מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

מטרת סרטון זה היא לתאר פרוצדורה לאפיון של מעבר חדירות מיטוכונדריאלי. פתיחה לקויה במיטוכונדריה שבודדו מלב עכבר. ראשית, המיטוכונדריה מבודדות מלבבות של עכברים.

באמצעות שיטת סנטריפוגציה דיפרנציאלית, מוערכת לאחר מכן איכות המיטוכונדריה המבודלות באמצעות אלקטרודת חמצן תרמית המחוברת למחשב, כדי למדוד את יחס הבקרת הנשימה ולהעריך את שלמות הממברנה המיטוכונדריאלית. לאחר מכן, באמצעות מכשור ספקטרו-פלואורומטרי, נעשה שימוש במדידה סימולטנית של הטיפול בסידן, פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ונפח המיטוכונדריה כדי לקבוע את מעבר החדירות (permeability transition). פתיחה לקויה.

הנתונים שהתקבלו הראו הבדלים ביכולת שימור הסידן ובמעבר חדירות המיטוכונדריה. רגישות נמוכה של מיטוכונדריה מבודדת, פתיחה של נקב מעבר חדירות המיטוכונדריה, היא תופעה מורכבת הכוללת שינויים במספר רמות בפיזיולוגיה ובאנאטומיה של המיטוכונדריה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שמדידה של פרמטרים מרובים בו-זמנית מספקת תמונה מקיפה יותר של התופעה מאשר מדידה של פרמטרים בודדים בלבד, כגון סידן, גיוס או נפיחות. לפני תחילת הפרוצדורה, הפשיר את בופר בידוד המיטוכונדריה ובדוק את ה-pH, שאמור להיות 7.4. לאחר מכן, הנח את כל הבופרים, הצלחות והמבחנות שבהם תשתמש על קרח. שים לב שכל שלבי הפרוטוקול לבידוד מיטוכונדריה חייבים להתבצע על קרח.

הניחו את הלבבות מעכברים שהורדמו בצלחת פטרי ושטפו דם שנותר באמצעות בופר בידוד מיטוכונדריה קר. לאחר מכן, העבירו את הלבבות לצלחת פטרי חדשה בעזרת להב, הסירו את השומן ואת העליות, וקצצו את הלבבות עד לקבלת תוצר הומוגני.

העבירו את הלבבות הקצוצים למבחנה קונית של 50 milliliter. הוסיפו 10 milliliters של בופר לבידוד מיטוכונדריה עם 0.1 milligram per milliliter tripsin, והניחו לדגימה לעבור עיכול על קרח למשך 10 דקות. שימו לב כי שימוש ב-trypsin מעלה את תנובת המיטוכונדריה המבודדת ויש לשמור על ריכוז קבוע בין הכנות מיטוכונדריה שונות.

עם זאת, אנו ממליצים לבחון את התפקוד של מיטוכונדריה מבודדת בדגימות שהושגו ללא טריפסין, כדי להבטיח שהאנזים אינו מפריע לאיוניהן. לאחר האינקובציה, יש להוסיף 10 milliliters של באפר לבידוד מיטוכונדריה המכיל 0.1%fatty acid-free, BS, a, וחמישה milligrams של מעכב טריפסין, ולערבב על ידי הפיכת המבחנה מספר פעמים. כדי לנטרל את הטריפסין, יש להשיג את הרקמה שעברה עיכול באמצעות סנטריפוגציה במהירות נמוכה עד בינונית למשך דקה אחת בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius.

לאחר סבב הריסוס (Resus), השהה את הרקמה בשמונה מיליליטר של Mitochondrial Isolation buffer עם 0.1% fatty acid-free BSA, תוך שמירת הדגימה על קרח. השתמש במערבל דנז (Dounce homogenizer) ממוטור עם עלי פלסטיק מטפלון כדי להומוגניז את הדגימה באמצעות ארבעה עד שישה מעברים במהירות של 1,200 עד 1,400 RPM. העבר את ההומוגנאט למבחנה קונית של 15 מיליליטר וסבב במ centri-fuge ב-800 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C.

על מנת להשקיע את הגרעינים ושאריות הרקמה. לאחר הסבוב, העבירו את הנוזל העליון המכיל את המיטוכונדריה למבחנות מיקרו-צנטריפוגה וסבבו אותן ב-8,000 ×g למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר הסבוב, תופיע שכבה לבנה בחלקו העליון של המשקע.

השתמש במערכת ואקום כדי לשאוב בזהירות ולהסיר את השכבה הלבנה שמעל למשקע המיטוכונדריאלי. לאחר מכן, השהה מחדש את המשקע הכהה שנותר, המכיל את המיטוכונדריה, ב-1 mL של Mitochondrial Isolation buffer.

בשלב הבא, סובבו את המיטוכונדריה בצנטריפוגה ב-8,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. השליכו את הנוזל העליון (supernatant) והמיסו מחדש את משקע המיטוכונדריה ב-150 µL של Mitochondrial isolation buffer. שמרו את המיטוכונדריה על קרח.

נשימה של מיטוכונדריה מבודדת נמדדת באמצעות אלקטרודת חמצן תרמית (oxy) המחוברת למחשב ונשלטת על ידי תוכנת oxy. Plus; יש לכיול אלקטרודת החמצן ביום הניסוי. הוסף שני מיליליטר של באפר נשימה למיטוכונדריה המכיל ריכוז סופי של 1 µM rotenone לתא ה-oxy, אטום את התא והתחל בהקלטת אות החמצן.

האות שנרשם על ידי המערכת ומוצג על מסך המחשב פרופורציונלי לריכוז החמצן בתא ה-oxy therm. ברגע שאות החמצן יתייצב, יש להוסיף 250 micrograms של מיטוכונדריה ולרשום את הנשימה הבסיסית למשך דקה אחת. הנשימה בנקודה זו צריכה להיות נמוכה מאוד, שכן המיטוכונדריה נושמות על סובסטרטים אנדוגניים.

זהו מצב נשימה 1. הוסף סוצינאט (succinate) לריכוז סופי של 5 mM כדי להתחיל נשימה מיטוכונדריאלית בקומפלקס 2 והקלט את האות למשך דקה אחת. צריכת החמצן צריכה לעלות במהלך מצב נשימה 2.

כדי להשרות נשימה במצב (state), הוסף DP לריכוז סופי של 150 micromolar. בשלב זה, צריכת החמצן אמורה לעלות עקב סינתזה של TP באמצעות פוספורילציה חמצונית. רשום את האות עד שהנשימה תאט, דבר המעיד על צריכת DP ומעבר להקלטת נשימה במצב ארבע.

מצב ארבע, נשימה למשך דקה אחת לפחות. הוסף CCCP לריכוז סופי של 1 µM והקלט את האות למשך דקה אחת. בנקודה זו, הנשימה הבלתי מצומדת (uncoupled respiration) צריכה להיות מקסימלית.

חשבו את יחס הבקרה הנשימתית על ידי חלוקת קצב צריכת החמצן במהלך נשימה במצב שלו (state three) בקצב צריכת החמצן במהלך נשימה במצב ארבעה (state four); ערך RCR היעד צריך להיות גבוה מארבעה. לאחר מכן, כדי להעריך את שלמות ממברנת המיטוכונדריה, גרמו לנשימה במצב שלו במדגם חדש של מיטוכונדריה על ידי הוספת ADP לריכוז סופי של 1 mM.

לאחר מכן, רשמו את צריכת החמצן למשך דקה אחת, הוסיפו 10 micromolar cytochrome C ורשמו את צריכת החמצן למשך שתי עד שלוש דקות. מכיוון ש-cytochrome C אינו חודר דרך ממברנות מיטוכונדריאליות שלמות בתכשיר מיטוכונדריאלי תקין, לא תהיה עלייה או שתהיה עלייה קטנה מאוד בנשימה. עלייה בנשימה מעידה על ממברנות מיטוכונדריאליות פגומות או שבורות.

המיכשור למדידה רב-פרמטרית של פתיחת נקב המעבר של חדירות המיטוכונדריה מורכב מספקטרו-פלואורימטר Quantum Master בעל פליטה כפולה הנשלט במחשב באמצעות תוכנת Felix GX. באמצעות תוכנת Felix GX, צור פרוטוקול רכישה רב-ממדי והזן את הפרמטרים למדידת סידן, פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית ונפיחות עבור הצבעים הרציומטריים Forer ו-JC-1; צור את העקומות הנגזרות עבור Forer ratio ו-JC-1 ratio בלוחית חד-פעמית בעלת ארבעה דפנות מסוג meth ACRL. ערבב 1 mL של באפר בדיקה למיטוכונדריה עם ריכוז סופי של 1 µM rotenone, 5 mM succinate ו-800 nM Forer. הוסף 250 µg של מיטוכונדריה והנח את הדגימה בתא הדגימות של הספקטרו-פלואורימטר.

התחילו להקליט את האותים הפלואורסצנטיים לאחר דקה אחת, השהו את הרכישה, הוסיפו 500 nanomolar JC-1 ולאחר מכן הפעילו מחדש את הרכישה. אות היחס של JC-1 אמור לעלות, דבר המעיד על ספיגת הצבע על ידי מיטוכונדריה פעילה. המשיכו בהקלטה עד שאות ה-JC-1 יגיע לרמת מישור (plateau).

בדרך כלל בתוך חמש דקות, יש להוסיף calcium chloride לריכוז סופי של 20 micromolar. יש לצפות לעלייה מיידית באות של יחס ה-Fluor FF, המייצגת עלייה בנוכחות הסידן בתמיפת הבאפר של הבדיקה, ולאחריה ירידה הדרגתית עקב ספיגת סידן מיטוכונדריאלית. אות יחס ה-JC one אמור להראות ירידה חולפת וקצרה המעידה על דפולריזציה קלה של הממברנה המיטוכונדריאלית.

כאשר אות יחס ה-ER FF חוזר לרמה הבסיסית, בדרך כלל תוך דקה אחת עד 1.5 דקות עם תוספת של עוד 20 micromolar של calcium chloride, המשכו להוסיף פולסים במרווחי זמן קבועים עד שהמיטוכונדריה לא יוכלו לצבור סידן ויתחילו לשחרר סידן אל באפר הבדיקה. פתיחת נקב המעבר של חדירות המיטוכונדריה (Mitochondrial permeability transition port) מוצגת על ידי עלייה מקבילה באות יחס ה-URA FF עקב שחרור הסידן. ירידה ביחס אות ה-JC one עקב קריסת הפוטנציאל הממברנלי וירידה בפיזור האור עקב נפיחות מיטוכונדריאלית בזמן שהמיטוכונדריה מבודדת מעכברי C 56 black six J.

כפי שמוצג בסרטון זה, צריכת החמצן נמדדה לאחר מכן במהלך נשימה במצב 3 (state three) בנוכחות succinate ו-ADP, ובמהלך נשימה במצב 4 (state four) לאחר צריכת ה-ADP. כפי שמוצג כאן, הוספת ADP מגבירה את צריכת החמצן עקב פוספורילציה חמצונית, ולאחר מכן צריכת החמצן מואטת. לאחר שכל ה-ADP נצרך, נמדדת תגובת המיטוכונדריה המבודדת לניתוק צימוד (uncoupling) על ידי הוספת CCCP. בנוכחות CCCP, קצב צריכת החמצן גבוה יותר מאשר במהלך נשימה במצב 3, וזאת כדי להעריך את שלמות הממברנה של המיטוכונדריה המבודדת.

צריכת החמצן נמדדה בנוכחות סוקסינאט (succinate) ו-DP ולאחר הוספת ציטוכרום C. כפי שניתן לראות כאן, הוספת ציטוכרום C אינה מעלה באופן משמעותי את צריכת החמצן ביחס ל-DP וסוקסינאט, מה שמעיד על כך שמעטפת המיטוכונדריה השלמה אינה חדירה לציטוכרום C. כדי להעריך את מעבר החדירות המיטוכונדריאלי, נבדקה פתיחה לקויה (poor opening) במיטוכונדריה מבודדת מהלב כאינדיקטור לקיבולת שימור הסידן המיטוכונדריאלית. מעבר החדירות המיטוכונדריאלי. פתיחה לקויה עוררה על ידי הוספות רצופות של 20 micromolar.

סידן כלורי, סידן חוץ-מיטוכונדריאלי ופוטנציאל ממברנה נמדדו באמצעות אינדיקטורים רציומטריים. URA FF מוצג כקו ירוק ו-JC one מוצג כקו אדום; נפיחות של מיטוכונדריה נמדדה על ידי רישום פיזור אור ב-525 nanometers, המוצג כקו שחור. הספציפיות של JC one ואותות הנפיחות נבחנו עם 1 µM CCCP ו-5 µg/mL של הרעל המיקרוביאלי ethin; כפי שניתן לראות כאן, ספיגת סידן על ידי מיטוכונדריה מלווה בדפולריזציה קלה של הממברנה המיטוכונדריאלית.

לאחר ארבעה פולסי סידן, פתיחת נקבובית מעבר חדירות מיטוכונדריאלית נראית כעלייה ב-URA FF המעידה על שחרור סידן. ירידה ב-JC one מעידה על קריסת פוטנציאל ממברנה ועל עלייה בנפח המטריקס המיטוכונדריאלי, הנראית כהפחתה בפיזור האור כמסמן לנפיחות, כדי לאמת את הספציפיות של פתיחת נקבובית מעבר חדירות מיטוכונדריאלית. אותן מדידות בוצעו בנוכחות cyclosporine A, הנקשר לרכיב cyclo fillin D של נקבובית מעבר חדירות מיטוכונדריאלית. כפי שמוצג באיור זה, נוכחות של 1 µM cyclist boring A מגבירה את מספר פולסי calcium chloride הדרושים לפתיחת נקבובית מעבר חדירות מיטוכונדריאלית בהשוואה לדגימת הביקורת.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של האופן שבו ניתן להעריך את פתיחת נקב מעבר החדירות המיטוכונדריאלי (mitochondrial permeability transition pore) במיטוכונדריה מבודדת מהלב. ההיבט המאתגר ביותר של הליך זה הוא השגת מיטוכונדריה מבודדת באיכות גבוהה. לכן, חשוב לבצע מדידות בקרת איכות לפני השימוש במיטוכונדריה לניסויים נוספים.