עיבוד של רקמת גידול במוח העיקרית למבחנים בתאי גזע וזרימת מיון

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור תאים יוזמים של גידול מוח במבחנה. זה מושג תחילה על ידי פירוק מכני ואנזימטי של גידולים אנושיים ראשוניים ולאחר מכן תרבית אותם בתנאי תרבית ללא סרום תאי גזע. היווצרות הכדור הבא מנוטרת במשך שלושה עד חמישה ימים.

לאחר מכן כדורי הגידול מתעכלים שוב אנזימטית, וסמני פני השטח שלהם מוערכים על ידי ציטומטריית זרימה. השלב האחרון הוא מיון התאים הרצויים ל-96 לוחות באר או שקופיות רשת PL לאפיון נוסף. בסופו של דבר, ניתן להעריך את יכולת החידוש העצמי וביטוי הגנים הדיפרנציאלי של האוכלוסייה הממוינה על ידי הגבלת ניתוח דילול ו-R-T-P-C-R של תא בודד.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניתוח גידול בתפזורת, הוא שהיא מבודדת באופן פרוספקטיבי את אוכלוסיות התאים או תאי הגזע הסרטניים של גידול המוח. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר יישמנו את תנאי התרבית ששימשו במקור לתאי גזע עצביים רגילים על מגוון גידולי מוח אנושיים, וגילינו ששיטת תרבית זו שנבחרה במיוחד עבור אוכלוסיות דמויות תאי גזע המדגימות את ההליך יהיו עמיתי מחקר פוסט-דוקטורט CHITRA AL, סטודנטים לתארים מתקדמים ב-CHITRA AL, סובין ואן מאנן ושרה נולטה, וטכנאית ציטומטריית הזרימה שלנו ניקול מקפרלנד, כולן מהמעבדה שלנו התחילו בהוספת 200 מיקרוליטר של ליאז הפשרה ל-15 מיליליטר של נוזל מוחי מלאכותי בעמוד השדרה או CSF, ולאחר מכן הכנסת הצינור לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. הביאו תמיסת אמוניום כלוריד לטמפרטורת החדר גם בשלב זה.

לאחר מכן, בחמישה מיליליטר של CSF למיכל דגימה של רקמת גידול במוח, סובבו את המיכל לשטיפה ואז צנרת אותו מהנוזל כדי להסיר את כדוריות הדם האדומות. כעת העבירו את הרקמה לצלחת פטרי סטרילית של 100 מילימטר והשתמשו במספריים עדינים ומלקחיים כדי לפרק את הרקמה לעקביות תרחיץ. לאחר מכן אסוף את הדגימה באמצעות פיפטה רגילה של 10 מיליליטר ומלקחיים והעביר את שברי הרקמה לתוך הצינור המכיל את ה-A CSF המחומם מראש.

עם ליאז, הנח את הצינור על שייקר אינקובטור ב-30 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס. ואז לאחר 15 דקות, סנן את ליזט הרקמה דרך מסננת תאים של שבעה מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. סובב את המסנן כלפי מטה במשך חמש דקות בחום של 280 GS בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן הסר בזהירות את החטף והעריך את גודל וצבע הגלולה המתקבלת. לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של PBS ולאחר מכן הוסיפו כמות מתאימה של תמיסת אמוניום כלוריד בהתבסס על גודל הגלולה וזיהום התאים האדומים. לאחר מכן לאחר חמש דקות דגירה בטמפרטורת החדר, סובב את התאים לאחר שטיפה שנייה ב-PBS, השהה מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מדיום שלם של תאי גזע עצביים, ולאחר מכן העביר את תרחיף התאים לצלחת תרבית רקמה נמוכה במיוחד של 60 מילימטר בימים הראשונים.

מלאו את התרביות במיליליטר אחד עד שניים של מדיה לפי הצורך, והחליפו את המדיה רק כאשר הצבע הופך לצהוב מעט. התחל בהעברת תרבית הגידול לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. הוסף שניים עד שלושה מיליליטר PBS סטרילי כדי לשטוף את הצלחת ביסודיות ולאחר מכן להוסיף את הכביסה לצינור הגידול.

לאחר סיבוב התאים, הסר את החטף והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד עד שניים של PBS סטרילי ולאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של ליאז. אחד האתגרים של טכניקה זו הוא לשמור על הכדאיות של תאי הגזע המוצקים של הגידול במהלך העיבוד. כל מניפולציה של התאים במהלך התרבות וההדבקה דורשת מגע עדין.

לאחר מכן, דגרו את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שלוש דקות, הסר והעריך חזותית את המתלה. אם נראים גושים מרובים, השתמש בקצה פיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי לחזור בעדינות על אשכול התאים.

כעת שטפו את התאים בחמישה מיליליטר של PBS סטרילי ולאחר מכן לאחר הסרת ה-S supernatant, השעו מחדש את הגלולה ב-500 עד 1000 מיקרוליטר של PBS סטרילי בתוספת שני מילי-מולרי EDTA. לבסוף, לאחר הערכת מספר התאים והכדאיות באמצעות Trian blue, התאם את ספירת התאים למיליון תאים למיליליטר ב-PBS בתוספת EDTA. התחל בהעברת 100 מיקרוליטר של מתלה התאים לכל בדיקה לצינורות זרימה בודדים של 12 על 75 מילימטר.

לאחר הוספת הנוגדנים המתאימים, דגרו את הדגימות על קרח למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטפו כל נוגדן לא קשור בשני מיליליטר PBS בתוספת EDTA לכל צינור. כעת יש לשפוך את תמיסת הכביסה, למחוק את הצינורות ואז להשהות מחדש את כדורי התא ב-300 מיקרוליטר נוספים של PBS בתוספת EDTA. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של צבע הכדאיות A a D לכל צינור.

לאחר דגירה של הצינורות במשך 15 דקות לפחות על קרח, התאים מוכנים לניתוח זרימה ציטומטרי. לאחר שימוש בדגימת הבקרה השלילית כדי להתאים את פרמטרי הפיזור קדימה וצדדית, צייר אזור סביב התאים המעניינים בדומה לזה המוצג בתרשים העליון המייצג הזה. התאם את המתח בגלאי הקרינה המשמשים להצבת התאים השליליים בשני העשורים הראשונים לפי הצורך.

לאחר מכן, השתמש בצבע הכדאיות 7 A a d כדי ליצור אזור שני להרחקת תאים מתים בדומה לאזור המוצג בתרשים העליון המייצג הזה. לאחר מכן החל גם את שערי הפיזור וגם את שערי התא החי על כל חלקות הקרינה והשתמש בפקדים המוכתמים הבודדים כדי להחסיר כל חפיפה ספקטרלית. לבסוף, הפעל את הדגימות.

התחל את בדיקת הדילול המגביל על ידי מיון התאים המנותקים בדילול משתנה לתא בודד לכל באר לבארות בודדות של צלחת 96 בארות המכילה 200 מיקרוליטר של נוירוספירות מדיה NSC נוצרות בדרך כלל לאורך תקופה של שבעה ימים וניתן לחשב את קצב היווצרות הכדור שלאחר מכן במהלך שבעת הימים האחרונים בתרבית עבור תא בודד R-T-P-C-R. לאחר מיון תאים בודדים מהאוכלוסיות המעניינות לאתרי התגובה של שקופית רשת בשפע, הוסף מיקרוליטר אחד של תערובת מאסטר למרכז כל אתר תגובה, ולאחר מכן צפה מיד כל אתר בחמישה מיקרוליטר של תמיסת תקרה. לאחר מכן בעזרת מחזורי שקופיות במהירות רבה, דגרו את המגלשה למשך שלושה מחזורי טמפרטורה.

לאחר השעתוק ההפוך, הוסף שלושה מיקרוליטרים של מים נטולי רס של DN a לכל אתר תגובה. לאחר מכן העבירו את כל התערובת מכל אתר תגובה לצינורות PCR בודדים. לבסוף, לכימות בזמן אמת, הפעל את הדגימות על מחזור BioRad.

איור ראשון זה מציג סריקת הדמיית תהודה מגנטית של חולה מייצג עם גליובלסטומה. ניתן לתייג את תאי הגידול המנותקים עם סמני תאי הגזע של פני השטח העצביים, CD 1 33 ו- CD 15, ולנתח אותם על ידי ציטומטריית זרימה כפי שמוצג בתרשים הנקודות המייצג הזה. כאן, מוצגת עלילת ההגברה עבור תגובת R-T-P-C-R מייצגת של תא בודד.

ניתן להשתמש בערכי ה-CT המתקבלים מתרשים כזה כדי לחשב את רמות הביטוי היחסיות של הגנים המעניינים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להפריד אנזימטית ולתרבית רקמת גידול מוח ראשונית כדי להעשיר את אוכלוסיות תאי הגזע. תדע גם כיצד לחקור את יכולת ההתחדשות העצמית וביטוי הגנים הדיפרנציאלי של אוכלוסיות תאי גזע ממוינות על ידי ביצוע ניתוח דילול מגביל או R-T-P-C-R של תא בודד.