זיהוי של מיקרו RNA ב microglia על ידי Real-time PCR ב CNS רגיל ובמהלך Neuroinflammation

המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח את הביטוי של מיקרו RNA במיקרוגליה. זה מושג תחילה על ידי ניתוח המוח וחוט השדרה ולאחר מכן הומוגניזציה של מערכת העצבים המרכזית או רקמת מערכת העצבים המרכזית. בשלב השני, תאים חד-גרעיניים ממערכת העצבים המרכזית מבודדים על ידי שיפוע לכל קריאה, ואז אוכלוסיית המיקרוגליה מזוהה על ידי עובדות.

לאחר מכן, מבודדים את ה-RNA המיקרוגליאלי ומנתחים את איכות הדגימה. לבסוף, מבוצע PCR בזמן אמת עבור המיקרו RNA המסוים המעניין. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטת דלתא CT כדי להראות את רמת הביטוי היחסית של מיקרו RNA מסוים במיקרוגליה.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהם לא מצליחים לבודד מספר מספיק של תאים חד-גרעיניים ממערכת העצבים המרכזית או מכיוון שהדגימה מזוהמת, מיאלין ופסולת תאים. שני המקרים מביאים להכנה באיכות נמוכה, אך ריכוז נמוך של RNA או זיהום בחלבון בהתאמה. מדגים את ההליך יהיה אני ו-vir.

עמית ד"ר O מ- לאחר זלוף של כל העכברים, ניתח את המוח וחוט השדרה. לאחר מכן הניחו מוח אחד וחוט שדרה אחד בכל פעם לתוך הומוגנייזר של 15 מיליליטר דאון והוסיפו חמישה מיליליטר PBS לרקמות בכל פעם. לאחר ביצוע 10 עד 20 מכות עדינות, העבירו את ההומוגני דרך מסננות תאים של 70 מיקרון לצינורות חרוטיים בודדים של 50 מיליליטר וצנטריפוגה את הצינורות למשך חמש עד שבע דקות בטמפרטורה של 834 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס.

לאחר השלכת ה-supernatant Resus, השעו את המוח וחוט השדרה ההומוגניים משניים עד שלושה עכברים בחמישה עד שבעה מיליליטר של 70% לכל שיחה. לאחר מכן שכבו שבעה מיליליטר של 40% לכל שיחה וסובבו את הפתרון לכל שיחה ותא למשך 30 דקות ב-850 פעמים G 20 מעלות צלזיוס ללא הפסקה. השליכו את התאים הפגועים ואת הקילומטר והפסולת בראש ה-70% לשיחה.

לאחר מכן אסוף את התאים החד-גרעיניים בממשק בין 70% ל-40% לכל תמיסת שיחה ודלל את התאים שנאספו ב-PBS, לפחות ביחס של אחד לאחד. לאחר סיבוב התאים, יש להחזיר את הכדור לחצי מיליליטר של PBS ולהעביר אותם לתוך צינור איינור של 1.7 מיליליטר. התחל בהעברת 50 מיקרוליטר של תאים ממויינים בשיפוע הצפיפות לתוך שפופרת עינור חדשה של 1.7 מיליליטר והוסף 350 מיקרוליטר של מאגר פקס לשפופרת.

לאחר מכן, לאחר הוספת חמישה עד 10 מיקרוליטרים של נוגדנים נגד FCR לשפופרת, דגרו את התאים למשך 10 עד 15 דקות על קרח. פצל את דגימת התא לשני צינורות עינור לצינור אחד. הוסף מיקרוליטר אחד של נוגדנים נגד CD 11 B ושני מיקרוליטרים של נוגדנים נגד CD 45.

דגירה של התאים למשך 10 עד 15 דקות נוספות על קרח. סמן את הבקרה השלילית של הצינור השני והנח אותו על קרח. לאחר הדגירה עם נוגדנים מכתימים, הוסף מיליליטר אחד של מאגר פקס לשני הצינורות וסובב את התאים במיקרו צנטריפוגה למשך חמש דקות ב-1200 פעמים.

ז. לאחר מכן מקבעים את הכדורים ב -400 מיקרוליטר של 1% פרה פורמלדהיד ב- PBS ומערבלים את הצינורות כדי למנוע גושים. לבסוף, נתח את התאים על ידי זרימה ציטומטרית באמצעות דגימת תאי הבקרה השלילית וחרוזי BD com מתחילים בחיסון תת עורי של קבוצה של חמישה עד 10, בני שמונה עד 12 שבועות C 57 שישה עכברים שחורים עם 150 מיליגרם של MOG 35 עד 55 פפטיד בארבעה מיליגרם למיליליטר של פרונים מלאים אדג'ובנט כדי לגרום ל- EAE. לאחר מכן יש לתת רעלן שעלת תוך צפקי ביום האפס וביום השני לאחר החיסון.

לאחר בידוד וצביעה של התאים כפי שהוצג זה עתה, השעו את הכדורים ב-400 מיקרוליטר PBS במקום קיבוע ממש לפני המיון. לאחר מכן מלאו שני צינורות איינור של 1.7 מיליליטר ב-300 מיקרוליטר PBS בתוספת 10% FBS לאיסוף הדגימות. לבסוף, מיין את אוכלוסיות המיקרוגליה והמקרופאגים לטוהר גבוה באמצעות אסטרטגיית השער המומחשת בתרשים צפיפות מייצג זה.

לאחר המיון, נתח מחדש את אוכלוסיות המיקרוגליה והמקרופאגים כדי לקבוע את הטוהר של דגימות התאים המבודדות. לאחר סיבוב אוכלוסיות התאים הממוינות ב-1200 פעמים G למשך חמש עד שבע דקות במיקרו-צנטריפוגה, הסר בזהירות את הסופרנטנט והקפיא את כדורי התא על קרח יבש. לאחר מכן, העבירו את כדורי התאים הקפואים לקרח רגיל.

להפשרה, הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר ליזה מערכת נירוונה ולאחר מכן ערבב בעדינות את תמיסת התא על ידי פיפטינג חמש עד שבע פעמים. לאחר מכן הוסיפו 30 מיקרוליטר של תוסף ההומוגנאט, מערבלו את תרחיף התאים למשך 30 שניות, ואז הניחו את הצינורות על קרח למשך 10 דקות. כעת הוסיפו 300 מיקרוליטר של פנול החומצה, הכלורופורם ומערבולת הצינור למשך 30 שניות נוספות.

לאחר מכן לאחר סיבוב התאים במשך חמש דקות ב-9, 500 פעמים G, העבירו בזהירות את 300 המיקרוליטרים העליונים של הסופרנטנט המכיל את הפאזה המימית לצינור איינור חדש של 1.7 מיליליטר. מערבבים את התמיסה עם 375 מיקרוליטר של 100% אתנול. העבירו את כל תכולת הצינור למחסנית פילטר מערכת נירוונה וסובבו את המחסנית למשך דקה אחת ב 9, 500 פעמים G.לאחר מכן, השליכו את הזרימה דרך המאגר.

הוסף 700 מיקרוליטר של תמיסת כביסה אחת מערכת נירוונה, וסובב דקה נוספת ב 9, 500 פעמים G לאחר שטיפת המחסנית. פעמיים נוספות עם 500 מיקרוליטר תמיסת כביסה. שניים מערכת נירוונה Elute, ה-RNA מהמחסנית עם 60 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז שחוממו מראש.

לבסוף, השתמש בספקטרופוטומטר NanoDrop כדי להעריך את הטוהר והכמות של ה-RNA לאחר ביצוע Q-R-T-P-C-R בזמן אמת כדי לזהות מיקרו-RNA בדגימות המיקרוגליה והמקרופאגים. ניתן ליצור עקומות P-R-T-P-C-R עבור מוצרי PCR המסומנים בפלורסנט רק 1 24 ו-RNA שלג 55 PCR כפי שמוצג כאן בגרף הראשון. מוצגות עקומות אופייניות לכמות מוצרי PCR ספציפיים המסומנים פלואורסצנטית לדגימות RNA 55 RNA של שלג מבודדות ממיקרוגליה או ממקרופאגים שמקורם במח עצם בהשוואה למספר מחזורי ה-PCR.

שימו לב כיצד ערכי ה-CT לניתוח ביטוי RNA 55 של השלג מאוכלוסיות התאים השונות נקבעים בצומת קו הבסיס עם החלק התחתון של הטווח הליניארי של עקומות Q-R-T-P-C-R כפי שמצוין בגרף על ידי הקווים האנכיים הירוקים והכחולים. בגרף השני הזה, מוצגת כמות מוצרי ה-PCR הספציפיים המסומנים פלואורסצנטית עבור הניסוי רק 1,24 דגימות RNA ממיקרוגליה או מקרופאגים שמקורם במח עצם בהשוואה למספר מחזורי ה-PCR. שימו לב כיצד ערכי ה-CT לניתוח של ביטוי 1 24 בלבד מאוכלוסיות התאים השונות נקבעים שוב בצומת קו הבסיס עם החלק התחתון של הטווח הליניארי של עקומות Q-R-T-P-C-R כפי שמצוין בגרף על ידי הקווים האנכיים הירוקים והכחולים.

לאחר קביעת ערכי ה-CT עבור כל אחת מהדגימות, באשר ל-RNA השלג 55 וביטוי 1 24 בלבד במיקרוגליה ו-BM dms מעכברים רגילים ו-EAE המוצגים בטבלה זו, הפחיתו את ערך ה-CT עבור RNA שלג הבקרה 55, דגימה מערך ה-CT עבור דגימת הניסוי 1 24 בלבד כדי לחשב את ערכי הדלתא CT עבור כל שכפול של כל דגימה. לאחר מכן הפחיתו את ה-CT של הדלתא של דגימת הייחוס מערכי ה-CT של הדלתא של הדגימות האחרות כדי לחשב את ערכי ה-CT של דלתא דלתא. לבסוף, רמת הביטוי היחסית עבור כל דגימה מחושבת כ-2 בחזקת מינוס דלתא CT כפי שניתן לראות בתרשים צפיפות זה.

במקרה של בידוד טוב של מיקרוגליה ממערכת העצבים המרכזית הרגילה, 95 עד 98% מהתאים ייצגו CD 11 B חיובי CD 45 מיקרוגליה נמוכה כאשר שניים עד 5% מתרחיף התאים מורכב מ-CD 11 B חיובי CD 45 מקרופאגים פריוסקולריים גבוהים פחות מ-1% מ-CD 11 B שלילי CD 45 לימפוציטים גבוהים או CD 11 B שלילי CD 45 אסטרוגליה שלילית או תאי גליה oligo DRO או שברי תאים יהיו נוכחים יחסית בתכשיר גרוע. קיים זיהום משמעותי של CD 11 B, תאים שליליים CD 45 שליליים או שברי תאים כגון חלקיקי אסטרוגליה או מיאלין, מה שהופך את התאים ללא מתאימים לבידוד RNA ולניתוח נוסף. בנוסף, CD 11 B שלילי CD 45 תאים גבוהים עשויים להיות נוכחים גם הם המעידים על זיהום על ידי לימפוציטים בדם עקב זלוף לא מספיק בתרשים צפיפות זה, שלוש אוכלוסיות התאים הקיימות במערכת העצבים המרכזית במהלך דלקת עצבית CD 11 B חיובי CD 45, מיקרוגליה נמוכה CD 11 B חיובי CD 45 מקרופאגים גבוהים ו- CD 11 B שלילי CD 45 לימפוציטים גבוהים מוצגות באיור זה.

איכות ה-RNA כפי שנקבעה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל לאחר בידוד טוב לעומת רע מוצגת. כאשר ה-RNA מבודד בצורה נקייה, ניכרים סולם RNA ו-RNA ריבוזומלי כאשר תהליך הבידוד מבוצע בצורה גרועה, ניכרים תוצרי פירוק משקל מולקולרי נמוך. נתונים סופיים אלה מדגימים ביטוי של 1,24 בלבד במיקרוגליה מיקרוגליה בוגרת רגילה של עכברים עם EAE ומיקרוגליה שבודדו מעכברים בשלבי התפתחות מוקדמים.

בגרף עמודות ראשון זה, הביטוי היחסי של 1 24 בלבד גדול בהרבה במיקרוגליה ממערכת העצבים המרכזית הרגילה בהשוואה לזה שנצפה עבור מקרופאגים שמקורם במח עצם. באופן דומה, למרות שיש עלייה ב-1,24 RNA בלבד במקרופאגים ממערכת העצבים המרכזית של עכברים עם מיקרוגליה EAE עדיין מבטאים פי חמישה מכמות של 1,24 RNA בלבד. גרף עמודות אחרון זה מדגים כיצד ניתן להעריך שינויים ברמת הביטוי של 1 24 בלבד במיקרוגליה במהלך התפתחותם של עכברים בני שבוע, שבועיים וארבעה שבועות בהשוואה לעכברים בוגרים בני שמונה שבועות גם באמצעות שיטה זו תוך כדי ניסיון ההליך.

חשוב לזכור שתהיה כמות מספקת ואיכות טובה של תאים מבודדים, מה שיבטיח תוצאות טובות לכל הניסוי.