זיהוי של מיקרו RNA ב microglia על ידי Real-time PCR ב CNS רגיל ובמהלך Neuroinflammation

המטרה הכללית של נוהל זה היא לנתח את הביטוי של micro RNA במיקרוגליה. דבר זה מושג תחילה על ידי ניתוח של המוח וחוט השדרה, ולאחר מכן הומוגניזציה של רקמת מערכת העצבים המרכזית (CNS). בשלב השני, תאים גרעיניים בודדים (mononuclear cells) מבודלים מה-CNS באמצעות גרדיאנט Percoll, ולאחר מכן אוכלוסיית המיקרוגליה מזוהה באמצעות FACS.

בשלב הבא, מבודל ה-RNA של המיקרוגליה ואיכות הדגימה מנותחת. לבסוף, מבוצע real-time PCR עבור ה-micro RNA הספציפי הנחקר. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטת ה-delta delta CT כדי להראות את רמת הביטוי היחסית של micro RNA מסוים במיקרוגליה.

בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו ייתקלו בקשיים בשל כישלון בבידוד מספר מספיק של תאים חד-גרעיניים ממערכת העצבים המרכזית (CNS) או בשל זיהום של הדגימה במיאלין ובשרידי תאים. שני המקרים מובילים להכנה באיכות נמוכה, אך הראשונה גורמת לריכוז נמוך של RNA והשנייה לזיהום בחלבונים. את הפרוצדורה ידגימו אני ו-vir.

ד"ר O, עמית מהמחקר, לאחר ביצוע פרפוזיה לכל העכברים, יש להוציא את המוחות ואת חוט השדרה. לאחר מכן, יש להניח בכל פעם מוח אחד וחוט שדרה אחד בתוך הומוגנייזר Dounce בנפח 15 milliliter, ולהוסיף 5 milliliter של PBS לרקמות בכל פעם. לאחר ביצוע 10 עד 20 מכות עדינות, יש להעביר את התוצר ההומוגני דרך מסנני תאים של 70 micron לשפופרות קוניות של 50 milliliter, ולסבב את השפופרות בצנטריפוגה למשך חמש עד שבע דקות במהירות של 834 ×g ובטמפרטורה של 4 °C.

לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), השעה את ההומוגנאט של המוח וחוט השדרה משני עד שלושה עכברים ב-5 עד 7 מיליליטר של 70% percoll. לאחר מכן, הוסף מעל שכבה של 7 מיליליטר של 40% percoll וסבב את תמיסות ה-percoll והתאים למשך 30 דקות במהירות של 850 ×g בטמפרטורה של 20 °C ללא בלימה (no break). השלך את התאים הפגומים, המיילין והפסולת שנמצאים בחלקו העליון של ה-70% percoll.

לאחר מכן, אספו את התאים חד-גרעיניים מהממשק שבין תמיסות ה-70% וה-40% Percoll ודללו את התאים שנאספו ב-PBS, ביחס של לפחות אחד לאחד. לאחר סבוב של התאים בצנטריפוגה, השביו את המשקע בחצי מיליליטר של PBS והעבירו אותם לשפופרת Eppendorf בנפח 1.7 מיליליטר. התחילו בהעברה של 50 µL מהתאים שנמינו לפי מדרג צפיפות לשפופרת Eppendorf חדשה בנפח 1.7 מיליליטר, והוסיפו לשפופרת 350 µL של FACS buffer.

לאחר מכן, לאחר הוספת 5 עד 10 µL של נוגדנים נגד FCR לשפופרת, הדגרו את התאים למשך 10 עד 15 דקות על קרח. פצלו את דגימת התאים לשתי שפופרות אפנדורף; לשפופרת אחת הוסיפו 1 µL של נוגדנים נגד CD 11 B ו-2 µL של נוגדנים נגד CD 45.

דגירה של התאים למשך 10 עד 15 דקות נוספות על קרח. סמנו את המבחנה השנייה כביקורת שלילית והניחו אותה על קרח. לאחר הדגירה עם הנוגדנים הצובעים, הוסיפו מיליליטר אחד של fax buffer לשתי המבחנות וסובבו את התאים במיקרו-צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-1200 ×g.

G. לאחר מכן, קבעו את המשקעים ב-400 µL של 1% paraformaldehyde ב-PBS ובצעו vortex למבחנות כדי למנוע התגבשות. לבסוף, נתחו את התאים באמצעות ציטומטריית זרימה תוך שימוש בדגימת תאי ביקורת שלילית וב-BD com beads. התחילו בחיסון תת-עורי של קבוצה של חמישה עד 10 עכברים מסוג C 57 black six בני 8 עד 12 שבועות, באמצעות 150 mg של פפטיד MOG 35-55 בריכוז של 4 mg/mL של complete frons adjuvant כדי להשרות EAE. לאחר מכן, ניתן רעלן פרטוסיס (pertussis toxin) בהזרקה תוך-בטנית ביום אפס וביום השני לאחר החיסון.

לאחר בידוד וצביעה של התאים כפי שהודגם זה עתה, השהה את המשקעים ב-400 µL של PBS במקום במקבע רגע לפני המיון. לאחר מכן, מלא שני מבחנות אפנדורף בנפח 1.7 mL ב-300 µL של PBS מועשר ב-10% FBS לאיסוף הדגימות. לבסוף, מיין את אוכלוסיות המיקרוגליה והמקרופאגים לרמת טוהר גבוהה באמצעות אסטרטגיית ה-gating המוצגת בגרף צפיפות מייצג זה.

לאחר המיון, נתוח מחדש את אוכלוסיות המיקרוגליה והמאקרופאגים כדי לקבוע את רמות הטוהר של דגימות התאים המבודדות. לאחר סבוב של אוכלוסיות התאים הממוינות ב-1200 ×g למשך חמש עד שבע דקות במיקרו-צנטריפוגה, הסר בזהירות את הנוזל העליון והקפא את משקעי התאים על קרח יבש. לאחר מכן, העבר את משקעי התאים הקפואים לקרח רגיל.

להפשרה, הוסיפו 300 µL של lysis buffer מתוך ערכת Nirvana ולאחר מכן ערבבו בעדינות את תמיסת התאים באמצעות פיפוט חמש עד שבע פעמים. לאחר מכן הוסיפו 30 µL של homogenate additive, ערבבו את תמיס התאים ב-vortex למשך 30 שניות, והניחו את המבחנות על קרח למשך 10 דקות. כעת הוסיפו 300 µL של acid phenol, chloroform, וערבבו את המבחנה ב-vortex למשך 30 שניות נוספות.

לאחר סבב צנטריפוגה של התאים למשך חמש דקות ב-9,500 ×g, העבירו בזהירות את 300 המיקרוליטרים העליונים של העלייה, המכילים את הפאזה המימית, למבחנה מסוג Eppendorf בנפח 1.7 מיליליטר. ערבבו את התמיסה עם 375 מיקרוליטרים של ethanol 100%. העבירו את כל תכולת המבחנה למחסנית סינון מערכת ה-Nirvana והריצו את המחסנית בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-9,500 ×g. לאחר מכן, השליכו את תמיסת השטיפה (flow through buffer).

הוסף 700 µL של תמיסת שטיפה 1 מהערכה של Nirvana, וסובב למשך דקה נוספת ב-9,500 ×g לאחר שטיפת העמודיק. חזור על הפעולה פעמיים נוספות עם 500 µL של תמיסת שטיפה 2 מהערכה של Nirvana. בצע אלוציה של ה-RNA מהעמודיק באמצעות 60 µL של מים נקיים מנוקלאז שחוממו מראש.

לבסוף, השתמשו בספקטרופוטומטר NanoDrop כדי להעריך את טוהר וכמות ה-RNA לאחר ביצוע realtime Q-R-T-P-C-R לזיהוי micro RNA בדגימות של מיקרוגליה ומקרופאגים. ניתן ליצור עקומות P-R-T-P-C-R עבור תוצרי PCR של mere 1 24 ו-snow RNA 55 המסומנים פלואורסצנטית, כפי שמוצג כאן בגרף הראשון. מוצגות עקומות טיפוסיות של כמות תוצרי PCR ספציפיים המסומנים פלואורסצנטית עבור דגימות ביקורת של snow RNA 55 RNA שבודדו ממיקרוגליה או ממקרופאגים המופקים ממח עצם, בהשוואה למספר מחזורי ה-PCR.

שימו לב כי ערכי ה-CT עבור ניתוח ביטוי ה-snow RNA 55 מאוכלוסיות התאים השונות נקבעים בנקודת המפגש של קו הבסיס עם החלק התחתון של הטווח הליניארי של עקומות ה-Q-R-T-P-C-R, כפי שמסומן בגרף על ידי הקווים האנכיים הירוקים והכחולים. בגרף שני זה, מוצגת כמות תוצרי PCR ספציפיים המסומנים פלואורסצנטית עבור דגימות mere 1 24 RNA ניסיוניות ממיקרוגליה או ממקרופאגים המופקים ממח העצם, בהשוואה למספר מחזורי ה-PCR. שימו לב כי ערכי ה-CT עבור ניתוח ביטוי ה-mere 1 24 מאוכלוסיות התאים השונות נקבעים שוב בנקודת המפגש של קו הבסיס עם החלק התחתון של הטווח הליניארי של עקומות ה-Q-R-T-P-C-R, כפי שמסומן בגרף על ידי הקווים האנכיים הירוקים והכחולים.

לאחר קביעת ערכי ה-CT עבור כל אחת מהדגימות, כפי שמוצג בטבלה זו עבור ביטוי snow RNA 55 ו-mere 1 24 במיקרוגליה וב-BM dms מעכברים נורמליים ועכברים עם EAE, החסיר את ערך ה-CT של דגימת הבקרה snow RNA 55 מערך ה-CT של דגימת הניסוי mere 1 24 כדי לחשב את ערכי ה-delta CT עבור כל כפל של כל דגימה. לאחר מכן, החסיר את ה-delta CT של דגימת הייחוס מערכי ה-delta CT של הדגימות האחרות כדי לחשב את ערכי ה-delta delta CT. לבסוף, רמת הביטוי היחסית עבור כל דגימה מחושבת כ-2 בחזקת מינוס delta delta CT, כפי שניתן לראות בתרשים צפיפות זה.

במקרה של בידוד יעיל של מיקרוגליה ממערכת העצבים המרכזית (CNS) תקינה, 95% עד 98% מהתאים יהיו מיקרוגליה CD 11 B positive CD 45 low, כאשר 2% עד 5% מתלי התאים יורכבו ממאקרופאגים פרי-וסקולריים CD 11 B positive CD 45 high, ופחות מ-1% יהיו לימפוציטים CD 11 B negative CD 45 high או תאי אסטרוגליה או אוליגו-דנדרוגליה CD 11 B negative CD 45 negative, או שברי תאים. להשוואה, בהכנה לקויה תהיה זיהום משמעותי של תאים או שברי תאים CD 11 B negative CD 45 negative, כגון אסטרוגליה או חלקיקי מיאלין, ההופכים את התאים לבלתי מתאימים לבידוד RNA ולניתוחים נוספים. בנוסף, עשויים להופיע תאים CD 11 B negative CD 45 high, המעידים על זיהום של לימפוציטים מהדם עקב פרפוזיה לא מספקת. בתרשים צפיפות זה מוצגות שלוש אוכלוסיות התאים הנמצאות במערכת העצבים המרכזית במהלך דלקת עצבית (neuroinflammation): מיקרוגליה CD 11 B positive CD 45 low, מאקרופאגים CD 11 B positive CD 45 high ולימפוציטים CD 11 B negative CD 45 high.

מוצגת איכות ה-RNA כפי שנקבעה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל לאחר בידוד תקין לעומת בידוד לקוי. כאשר ה-RNA מבודד בצורה נקייה, ניתן להבחין בסולם RNA וב-ribosomal RNA; כאשר תהליך הבידוד מבוצע בצורה לקויה, ניתן להבחין במריחה ובתוצרי פירוק בעלי משקל מולקולרי נמוך. נתונים סופיים אלו מדגימים ביטוי של mere 1 24 במיקרוגליה של מבוגרים נורמליים, במיקרוגליה של עכברים עם EAE ובמיקרוגליה שבודדה מעכברים בשלבי התפתחות מוקדמים.

בגרף עמודות ראשון זה, הביטוי היחסי של mere 1 24 גבוה בהרבה במיקרוגליה ממערכת עצבים מרכזית (CNS) נורמלית בהשוואה לזה שנצפה במקרופאגים המופקים ממח עצם. באופן דומה, למרות שישנה עלייה ב-RNA של mere 1 24 במקרופאגים ממערכת העצבים המרכזית של עכברים עם EAE, מיקרוגליה עדיין מבטאת פי חמישה מכמות ה-RNA של mere 1 24. גרף עמודות סופי זה מדגים כיצד ניתן להעריך באמצעות שיטה זו גם שינויים ברמת הביטוי של mere 1 24 במיקרוגליה במהלך התפתחותם של עכברים בני שבוע אחד, שניים וארבעה, בהשוואה לעכברים בוגרים בני שמונה שבועות, תוך כדי ביצוע הפרוטוקול.

חשוב לזכור להבטיח כמות מספקת ואיכות טובה של תאים מבודדים, דבר שיבטיח תוצאות טובות עבור הניסוי כולו.