מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

מטרת סרטון זה היא לתאר הליך לאפיון מעבר החדירות המיטוכונדריאלית. פתיחה לקויה במיטוכונדריה, מבודדת מלב העכבר. ראשית, המיטוכונדריה מבודדים מלבבות עכברים.

באמצעות שיטת הצנטריפוגה הדיפרנציאלית, לאחר מכן מעריכים את איכות המיטוכונדריה המבודדת באמצעות אלקטרודת חמצן תרמית חמצן המחוברת למחשב כדי למדוד את יחס בקרת הנשימה ולהעריך את שלמות הממברנה המיטוכונדריאלית. לאחר מכן באמצעות מכשור מטרי ספקטרו פלואורו, מדידה סימולטנית של טיפול בסידן, פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ונפח המיטוכונדריה משמשים לקביעת מעבר חדירות. פתיחה גרועה.

הנתונים שהתקבלו הראו הבדלים ביכולת אגירת הסידן ובמעבר החדירות המיטוכונדריאלית. רגישות ירודה של מיטוכונדריה מבודדת, פתיחת מעבר החדירות המיטוכונדריאלית. נקבוביות היא תופעה מורכבת הכוללת שינויים בכמה רמות בפיזיולוגיה ובאנטומיה של המיטוכונדריה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות הוא שמדידה של מספר פרמטרים בו זמנית מציעה תמונה מקיפה יותר של התופעה מאשר מדידת פרמטרים בודדים בלבד, כגון סידן, ניוד או נפיחות לפני תחילת ההליך, יש להפשיר את מאגר הבידוד המיטוכונדריאלי ולבדוק את ה-pH, שאמור להיות 7.4. לאחר מכן הניחו את כל המאגרים, הכלים והצינורות שישמשו על קרח. שימו לב שכל השלבים של פרוטוקול בידוד המיטוכונדריה חייבים להתבצע על קרח.

הניחו את הלבבות מעכברים שהומתו על צלחת פטרי ושטפו את כל הדם במיטוכונדריה קרה. מאגר בידוד. לאחר מכן, העבירו את הלבבות לצלחת פטרי חדשה בעזרת להב, הסירו את השומן והפרוזדורים, ואז טחנו את הלבבות עד לקבלת מוצר הומוגני.

מעבירים לבבות טחונים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. הוסף 10 מיליליטר של מאגר בידוד מיטוכונדריה עם 0.1 מיליגרם למיליליטר טריפסין, ואפשר לדגימה להתעכל על קרח במשך 10 דקות. שימו לב שהשימוש בטריפסין מגדיל את התפוקה של מיטוכונדריה מבודדת ויש לשמור על קבוע בין ההכנה המיטוכונדריאלית.

עם זאת, אנו ממליצים לבדוק את הפונקציונליות של מיטוכונדריה מבודדת על תכשירים המתקבלים בהיעדר טריפסין כדי להבטיח שהאנזים אינו מפריע ליונים שלהם. לאחר הדגירה, הוסף 10 מיליליטר של מאגר בידוד מיטוכונדריה המכיל 0.1% ללא חומצות שומן, מעכב טריפסין BS, a וחמישה מיליגרם וערבב על ידי היפוך הצינור מספר פעמים כדי לנטרל את הטריפסין, שחזר את הרקמה המעוכלת במהירות נמוכה עד בינונית. צנטריפוגה למשך דקה אחת של ארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הסיבוב Resus, השעו את הרקמה בשמונה מיליליטר של מאגר בידוד מיטוכונדריה עם BSA נטול חומצות שומן 0.1%, תוך שמירה על הדגימה על קרח. השתמש בהומוגנייזר ריקוד ממונע עם עלי טפלון כדי להומוגניזציה של הדגימה עם ארבעה עד שישה מעברים ב-1, 200 עד 1, 400 סל"ד. העבירו את ההומוגנאט לצינור חרוטי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה בטמפרטורה של 800 פעמים G למשך 10 דקות של ארבע מעלות צלזיוס.

לגלול את הגרעינים ופסולת הרקמות. לאחר הסיבוב, החזר את הסופין המכיל את המיטוכונדריה לצינורות מיקרו צנטריפוגות וצנטריפוגה אותם ב-8,000 פעמים G למשך 15 דקות של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, לגלולה תהיה שכבה לבנה מעליה.

השתמש במערכת ואקום כדי לשאוב בזהירות ולהסיר את השכבה הלבנה על גבי הגלולה המיטוכונדריאלית. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה הכהה יותר שנותרה, המכילה את המיטוכונדריה במיליליטר אחד של מיטוכונדריה. מאגר בידוד.

לאחר מכן צנטריפוגה את המיטוכונדריה ב 8, 000 פעמים G למשך 10 דקות של ארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופינט והשעו מחדש את הגלולה המיטוכונדריאלית. ב-150 מיקרוליטר של מיטוכונדריה, חיץ בידוד, שומרים על המיטוכונדריה על קרח.

נשימה של מיטוכונדריה מבודדת נמדדת באמצעות אלקטרודת חמצן תרמית חמצן המחוברת למחשב ונשלטת על ידי אוקסי. תוכנת הפלוס, יש לכייל את אלקטרודת החמצן ביום הניסוי. הוסף מאגר נשימה מיטוכונדריה של שני מיליליטר המכיל ריכוז סופי של רוטנון מיקרו-מולרי אחד לחמצן החדר, אטום את החדר והתחל להקליט את אות החמצן.

האות המוקלט על ידי המערכת ומוצג על מסך המחשב פרופורציונלי לריכוז החמצן בתא החמצן התרמי. לאחר שאות החמצן יציב, הוסיפו 250 מיקרוגרם מיטוכונדריה והקליטו את הנשימה הבסיסית למשך דקה אחת. הנשימה בשלב זה צריכה להיות נמוכה מאוד מכיוון שהמיטוכונדריה שואפים על מצעים אנדוגניים.

זוהי נשימה של מצב אחד. הוסף סוקסינט לריכוז סופי של חמישה מילימולר כדי להתחיל נשימה מיטוכונדריאלית בקומפלקס שתיים והקלט את האות למשך דקה אחת. צריכת החמצן צריכה לעלות במהלך הנשימה במצב שני.

כדי לגרום לנשימה מצבית, הוסף DP לריכוז סופי של 150 מיקרומולר. בשלב זה, צריכת החמצן אמורה לעלות עקב סינתזת TP באמצעות זרחון חמצוני. הקלט את האות עד שהנשימה מאטה מה שמצביע על צריכת DP ומעבר למצב ארבע רשומת נשימה.

מצב רביעי, נשימה למשך דקה אחת לפחות. הוסף CCCP לריכוז סופי של מיקרוטולר אחד ורשום את האות למשך דקה אחת. בשלב זה, הנשימה הלא צמודה צריכה להיות מקסימלית.

חשב את יחס בקרת הנשימה על ידי חלוקת קצב צריכת החמצן במהלך המצב השלישי. נשימה לפי קצב צריכת החמצן במצב ארבע, נשימה RCR יעד צריכה להיות גדולה מארבע. לאחר מכן, כדי להעריך את שלמות הממברנה המיטוכונדריאלית, לגרום לנשימה במצב שלוש בדגימה חדשה של מיטוכונדריה על ידי הוספת DP לריכוז סופי של מילי-מולר אחד.

לאחר מכן רשום את צריכת החמצן למשך דקה אחת, הוסף 10 ציטוכרום מיקרומולרי C ורשום את צריכת החמצן למשך שתיים-שלוש דקות. מכיוון שציטוכרום C אטום לממברנות מיטוכונדריאליות שלמות בתכשיר מיטוכונדריאלי טוב, לא תהיה עלייה או עלייה קטנה מאוד בנשימה. עלייה בנשימה מעידה על ממברנות מיטוכונדריאליות שבורות או פגומות.

המכשור למדידה רב-פרמטרית של פתח יציאת המעבר של חדירות המיטוכונדריה מורכב ממחשב פלואוריומטר ספקטרו פליטה כפול מאסטר קוונטי הנשלט על ידי תוכנית פליקס GX. באמצעות תוכנית Felix GX, צור פרוטוקול רכישה מולטידי והזן את הפרמטרים למדידת פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית של סידן ונפיחות עבור הצבעים המטריים של היחס, פורר ו-JC אחד מייצרים את העקבות הנגזרים עבור יחס ויחס JC אחד במת' חד פעמי בעל ארבעה צדדים ACRL vete תערובת מאגר בדיקת מיטוכונדריה מיליליטר אחד עם ריכוז סופי של רוטנון מיקרו-מולרי אחד, חמישה מילי-מולרי סוקסינט ו-800 ננו-מולר. עבור FF, הוסף 250 מיקרוגרם של מיטוכונדריה והנח את הדגימה בתא הדגימה של פלואורמטר הספקטרו.

התחל להקליט את האותות הפלואורסצנטיים לאחר דקה אחת, השהה את הרכישה, הוסף 500 ננו-מולרי JC אחד ולאחר מכן הפעל מחדש את הרכישה. אות היחס האחד של JC אמור לעלות המצביע על ספיגת המות על ידי מיטוכונדריה פעילה. המשך להקליט עד שאות JC אחד יגיע למישור.

בדרך כלל תוך חמש דקות, הוסף סידן כלורי לריכוז סופי של 20 מיקרומולר. יש לראות עלייה מיידית באות יחס פלואור FF המייצגת נוכחות סידן מוגברת במאגר הבדיקה, ואחריה ירידה הדרגתית עקב ספיגת סידן מיטוכונדריאלית. אות היחס האחד של JC אמור להציג ירידה חולפת קצרה המעידה על דפולריזציה קלה של הממברנה המיטוכונדריאלית.

כאשר אות יחס ה-ER FF חוזר לרמה הבסיסית, בדרך כלל תוך דקה עד דקה וחצי בעוד 20 מיקרומולר של סידן כלורי, המשך לפעום במרווחי זמן קבועים עד שהמיטוכונדריה לא יכולה לצבור סידן ולהתחיל לשחרר סידן למאגר הבדיקה. פתיחת יציאת מעבר חדירות מיטוכונדריאלית מודגשת על ידי עלייה בו-זמנית באות יחס ה-URA FF עקב שחרור סידן. ירידה ביחס האות האחד של JC עקב קריסת פוטנציאל הממברנה וירידה בפיזור האור עקב נפיחות מיטוכונדריאלית במיטוכונדריה בזמן בידוד מעכברי C 56 שחורים שישה J.

כפי שמוצג בסרטון זה, צריכת החמצן נמדדה לאחר מכן במהלך נשימה במצב 3 בנוכחות סוקסינט ו-DP ובמהלך נשימה במצב 4 לאחר צריכת DP כפי שמוצג כאן, תוספת DP מגדילה את צריכת החמצן עקב זרחון חמצוני וצריכת החמצן מואטת. לאחר צריכת כל ה-DP, התגובה של מיטוכונדריה מבודדת לניתוק נמדדת על ידי הוספת CCCP בנוכחות CCCP. קצב צריכת החמצן גבוה יותר מאשר במצב הנשימה השלישי כדי להעריך את שלמות הממברנה של המיטוכונדריה המבודדת.

צריכת החמצן נמדדה בנוכחות סוקסינט ו-DP ולאחר הוספת ציטוכרום C.As שנראה כאן, תוספת של ציטוכרום C אינה מגדילה משמעותית את צריכת החמצן ביחס ל-DP וסוקסינט מה שמצביע על כך שממברנות מיטוכונדריאליות שלמות אינן חדירות לציטוכרום C כדי להעריך מעבר חדירות מיטוכונדריה, פתיחה לקויה במיטוכונדריה של לב מבודד כאינדיקטור ליכולת אגירת סידן מיטוכונדריאלית. מעבר חדירות מיטוכונדריאלית. פתיחה לקויה נגרמה על ידי תוספות עוקבות של 20 מיקרומולר.

סידן כלורי, סידן מיטוכונדריאלי נוסף ופוטנציאל ממברנה נמדדו עם האינדיקטורים המטריים של היחס. URA FF המוצג כעקבה הירוקה ו-JC המוצג כנפיחות העקבות האדומות של המיטוכונדריה נמדד על ידי הקלטת פיזור אור ב-525 ננומטר המוצג על ידי העקבה השחורה. הספציפיות של אותות JC אחד ונפיחות נבדקו עם מיקרומולר אחד, CCCP וחמישה מיקרוגרם למיליליטר של אתין הרעלן המיקרוביאלי כפי שניתן לראות כאן, ספיגת הסידן על ידי המיטוכונדריה מלווה בדפולריזציה קלה של הממברנה המיטוכונדריאלית.

לאחר ארבע פעימות סידן, פתיחת בריכת מעבר חדירות מיטוכונדריאלית נתפסת כעלייה ב-URA FF המצביעה על שחרור סידן. ירידה ב-JC אחת המצביעה על קריסה פוטנציאלית של הממברנה ועלייה בנפח המטריצה המיטוכונדריאלית, הנתפסת כהפחתה בפיזור האור כסמן לנפיחות כדי לאמת את הספציפיות של פתיחת יציאת מעבר חדירות מיטוכונדריאלית. אותן מדידות בוצעו בנוכחות ציקלוספורין A, הנקשר למעבר החדירות המיטוכונדריאלית רכיב מילוי ציקלו D.As המוצג באיור זה, נוכחותו של רוכב אופניים מיקרו-מולרי אחד משעמם A מגדילה את מספר פולסי הסידן כלורי הנדרשים לפתיחת מעבר החדירות המיטוכונדריאלית PO לעומת דגימת הבקרה.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעריך את פתיחת פתח המעבר של חדירות המיטוכונדריה במיטוכונדריה של לב מבודד. ההיבט הקשה ביותר בהליך זה הוא השגת מיטוכונדריה מבודדת באיכות טובה. לכן, חשוב לבצע מדידות בקרת איכות לפני השימוש במיטוכונדריה לניסויים נוספים.