אנו מציגים כאן תיאור אחיד של טכניקות שיכולות לשמש לפיתוח, לשנות, לנהל, ולבדוק ביטוי חלבון Heterologous של boulardii Saccharomyces שמרים פרוביוטיים.

טרנספורמציה של שמרים פרוביוטיים ושחזור שלהם מרקמות העיכול החיסון בעקבות Gavage אוראלי עכברים

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבנייה וסינון של ספריות מוטנטיות עבור מסעות אבולוציה מכוונים ב-Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

אנו מדווחים כאן על שיטות למניפולציה גנטית מולקולרית של זן Yarrowia lipolytica Po1g לשיפור יעילות מחיקת הגנים. לזני Y. lipolytica המהונדסים המתקבלים יש יישומים פוטנציאליים בייצור דלק ביולוגי וביוכימי.

הנדסה גנטית של שמרים לא קונבנציונליים עבור Biofuel מתחדשת והפקה ביוכימיים

אנו מתארים אסטרטגית החלפת גנים חזקה כדי גנטי לתפעל פטריית תועבת Ustilago maydis. פרוטוקול זה מסביר כיצד ליצור מוטציות מחיקות לחקור פנוטיפים זיהום. זה יכול להתארך עד לשנות את הגנים בכל דרך רצויה, למשל, על ידי הוספת רצף קידוד תג חלבון פלואורסצנטי.

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

מוטנטים למחיקת גנים שנוצרו באמצעות רקומבינציה הומולוגית הם תקן הזהב למחקרי תפקוד גנים. OSCAR (שלב אחד בניה של Agrobacterium- רקומבינציה מוכנים פלסמידים) שיטה לדור מהיר של בונה המחיקה מתואר. Agrobacterium בתיווך טרנספורמציה פטרייתית הבא. לבסוף, שיטת אישור מבוסס PCR של מחיקות גנים transformants פטרייתי מוצג.

הפקה מהירה מחיקת פטריות דרך<em&gt; Agrobacterium</em&gt; שינוי מתווך של OSCAR מחיקת מבנים

מוצגת אסטרטגיה ליצירת מוטציות בגנים היסטונים במיקומם האנדוגני ב-Saccharomyces cerevisiae.

ממוקד<em&gt; באתרו</em&gt; גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

מאמר זה מתאר מתודולוגיה מפורט אקראי מוטגנזה מכוונת של גנים היעד בביקוע שמרים. כדוגמה, אנחנו יעד rpt4 +, שמקודד של יחידת משנה של פרוטאוזום 19, וכן מסך מוטציות ביציבותה הטרוכרומטין.

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

מערכת CRISPR/Cas12a בשילוב עם מערך crRNA יחיד מאפשר עריכה משולבת יעילה של הגנום S. cerevisiae ס בבית מרובים בו זמנית. זה הפגינו על ידי בניית קרוטנאיד הפקת זנים שמרים אשר משמשים לאחר מכן כדי ליצור פיקסל ארט שמרים.

CRISPR/Cas12a מולטיפלקס עריכת הגנום של סכביקוע cerevisiae ס ויצירת שמרים אמנות פיקסל

מטרת פרוטוקול זה היא לספק מדריך מפורט, צעד אחר צעד להרכבת מבנים מרובי גנים באמצעות מערכת שיבוט מודולרית המבוססת על שיבוט שער הזהב. הוא גם נותן המלצות על צעדים קריטיים כדי להבטיח הרכבה אופטימלית המבוססת על החוויות שלנו.

הרכבה מהירה של מבנים מרובי גנים באמצעות שיבוט שער הזהב מודולרי

למדו את שיטת Green Monster להנדסת שמרים עם מחיקות גנים מרובות באמצעות GFP וציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת הרכבה יעילה של זני שמרים לחקר גנטיקה ומניפולציה גנטית.

תהליך המפלצת הירוקה לדור של זני שמרי נשיאת מחיקות Gene מרובות

גלה סרטונים נוספים