Name: טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת- (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: למד שיטה לאוטומציה של טיהור חלבונים מתויגי-היס בקנה מידה גבוה באמצעות רובוטיקה לטיפול בנוזלים. טכניקה זו מייעלת ניסויים בביוכימיה ומפחיתה שגיאות אנוש.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי Wellcome פרויקט גרנט (078043/Z/05/Z) לROJW

חלק א: צמיחת תפוקה גבוהה של תרבויות חיידקים. 1. לגדול חיידקי לינה ב2 מ&quot;ל של מדיום Autoinduction באמצעות צלחות 24 גם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sterilise הצלחות 24 גם במיקרוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 1.5 מ&quot;ל של מדיום autoinduction (בינוני אקספרס לינה) עם מושבות חיידקים שגודלו טרי או מניות גליצרול קפואות. בדרך כלל אנחנו לחסן שלוש בארות למוטציה עם שלוש מושבות משובטות בודדות. מילואי שש בארות לבקרות חיוביות ושליליות. עבור בקרות החיוביות אנו גדלים 3 שיבוטי wildtype ועבור הפקדים השליליים אנו גדלים 2 שיבוטים שכבר הפכו עם פלסמיד שאינם מבטא. בדקו לעיקור מספק של הצלחת על ידי השארת באר אחת ריק לשליטה בינונית בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את התאים ל18 שעות על 37 מעלות צלזיוס ורועדת ב 250 סל&quot;ד. אנו משתמשים Lac-BL21 מושרה (DE3) רוזטה 2 תאים. בינוני Autoinduction מכיל תערובת של גלוקוז ולקטוז. החיידקים בתחילהלהאכיל על גלוקוז ולאחר מכן להתחיל להשתמש לקטוז, שגם גורם לביטוי של החלבונים רקומביננטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה והנח את הצלחת על הפלטפורמה רובוטית. </li></ol> חלק ב: טיהור של חלבונים רקומביננטיים רובוטית. 2. הכן את הפלטפורמה רובוטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איפור החיץ לשטוף בהיקף של 20 המ&quot;מ imidazole, 0.1% Triton X-100, 0.5 מ &#39;NaCl, 20 המ&quot;מימ טריס יצטט, pH 7.9, 10 mM MgOAc 2, 0.7 המ&quot;מ ZnOAc 2, גליצרול 10%, וחיץ elution מורכב של 0.5 מ &#39;imidazole, 0.1% Triton X-100, 0.5 מ&#39; NaCl, 20 מ&quot;מימ טריס יצטט, pH 7.9, 10 mM MgOAc 2, 0.7 המ&quot;מ ZnOAc 2, גליצרול 10%. מאגרים אלו ישמשו כדי לשטוף את החרוזים לאחר החלבונים המתויגים היו קשורים אליהם, או לelute את החלבונים מהחרוזים, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איפור diluent החיידקים (מים מזוקקים 100 מ&quot;ל עם ריאגנט antifoam 15 μl). פתרון זה ישמשכדי להפוך את הדילולים של התרבויות במהלך לילה החיידקים לצפיפות אופטית (A600) מדידות. הנוכחות של antifoam בdiluent מונעת היווצרות של בועות אוויר שעשוי להפריע למדידות קורא הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המצא פתרון תמוגה המורכב מגיב 10x FastBreak, lysonase μl 2 לדוגמה ו15 המ&quot;מ MgOAc 2. FastBreak מכיל תערובת של חומרי ניקוי ומלחים ששוברים את קירות תא החיידק ולאפשר את שחרורו של חלבונים תאיים. Lysonase היא תערובת קניינית של Lysozyme וnuclease. Lysozyme מסייע בשיבוש דופן התא וnuclease מעכל את חומצות הגרעין של החיידקים שפורסמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: הפוך את פתרון הידרוכלוריד guanidine M 6. החלק מהחלבונים רקומביננטיים נוטים להיצמד למחטי pipetting מצופות טפלון. חלבוני guanidine הידרוכלוריד פתרון denatures ורוחץ אותם בצורה יעילה יותר מאשר מים המשמשים באופן שגרתי כדי לשטוף את טיפי pipetting רובוטיות רחיץ לאחר כל רחep. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מגיב BCA (חומצת bicinchoninic) חלבון quantitation ידי פתרון ערבוב bicinchoninic חומצה (מגיב) ופתרון נחושת סולפט (מגיב ב &#39;): אג&quot;ח פפטיד להפחית Cu 2 + 4 ממרכיב ההווה בריאגנט BCA CuSO עד 1 Cu + לפי הסך של 1 Cu + הוא פרופורציונלי למספר קשרים המצויים בתמיסת פפטיד. בשלב שני, שתי מולקולות של חומצת bicinchoninic chelate 1 Cu + כתוצאה ממשמרת ספיגה ל562 ננומטר, וכתוצאה מצבע סגול. תגובת הצבע היא תלויה זמן ובדרך כלל זקוק לכמה שעות כדי להיות סופי. לאחר שהצבע יציב במשך כמה שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא שקתות או צלחות של הגודל הנכון ולמקם אותם בתפקידים שהוקצו מראש-על הפלטפורמה רובוטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום אחד צלחת 24 גם לפסולת הידרוכלוריד guanidine, שתי צלחות 96-כן ברורות לOD 600 ומדידות ספיגה ואחת כחולה 96-צלחת גם עבור הדואר מטוהר חלבונים על עמדותיהם על הרציף. מקום אחד צלחת 96-deepwell על הדוכן המגנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל MagneHis Ni-חלקיקים שנקשרים לחלבונים על ידי גיבוש chelates עם תגיו 5 מתקפלים במים מזוקקים ולמלא אותם ליחידת חרוז ומסעיר. לעבור על stirrer לשמור את החרוזים בהשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הפלטפורמה רובוטית ולשטוף את מחטי pipetting לכמה דקות כדי להסיר בועות אוויר שאחרת להפריע לדיוק pipetting. מחטי pipetting מחדש השמישות סמוקות בין צעדי pipetting בודדים. לחלופין, טיפים חד פעמיים יכולים לשמש. כל השלבים הבאים מתבצעים כמו רובוט. הפרוטוקול רובוטית זמין על פי בקשה. </li></ol> 3. צמיחת תא מסומן על ידי מדידת OD600 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 μl של תרבות הלילה מדולל ב90 μl של פתרון diluent. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD 600 כדי להבטיח שהחיידקים גדלו צפיפות דומה(איור 1). </li></ol> 4. התאים הם נפרדו כדי לשחרר את החלבונים ואפשר חרוז מחייב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 μl של השעית חרוז Ni מגנטית מופץ לכל אחד גם מצלחת שנייה 24 כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 900 μl של כל תרבות חיידקים בקנה מידה הקטנה מועבר לתוך הצלחת 24 היטב המכילה את החרוזים. הוסף 100 μl של תמהיל 10x FastBreak / lysonase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 24 גם הוא הועבר לפלטפורמה הרועדת לטלטול מהיר (800 סל&quot;ד) למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. קירות תא חיידק הם מופרים על ידי שילוב של כוחות מכאניים ופעולה כימית והחלבונים שמייצרים recombinantly משתחררים לפתרון. עם תגי זיקתם הם נקשרים באופן מיידי את חרוזי ניקל chelating פאראמגנטיים. </li></ol> 5. את החרוזים נשטפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את lysates התא המכיל את החרוזים המגנטיים resuspended מועברים לצלחת 96-deepwell אשר ממוקמת על הסטנד עם מ &#39;מוטות agnetic שגולש בין הבארות. הצלחות גם 96-יש לי תחתית מרובעת בצורה חרוטה המאפשרת הסרה קלה של supernatant. הבארות יכולות להחזיק כרכים של עד 2.1 מ&quot;ל, אבל מלאות בכמויות קטנות בהרבה. זה מאפשר לנו לבצע צעדים נמרצים רועדים ללא זיהום צולב מדגם בהתזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצות פיפטה נשטפות בין שלבי pipetting פרטניים עם 6 מיליון guanidine-HCl. צעד זה הוא חיוני לטיהור TFIIB וחלבונים אחרים &quot;דביקים&quot; כדי למנוע זיהום צולב. עם חלבונים אחרים זה עשוי להיות מספיק כדי לשטוף את המחטים בהרחבה במים בין צעדי pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המוטות המגנטיות של הדוכן המגנטי למשוך את חרוזי פאראמגנטיים, מושכות אותם מהמרכזים של הבארות ולאפשר את מחטי pipetting גישה חופשיה לsupernatant. Supernatant נמחק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 μl של חיץ לשטוף מתווסף לראשונה לצלחת 24 היטב, ולאחר מכן הועבר לצלחת 96 היטב לדוארnsure העברה המלאה של החרוזים. הצלחת 24 גם היא להסיר את המלחייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוד 500 μl של חיץ לשטוף מתווסף ישירות לצלחת 96 היטב, הצלחת מועברת לייקרה ונמרץ מזועזע לדקות 1. הצלחת תועבר חזרה לדוכן המגנטי והחיץ לשטוף מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעד זה חוזר על עצמו פעמים והוא סיים לשטוף הליך על ידי הסרת כל שאריות חיץ מהצלחת. </li></ol> 6. Elute חלבונים במאגר elution <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 μl של חיץ elution מתווסף לחרוזים, הצלחת מועברת לייקרה ונמרץ מזועזע למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלחת תועבר חזרה לייקרה וeluate, המכילה חלבון רקומביננטי המטוהר, מועבר לצלחת חדשה. </li></ol> 7. מדוד את הריכוזים של החלבונים המטוהרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 190 μl תמהיל מגיב BCA מועבר לצלחת ברורה 96-10 וגם μl של פרופתרון טיין הוסיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כמה שעות של דגירה (בדרך כלל 5-6 או לילה), למדוד את הספיגה ולהשוות אותו לסטנדרטי BSA לקביעת ריכוזים של כל אחד מתכשירי החלבון המטוהרים (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלבונים המטוהרים כעת יכולים לשמש ליישומים במורד זרם בריכוזים המתאימים (איור 3). </li></ol> 8. נציג תוצאות פרוטוקול הטיהור מציע שני שלבי בקרת איכות, דוגמאות שמוצגות. אנו מסוגלים לזהות ולתעד את בעיות פוטנציאליות בשלב התפתחות החיידקים (איור 1), ומאוחר יותר על הערכת התשואות של החלבונים המטוהרים (איור 2). אנחנו בדרך כלל לטהר חלבונים ולבחון אותם בשלושה העתקים. זה, בשילוב עם שני שלבי בקרת האיכות, נותן לנו ביטחון שכל וריאציה שנצפינו במבחנים התפקודיים שלנו היא תוצאה של מוטצית phenotypדואר (איור 3), ולא נובע משינויים ניסיוניים או טהרה נכשלה. התשואות שהושגו בדרך כלל טווח 50-200 מיקרוגרם ויותר מדרוש למבחנים פונקציונליים שונים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig1.jpg" /> איור 1. היסטוגרמה של מדידות OD של צלחת גם 24 עם תרבויות לילה. שלושה שיבוטים של כמו גם של wildtype TFIIB 6 גרסות מוטצית TFIIB כבר גדל. שני שיבוטים נושאים שאינם מבטא פלסמיד וגם עם מדיום ישמשו אך ורק כקבוצת ביקורת שלילית. מדידות OD להראות שיש שינויים קטנים בשיעורי הצמיחה בין תרבויות השונות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig2.jpg" /> איור 2. תשואות חלבון המתקבלות מהתרבויות האלה, כפי שנקבע על ידי assay BCA ואושר על ידי SDS PAGE. אחת הגרסות אינה מתבטא ברמות גבוהות. בcombination עם איור 1, אנו יכולים להסיק כי זה לא היה בגלל צמיחת תאי הפרש אך בשל ביטוי חלבון אינו מושרה כראוי. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/4110/4110fig3.jpg" /> איור 3. תוצאת נציג assay שעתוק. אנחנו מדדנו את פעילות הגירוי של וריאנטים TFIIB בייצור של תמלילי נפל קטנים על ידי RNAP. הנה, את ההשפעות של גירוי ספרייה מלאה בחומצת אמינו אחת החלפות של שאריות TFIIB K87 מוצגות. הרמה הגבוהה של שחזור היא אושר על ידי שיעורי טעות קטנות. ג&#39;ל מדגם המציג את הביצועים של שלוש מוטציות לעומת wildtype (wt) פקדים, שליליים (NC) וחיץ elution שולט רק מתואר מתחתיו.

<ol><li>Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+addition+cycle+of+RNA+polymerase+is+controlled+by+two+molecular+hinges+in+the+Bridge+Helix+domain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">The nucleotide addition cycle of RNA polymerase is controlled by two molecular hinges in the Bridge Helix domain.</a> BMC Biol. 8, 1741-7007 (2010).</li>
<li>Nottebaum, S., Tan, L., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+polymerase+factory%3A+a+robotic+in+vitro+assembly+platform+for+high-throughput+production+of+recombinant+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA polymerase factory: a robotic in vitro assembly platform for high-throughput production of recombinant protein complexes.</a> Nucleic Acids Res. 36, 245-252 (2008).</li>
<li>Tan, L., Wiesler, S., Trzaska, D., Carney, H. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridge+helix+and+trigger+loop+perturbations+generate+superactive+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bridge helix and trigger loop perturbations generate superactive RNA polymerases.</a> J. Biol. 7, 40(2008).</li>
<li>Wiesler, S. C., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linker+domain+of+basal+transcription+factor+TFIIB+controls+distinct+recruitment+and+transcription+stimulation+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions.</a> Nucleic Acids Res. 39, 464-474 (2011).</li>
<li>Weinzierl, R. O., Wiesler, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+the+Function+of+TFIIB%5BTitle%5D)+AND+%22Transcription%22%5BJournal%5D)">Revealing the Function of TFIIB.</a> Transcription. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Bell, S. D., Magill, C. P., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+and+regulated+transcription+in+Archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Basal and regulated transcription in Archaea.</a> Biochemical Society transactions. 29, 392-395 (2001).</li>
<li>Parvin, J. D., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+topology+and+a+minimal+set+of+basal+factors+for+transcription+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA topology and a minimal set of basal factors for transcription by RNA polymerase II.</a> Cell. 73, 533-540 (1993).</li>
<li>Tyree, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+minimal+set+of+proteins+that+is+sufficient+for+accurate+initiation+of+transcription+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Identification of a minimal set of proteins that is sufficient for accurate initiation of transcription by RNA polymerase II.</a> Genes. 7, 1254-1265 (1993).</li>
<li>Batada, N. N., Westover, K. D., Bushnell, D. A., Levitt, M., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+nucleoside+triphosphates+and+role+of+the+entry+site+to+the+RNA+polymerase+II+active+center%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diffusion of nucleoside triphosphates and role of the entry site to the RNA polymerase II active center.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17361-17364 (2004).</li>
<li>Liu, X., Bushnell, D. A., Wang, D., Calero, G., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+an+RNA+Polymerase+II-TFIIB+Complex+and+the+Transcription+Initiation+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Structure of an RNA Polymerase II-TFIIB Complex and the Transcription Initiation Mechanism.</a> Science (New York, N.Y). 327, 206-209 (2010).</li>
<li>Kostrewa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+II-TFIIB+structure+and+mechanism+of+transcription+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation.</a> Nature. 462, 323-330 (2010).</li>
<li>Werner, F., Weinzierl, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+modulation+of+RNA+polymerase+core+functions+by+basal+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Direct modulation of RNA polymerase core functions by basal transcription factors.</a> Molecular and cellular biology. 25, 8344-8355 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

השיטה האוטומטית רקומביננטי חלבון הטיהור המתוארת כאן מאפשרת ייצור והטיהור של מספר גדול של חלבוני מוטציה בפורמט קטן בקנה מידה בתנאים לשעתקו מאוד עם התערבות אנושית מינימאלית. איורי 1 ו 2 תוצאות מראות של-בקרת איכות שיטתית ודוגמאות של מטוהר חלבונים. איור 3 מראה כי גורמי השעתוק המטוהר המשמשים בדוגמה זו לבצע באופן לשעתק מאוד במבחנים תפקודיים. למרות שההליך פותח לטיהור archaeal TFIIB, זה ישים לטיהור חלבוני זיקה מתויגת-. השימוש בפרוטוקולי טיהור אוטומטיים כאלה באופן משמעותי ובכך יקל על האנליזה הביוכימית של חלבונים רקומביננטיים ובכך לקדם את ההבנה של אינטראקציות בין חלבונים בקנה מידה שקשה להשיג באופן ידני שלנו.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> בינוני חפת מיידית לינה Express </td><td> מרק הכימיקלים בע&quot;מ </td><td> 71491-4 </td><td></td></tr><tr><td> FastBreak </td><td> Promega בע&quot;מ </td><td> V8573 </td><td></td></tr><tr><td> מגיב Bioprocessing Lysonase / 1 מ&quot;ל </td><td> מרק הכימיקלים בע&quot;מ </td><td> 71230 </td><td></td></tr><tr><td> Antifoam 204 </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> A6426 </td><td></td></tr><tr><td> MagneHis Ni-חלקיקים </td><td> Promega </td><td> V8565 </td><td></td></tr><tr><td> Imidazole </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> 56750 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma בסיס </td><td> סיגמה אולדריץ Compכל בע&quot;מ </td><td> 93362 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> VWR </td><td> 27810.295 </td><td></td></tr><tr><td> קביעת חלבון החומצה Bicinchoninic </td><td> סיגמה אולדריץ בע&quot;מ </td><td> BCA1-1KT </td><td></td></tr><tr><td> באר העמוקה פלייט 2.2 מיליליטר כיכר הוולס PP pk10 </td><td> Anachem בע&quot;מ </td><td> 1810-00 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate microwell 96 קלקר תחתון גם דירה לא טופל 12 שרוולים של 128 מ&quot;מ 5 צלחות ברור 0.4 נפח היטב מיליליטר x 86 המ&quot;מ Thermo Scientific Nunc </td><td> הפישר סיינטיפיק בע&quot;מ </td><td> DIS-984-090M </td><td></td></tr><tr><td> Microplate הכחול </td><td> VWR </td><td> NUNC367001 </td><td></td></tr><tr><td> RB לוקים 24 ובכן (24) </td><td> Qiagen </td><td> 19583 </td><td></td></tr><tr><td> hydrochloride guanidine </td><td> VWR </td><td> ALFAA13543.0B </td><td></td></tr><tr><td> מחט לכבס TheOnyx </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-317001 </td><td></td></tr><tr><td> Rack מגיב לחרוזים מגנטיים </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8152-035003 </td><td></td></tr><tr><td> צלחת הקורא סינרגיה HT </td><td> BioTek </td><td> 4200-000043 </td><td></td></tr><tr><td> כיסוח הפלטפורמה TheOnyx 44OH/150/100 </td><td> Aviso GmbH </td><td> 8145-050046 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate אכר Variomag Teleshaker </td><td> Inheco </td><td> 3800047 </td><td></td></tr><tr><td> 96-גם סוג המגנט </td><td> Qiagen </td><td> 36915 </td><td></td></tr></tbody></table>

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

רנטגן קריסטלוגרפיה היא שיטת בחירה של קבלת תצוגה מפורטת של המבנה של חלבונים. מחקרים כאלה צריכים להיות מושלמים על ידי ניתוחים ביוכימיים נוספים על מנת לקבל מידע מפורט לגבי יחסי מבנה / תפקוד. התקדמות בטכנולוגיית סינתזת oligonucleotide וגן עושה אסטרטגיות בקנה מידה גדולה יותר ויותר mutagenesis אפשריות, כולל ההחלפה של שאריות היעד על ידי כל 19 חומצות אמינו אחרות. פנוטיפים רווח או פסד--of-פונקציה אז ייאפשרו מסקנות שיטתיות לביצוע, כגון תרומה של שאריות מסוימות לפעילות, יציבות קטליטי חלבון ו / או סגולי אינטראקציה בין חלבונים. כדי לייחס פנוטיפים השונים לאופי המוטציה - ולא לתנאי ניסוי משתנים - הוא חיוני, כדי לטהר ולנתח את החלבונים באופן מבוקר ושחזור. אסטרטגיות תפוקה גבוהה והאוטומציה של פרוטוקולים ידניים עלפלטפורמות רובוטיות נוזל טיפול יצרו הזדמנויות לביצוע נהלים מורכבים כאלה מולקולריים ביולוגיים עם התערבות קטנה אנושית ושיעורי שגיאה מינימאליים 1-5. כאן, אנו מציגים שיטה כללית לטיהור החלבונים רקומביננטיים בתיוג באופן תפוקה גבוהה. במחקר שנערך לאחרונה, אנחנו מוחלים בשיטה זו לחקירה מפורטת מבנה לתפקוד של TFIIB, מרכיב של מנגנון השעתוק הבסיסי. TFIIB הוא הכרחי לשעתוק אמרגן מכוון במבחנה היא חיוני לגיוס פולימראז RNA למורכב preinitiation 6-8. TFIIB מכיל תחום מקשר גמיש החודר את האתר הפעיל מפשעה של RNA פולימראז 9-11. תחום מקשר זה מקנה שתי פעילויות מדידות ביוכימית TFIIB, כלומר (אני) הגירוי של הפעילות הקטליטית בשלב &#39;הנפל&#39; חניכת תמליל, וכן (ii) תרומה נוספת לגיוס ספציפי של RNA פולימראז לpreinitiation 4,5,12 המורכבים. אנחנו נצלנו את שיטת טיהור התפוקה גבוהה כדי לייצר מוטציות מחיקות החלפה אחת, כפולה, משולשת ובתוך מקשר TFIIB ולאחר מכן לנתח אותם במבחנים פונקציונליים להשפעת הגירוי שלהם על הפעילות הקטליטית של RNA פולימראז 4. בסך הכל, אנחנו נוצרנו, מטוהרים ונתח 381 מוטציות - משימה שהייתה זמן רב ומייגע לבצע באופן ידני. שהפקנו וassayed את החלבונים בmultiplicates שאפשר לנו להעריך את כל וריאציות ניסיוניות ונתן לנו מושג ברור על השחזור של התוצאות שלנו. שיטה זו משמשת כפרוטוקול גנרי לטיהור של החלבונים בתיוג ושמש בהצלחה לטיהור חלבונים רקומביננטיים אחרים. הוא מותאם כיום לטיהור של 24 חלבונים אך יכול להיות מותאם כדי לטהר עד 96 חלבונים.

אנו מתארים שיטה לטיהור זיקה מתויגת-של חלבונים רקומביננטי באמצעות רובוטיקה נוזלית לטיפול. שיטה זו היא בדרך כלל ישימה לטיהור בקנה המידה הקטנה של חלבונים המתויגים המסיסים בפורמט תפוקה גבוהה.

קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן היא השיטה המועדפת לקבלת מבט מפורט על מבנה של חלבונים. מחקרים כאלה צריכים להיות מושלמים על ידי ...

מטרת פרוצדורה זו היא לטהר חלבונים רקומביננטיים בעלי תג his באופן בעל תפוקה גבוהה, תוך שימוש בפרוטוקול אוטומטי על גבי פלטפורמה רובוטית. דבר זה מושג תחילה על ידי ביטוי יתר של החלבונים ב-e coli באמצעות תרביות בנפח קטן. לאחר מכן, התאים עוברים ליזיס כימי כדי לשחרר את החלבונים, אשר נקשרים לאחר מכן לחרוזי ניקל מגנטיים.לאחר מכן שוטפים את החרוזים כדי להסיר חלבונים מזוהמים ולהגביר את טהרת החלבונים המבוקשים. לבסוף, מנקים את החלבונים מהחרוזים המגנטיים. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את ריכוז וטהרת החלבונים באמצעות בדיקות BCA ו-SDS page, וכן בדיקות תפקודיות נוספות לקביעת הפעילות של החלבונים.היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן כעת לטהר מספר רב של חלבונים בתנאים זהים עם מינימום התערבות. דבר זה מאפשר להשיג רמה גבוהה של הדירות וממזער טעויות אנוש. שיטה זו שימושית במיוחד למחקר של מספר רב של מוטציות נקודתיות בחלבון מסוים, שכן היא מבטיחה שהשונות בפעילות החלבון נובעת למעשה מהמוטציה ולא מהבדלים בהכנת הדגימות.להכנת תרביות חיידקים ללילה, התחילו במילוי פלטות של 24 בארות במים וחיממו אותן במיקרוגל למשך שתי דקות כדי לעקר אותן. לאחר מכן, רוקנו את המים וחממו את הפלטות שוב במיקרוגל למשך שתי דקות. בעזרת מושבות חיידקים שגודלו טריים שאינם ניתנים להשראה, BL 21 Rosetta two, או מלאי גליצרול קפוא, חסנו 1.5 milliliters של מצע אוטו-אינדוקציה המכיל תערובת של גלוקוז ולאקטוז. שמורו שלוש בארות לכל אחת מבקרות החיוביות והשליליות, ובארה אחת למצע בלבד כביקורת.גדלו את התאים במהירות של 250 RPM למשך 18 שעות בטמפרטורה של 37 °C. הסירו את המכסה והניחו את הפלטה על הפלטפורמה הרובוטית. הפלטפורמה כוללת זרוע תפיסה להעברת עצמים ממיקום אחד למשנהו, זרוע פיפטינג ומיקומים שונים לפלטות ואמבטיות, כולל פלטפורמת ניעור, מערבל חרוזיים מגנטי ופלטפורמה מגנטית.עבור פלטות בעלות 96 בארות, הכין את תמיסורי השטיפה והדילול עבור הליך הטיהור בהתאם לפרוטוקול הכתוב, תוך שימוש ב-100 milliliters של מים מזוקקים וב-15 microliters של סריג נגד קצף. הכן תמיסול לדילול תרביות מהלילה עבור מדידות צפיפות אופטית. הכן תמיסול ליזיס המכיל ריאגנט Fast Break, ליאז ומגנזיום אצטט, והכן תמיסול לבדיקת חלבון BCA.כיוון ש-TF two B נוטה להיצמד למחטי הפיפטינג, הכין תמיסת גואנידין הידרוכלוריד בריכוז six M לשטיפתן. מלא תעלות או פלטות בגודל המתאים עם הבאפרים הרלוונטיים והצב אותן במיקומיהן שהוקצו מראש על הפלטפורמה הרובוטית, במיקומיהן על הפלטפורמה. הנח פלטה אחת בעלת 24 בארות עבור פסולת הגואנידין הידרוכלוריד, שתי פלטות שקופות בעלות 96 בארות עבור מדידות OD 600 ובליעת אור, ופלטה כחולה אחת בעלת 96 בארות עבור החלבונים המופרשים.הנח פלטת 96 בארות עמוקות אחת על המעמד המגנטי. השתמש במים כדי לדלל חלקיקי ניקל של magna hair והוסף אותם ליחידת ערבוב החרוזיים. הפעל את הערבוב כדי לשמור על החרוזיים בסספנסיה.הפעל את הפלטפורמה הרובוטית ושטוף את מחטי הפיפטאה במשך מספר דקות. כדי להסיר בועות אוויר, הנח את הפלטה על פלטפורמת ניעור כדי לבדוק את הגדילה של תרביות תאים שגודלו למשך לילה. דלל 10 µL של תרבית ב-90 µL של תמיסת מדולל, תוך שטיפת הפיפטאות בין ההוספות.לאחר מכן, מדדו את הצפיפות ב-OD 600 כאשר התרביות הגיעו לצפיפויות דומות. העבירו 100 µL של תרחף חרוזי ניקל מגנטיים לבארי של פלטת 24 בארי, והעבירו 900 µL מכל תרבית לבארי תוך שטיפת הפפיתות בין השלבים. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תערובת Fast Break Lyase.הנח את הפלטה על פלטפורמת ניעור במהירות של 800 RPM למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לתאים להתבקע ולחלבונים בעלי תג his להיקשר לחרוצים ולשטוף את החרוצים. העבר אותם לפלטה בעלת 96 בארות על מעמד עם מוטות מגנטיים המרחיקים את החרוצים ממרכזי הבארות, השלף את העלייה (supinate) והשתמש בשישה mo iGuide hydrochloride כדי לשטוף את קצות הפפיטות. לאחר מכן, הוסף 500 microliters של בופר שטיפה לבארות של ה-24.פלטת בארות והעבר את הדגימות לפלטת 96 בארות. לאחר מכן הסר את העלייה. הוסף 500 µL של בופר שטיפה ל-96.פלטת בארות. העבירו את הפלטה למנער ונערה אותה בעוצמה למשך דקה אחת. לאחר מכן, העבירו את הפלטה בחזרה למעמד המגנטי והסירו את חוצץ השטיפה.לאחר השטיפה האחרונה, הוסף 100 µl של בופר אלוציה (elution buffer) לחרוזי הניסוי ונער בעוצמה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבר את התסננת האלוציה (eluate) לפלטה חדשה. כדי לכמת את דגימות החלבון, הוסף 190 µl של ריאגנט BCA לבארות של פלטת 96 בארות שקופה, והוסף לבארות 10 µl מדגימות החלבון.דגרו את הדגימות למשך חמש שעות לפחות ומדדו את הבליעה באמצעות סדרת סטנדרטים של BSA. לאחר מכן, יש לאחסן את החלבונים בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. פרוטוקול הניקוי כולל שני שלבי בקרת איכות.ראשית בשלב גידול החיידקים, ומאוחר יותר בעת הערכת תנובת החלבונים. באמצעות טיהור החלבונים בשלוש חזרות, ניתן לקבוע שכל שונות בבדיקות התפקוד נובעת מהפנוטיפים של המוטנטים ולא נגרמה משינויים ניסיוניים או מטיהורים שלא הצליחו. התנובות נעות בדרך כלל בין 50 ל-200 micrograms והן מספיקות בהחלט לבדיקות תפקוד. לאחר שהטכניקה נלמדת היטב, היא אורכת רק כ-3 שעות, ומלבד הכנת הפלטפורמה, הקמת התרביות ואז איסוף החלבונים המטוהרים, אין צורך לבצע פעולות נוספות.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות תפקודיות. במקרה שלנו, אלו יהיו מגוון של בדיקות שעתוק כדי לחקור כיצד המוטציה של TF two B משנה את השפעתה על הפעילות הקטליטית של ar polymerase.

high-throughput-purification-of-affinity-tagged-recombinant-proteins

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הרומן יעילים שני שלבים זיקה כרומטוגרפיה פרוטוקול פותחה מתואר בפירוט. השיטה מבוססת על תג טיהור קטן עם שתי זיקות מובנה ישים למגוון רחב של חלבונים יעד עם מאפיינים שונים.

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

מקור: בקר, ב. ואחרים. בדיקת דיווח פשוטה מבוססת פלואורסצנציה לזיהוי רכיבים תאיים הנדרשים להעברת שרשרת רעל ריצין A (RTA) בשמרים. J. Vis. Exp. (2017).הסרטון הזה מדגים את טיהור חלבון רקומביננטי עם תגית פוליהיסטידין באמצעות כרומטוגרפיית אפיניטי מבוססת ניקל. הוא מפרט שלבים מרכזיים, כולל פירוק חיידקים באמצעות סוניקציה, הבהרה וסינון של הליזאט, וקשירה סלקטיבית והשחרור של החלבון המטרה באמצעות אימידזול.

 טכניקת כרומטוגרפיית זיקה לטיהור חלבון חיידקי רקומביננטי

בסרטון זה, אנו מדגימים את טכניקת הכרומטוגרפיה של זיקה לניקל לטיהור אנזימי פירופוספוקינאז המתויגים בהיסטידין מחיידקי Clostridium difficile.

טיהור חלבונים מבוסס כרומטוגרפיה של ניקל: טכניקה לטיהור חלבונים רקומביננטיים מתויגים פוליהיסטידין מליזט תאי חיידקים

סרטון זה מדגים טיהור זיקה טנדם – טכניקה לטיהור קומפלקסים חלבוניים מתאים איקריוטים כדי לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון. הקומפלקס מכיל שני חלבונים המסומנים בתגי אפיטופ שונים. עם טיהור המתחם באמצעות שני שרפים בעלי זיקה לשני התגים השונים באופן רציף, נוכחותם של שני החלבונים באלוטה מאשרת את האינטראקציה בין השניים.

בדיקת טיהור זיקה טנדם לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

קומפלקסי חלבונים לזרז תפקודים תאיים מרכזיים. אפיון פונקציונלי והמבני מפורט של מתחמים רבים חיוניים דורש ייצור רקומביננטי. MultiBac הוא מערכת תא baculovirus / חרק מותאם במיוחד לביטוי חלבונים אוקריוטים והמתחמים שלהם. MultiBac יושם כפלטפורמת גישה פתוחה, ונהלי עבודה סטנדרטיים שפותחו על מנת למקסם את התועלת שלו.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

בפרוטוקול הנוכחי, אנו מדגימים שיטה יעילה וחסכונית מאוד בקנה מידה קטן טיהור חלבונים, המאפשרת טיהור של חלבונים רקומביננטיים על ידי באופן ייחודי המשלב GST-תג cleavable והתג שלו קטן.

GST-טיהור: שני שלבי זיקה טיהור פרוטוקול מניב חלבונים מטוהרים באורך מלא

פרוטוקול לביטוי כמותית, תפוקה הגבוהה הקרנה וטיהור אנליטי של חלבוני היתוך מתרבויות חיידקי Escherichia בקנה מידה קטנה מתואר ומוחל על הביטוי של מטרות חלבון הארס של בעלי החיים דיסולפיד עשיר.

הקרנת תפוקה גבוהה ביטוי כמותי וטיהור יישומים לחלבוני ארס רקומביננטי דיסולפיד עשירים הופק ב<em&gt; א coli</em

הליך זה הציג את refolding של התחום מחייב ליגנד periplasmic dCACHE של קמפילובקטר jejuni chemoreceptor Tlp3 מן ההכללה וגופי הטיהור להניב כמויות מיליגרם של חלבון.

שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

מתאם צלחת מרובה עמודות מאפשר לממשק עמודות כרומטוגרפיה עם לוחות איסוף מרובי בארות לזיקה מקבילה או לטיהור חילופי יון המספקים שיטת טיהור חלבון חסכונית בעלת תפוקה גבוהה. זה יכול לשמש תחת כוח הכבידה או ואקום מניב כמויות מיליגרם של חלבון באמצעות מכשור סביר.

מערכת טיהור חלבונים חסכונית ורב-תכליתית בעלת תפוקה גבוהה באמצעות מתאם צלחת רב-עמודות

מחקרים מבניים וביוכימיים של מובילי ממברנות אנושיים דורשים כמויות מיליגרם של חלבון יציב, שלם והומוגני. כאן אנו מתארים שיטות ניתנות להרחבה לסינון, ביטוי וטיהור מובילי מומסים אנושיים באמצעות גנים ממוטבים לקודון.

ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה של נשאי מומסים אנושיים למחקרים מבניים וביוכימיים

מאמר זה מספק הליך לטיהור זיקה של חלבון רקומביננטי אנושי, דש אנדונוקלאז 1 (FEN1), אשר תויג בתג 6X-היסטידין. הפרוטוקול כולל שימוש בשני עמודי יונים מתכתיים משותקים נפרדים לטיהור החלבון המתויג.

טיהור זיקה של חלבון 6X-His-Tagged באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית של חלבון מהיר 

למד שיטה לאוטומציה של טיהור חלבונים מתויגי-היס בקנה מידה גבוה באמצעות רובוטיקה לטיפול בנוזלים. טכניקה זו מייעלת ניסויים בביוכימיה ומפחיתה שגיאות אנוש.

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

גלה סרטונים נוספים