האדם תאים סרטניים נוירואנדוקריניים קווים כמו מודל תלת ממדי לחקר הטיפול האנושי גידול נוירואנדוקריניים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לפתח שיטה קלה ופשוטה לייצור סטרואידים אחידים תלת-ממדיים של גידולים נוירואנדוקריניים, ושיטה פשוטה לעיבוד הטמעת HistoGel לצורך חקר ההיסטולוגיה של סטרואידים אלו. דבר זה מושג על ידי ציפוי אחיד של פלטות 24 באריים ב-aeros, עליהן נזרעים תאי גידול נוירואנדוקריניים אנושיים בתליה של תא בודד. לאחר מכן, הפלטה מדגרה על מנער אורביטלי בתוך האינקובטור למשך הלילה במהירות הנמוכה מ-40 RPM, ולאחר מכן מועברת למדף יציב באינקובטור.

ספרואידים ייווצרו עד היום השלישי או הרביעי, וצמיחתם ושלמותם ינוטרו באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (phase contrast microscopy) על מנת לחקור את ההיסטולוגיה שלהם. הספרואידים התלת-ממדיים יוטמעו ב-HistoGel מחומם לפני עיבוד פרפין שגרתי; תוצאות המתקבלות מראות צמיחה של ספרואידים תלת-ממדיים של גידול נוירואנדוקרי, בהתבסס על תמונות שצולמו במהלך מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה. ההיסטולוגיה של הספרואידים התלת-ממדיים תנותח באמצעות צביעת H&E וצביעה אימונוהיסטוכימית של חתכים מבלוקי פרפין של הספרואידים התלת-ממדיים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת הוא שהיא פשוטה, קלה, אמינה וחסכונית. שיטה זו יכולה לקדם מחקר בתחום גילוי התרופות על ידי סיוע בזיהוי מהיר של תרופות טיפוליות עבור חולי גידולים נוירואנדוקריניים. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בתחילה, לפחות בגידול אורגנואידים תלת-ממדיים בעלי צורה וגודל אחידים.

המפתח לכך הוא להבטיח שפלטות 24 הבארים מצופות באופן אחיד ב-agros, וכן להבטיח שתליית התאים הבודדים מפוזרת היטב ומדויקת. כדי להבין את ההיסטולוגיה של הסטרואידים התלת-ממדיים, עלינו לבצע עיבוד פאראנין וצביעה אימונוכימית. הטמעה היסטולוגית של הסטרואידים התלת-ממדיים היא שלב המפתח שיוצג מאוחר יותר היום. כדי להכין 1% augurs לציפוי פלטות 24 בארים, הוסיפו גרם אחד של aeros ל-100 milliliters של מים דאיוניים בבקבוק של 250 עד 500 milliliters, ובצעו אוטוקלאב כדי לעקר את ה-aeros לאחר הסטריליזציה.

העבירו את הבקבוק למקלח מים בטמפרטורה של 70 °C למשך כשעה. כדי שה-aeros יתקרר ל-70 °C, יש לשמור על סטריליות ה-aeros בכל עת. בתוך קבינת בטיחות ביולוגית, השתמשו בפיפט רפטיטיבי כדי לחלק 200 µL של aeros לכל באער של פלטת 24.

השתמשו בלוחות בעלי תחתית שטוחה עבור פרוטוקול זה. כל סוג של לוחות בעלי 24 בארות עם תחתית שטוחה יתאים, כל עוד ניתן לדמות את הלוחות תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. סובבו את ה-aeros מסביב לבארה כדי שיכסה אותה באופן שווה. 200 µL של aeros הם המינון האופטימלי ליצירת משטח קעור המאפשר לספרואידים ליצור צורות כדוריות עקביות.

לאחר כ-10 דקות, פלטות ה-24 בארות המצופות ב-aeros מוכנות לשימוש. תאי ה-bon one המשמשים בניסוי זה הם תאי גידול נוירואנדוקריני של הלבלב אנושי (NET), המגודלים במצע D-M-E-M-F 12 עם 10% FBS בצלחת תרבית רקמות סטרילית בתוך אינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide. כאשר תאי bon one בשכבה אחת (monolayer) מגיעים ל-70% עד 80% Co fluency, מכינים תרחיפי תאים בודדים בתוך קבלינה לבטיחות ביולוגית.

יש להסיר את המצע ולשטוף את התאים עם PBS פעמיים. יש לנתק את התאים מהצלחת על ידי הוספת 1 mL של TrypLE ודגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך חמש דקות. יש לבדוק תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שכל התאים נתקו מהצלחת, ולאחר מכן להוסיף 9 mL של מצע גידול לטריפסין.

שאיפה ופליטה של תאי העין באמצעות פיפטה מספר פעמים כדי להבטיח תגסוס תאים בודדים אחיד. השתמשו במסננת תאים של 70 מיקרון כדי לסנן את התאים. אספו את התאים המסוננים לאחר ביצוע ספירת תאים, והכינו תגסוס של 5,000 תאים למטרמיליטר ב-D-M-E-M-F 12 עם 10%FBS Medium growth.

יש לקבוע את מספר התאים לזריעה באופן אמפירי, בהתבסס על גודל הספרואידים ביום השישי. באופן אידיאלי, הרצוי הוא להגיע לגודל ספרואיד שבין 300 ל-400 µm בקוטרו. מסיבה זו, אנו זורעים אלף תאים ב-200 µL לכל באר.

כדי להתחיל בהליך זה, העבירו 200 µL של תרחיף תאים בודדים לכל באער מצופה aero בלוחות 24 באערים שהוכנו מראש; אטמו את לוחות 24 הבאערים באמצעות סרט איטום סטרילי למניעת התאיידות. הניחו את לוחות 24 הבאערים מצופי aero המכילים תאי bon one על שייקר אורביטלי בערבוב איטי מאוד, בתוך אינקובטור לח ביכולת 37 °C עם 5% carbon dioxide באוויר, והדגירו למשך הלילה. למחרת בבוקר, העבירו את הלוחות למשטח יציב והמשיכו בגידול התרביות באינקובטור בכל שלושה ימים.

הוסיפו 200 µl של מצע גידול לכל באער בלוחות. כדי להימנע מהפרעה ל-phe, השתמשו בקצה הפפטה בנגיעה בדופן הבאר והניחו למצע לזרום במורד הדופן אל תוך הבאר. עקבו אחר היווצרות OID בלוחות בעלי 24 באערים תחת מיקרוסקופ. הטיפול התרופתי בסטרואידים בתלת-ממד מתחיל ביום השישי של התרבית.

כאשר הספרואידים מגיעים לקוטר של כ-300 עד 400 מיקרון, זה מוגדר כיום אפס לטיפול תרופתי ביום השישי. כל באער בלוחות מכיל כ-400 µL של מצע כדי להבטיח שריכוז התרופות הסופי בכל באער יהיה 1x. עבור כל מינון טיפולי, הכינו ריכוז פי שלושה מהריכוז הרצוי; דללו את הכמות המתאימה של מלאי התרופה ב-5 mL של מצע גידול בתוך מבחנה קונית של 15 mL, כמות המספיקה לשמונה חזרות. ה-PHE בכל שורה בלוחות של 24 באערים מאופיינים כביקורת (vehicle) ומינונים 1, 2, 3, 4 ו-5. ישנן ארבע חזרות לכל מינון טיפולי בכל לוח של 24 באערים.

בדרך כלל מטפלים ב-3D phe בלפחות שתי פלטות של 24 בארות, מה שמעניק לפחות שמונה חזרות עבור כל מינון של הטיפול. לפני הוספת הטיפול לכל בארה, יש לסובב (spin down) את פלטות ה-24 בארות כדי להבטיח שכל העיבוי שעל סרט האיטום יירד לבארה, וזאת בשל תכונת הציפה של הסטרואיד בתלת-ממד. אין להסיר את המצע מכל בארה לאחר הצנטריפוגציה.

כדי למנוע הפרעה לספרואידים, הוסף בזהירות 200 µL מכל מינון של הטיפול לבארים המתאימות, לאורך הדופן של כל אחת מהן. אטום את פלטות 24 הבארים בעזרת סרט איטום והדגר את התרביות באינקובטור לח עם טמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide באוויר. עקב אחר תרביות הסטרואידים בתלת-ממד בכל נקודת זמן נבחרת לאחר הטיפול התרופתי באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.

עדשה עם הגדלה של 5x היא אידיאלית מכיוון שה-PHE גדלים במהירות מעבר לשדה הדמיה של עדשה 10x. רכשו תמונות של הסטרואיד בכל באר בכל נקודת זמן לפני ה-HistoGel. לאחר ההטמעה, הסטרואידים התלת-ממדיים נאספים מלוחיות 24 הבארים ומקובעים ב-10% Formin.

הנח מבחנה של HistoGel קר בתוך כוס כימית מלאה במים. חמם את הכוס במיקרוגל למשך דקה אחת או עד שהג'ל יהיה נוזלי לחלוטין. השאר את המבחנה באותה כוס מלאה במים למשך כל הפרוצדורה.

באמצעות פיפטת פלסטיק חד-פעמית, העבירו את כל הסטרואיד לתבנית הקפאה לביופסיה (biopsy cryo mold). המתינו דקה עד שהסטרואיד ישקע לתחתית תבנית ההקפאה לביופסיה.

נסו להסיר את הנוזל מתבנית הקריו-ביופסיה באמצעות ניירות Kim wipes. דחפו בעדינות רבה את הסטרואיד למרכז התחתית של תבנית הקריו-ביופסיה באמצעות קיסם. לאחר מכן, השתמשו בפיפטת פסטור כדי להחזיק בעדינות רבה את הסטרואיד במרכז תבנית הקריו-ביופסיה.

הוסיפו שכבה דקה של HistoGel מחומם לתבנית הקריו-ביופסיה. אין להוסיף כמות רבה מדי של HistoGel. רק כמות מספיקה לייצוב הסטרואידים במרכז.

השאירו את הסטרואיד בתוך ה-HistoGel למשך דקה עד שתי דקות בטמפרטורת החדר או עד שה-HistoGel יתמצק. מלאו את שאר תבנית הקריו-ביופסיה ב-HistoGel מחומם והניחו לו להתמצק בטמפרטורת החדר למשך כ-10 דקות. רגע לפני הוצאת בלוק ה-HistoGel של ה-OIDs מתבנית הקריו-ביופסיה.

השאירו את תבנית הקריו על קרח למשך דקה אחת, ולאחר מכן הוציאו את בלוק ה-HistoGel הסטרואידי השלם. עטפו את הבלוק בחתיכת נייר עטיפה ביולוגי (bio wrapp) והניחו אותו בקסטה לרקמות וביופסיה. אחסנו את קסטת הרקמות והביופסיה במיכל המכיל 70% ethanol.

בשלב הבא, כאשר התאים גודלו על פלטות 24 בארות מסוג aeros, מבוצעים הליכי עיבוד רקמה שגרתיים להטמעה בפרפין. שורות תאים שונות של NET מראות מורפולוגיות שונות, כפי שניתן לראות כאן. שורת תאי ה-NET מהלבלב האנושי bond one ושורת תאי ה-NET מהריאה האנושית H 7 27 יצרו ספרואידים בתלת-ממד.

בניגוד לכך, qgp one. תאי בטא בלבלב אנושי מראים מסות נקבוביות גדולות דמויות ענב, שאינן נחשבות לספרואידים. לאחר זריעת התאים על פלטת 24 בארות מצופה ב-agros, היווצרות ספרואידים רב-תאיים מתרחשת בדרך כלל עד היום השלישי או הרביעי, והספרואידים הופכים עגולים יותר עד היום השישי.

בשל הגבלה של חומרי הזנה וחמצן, תאים בליבה הצפופה של הסטרואיד מתחילים למות סביב היום ה-10, ובסביבות היום ה-17 הסטרואידים מתחילים להתפרק. בשל הגודל הרב, או במקרים מסוימים בשל פליטת השבב הנמקרי, הסטרואיד יכול בדרך כלל לגדול עד לקוטר של 1000 microns.

בניסוי זה, נבחרו אורגנוידים סטרואידיים תלת-ממדיים ביום השישי כנקודת המוצא לטיפול באמצעות מעכב ההיסטון דה-אצטילאז Trichostatin A או TSA. דווח בעבר כי מעכבי היסטון דה-אצטילאז מראים השפעות אנטי-פרוליפרטיביות ופרו-אפופטוטיות על תאי רשת. תמונות אלו עוקבות אחר המורפולוגיה של האורגנוידים התלת-ממדיים בתחילת הטיפול ולאחר 24, 48, 72 ו-96 שעות.

V מציין טיפול בחומר הנשאי (vehicle), שבמקרה זה הוא DMSO. D1 עד D5 מייצגים טיפול במינונים עולים של TSA. הגודל של OID של כל פרט נאמד באופן אוטומטי באמצעות תוכנת מחשב MATLAB שפותחה באופן מותאם אישית.

נמדדו לפחות שמונה sphs לכל מינון של טיפול ב-TSA בכל נקודת זמן, והתוצאות מוצגות בגרף זה ביחס לחומר הנשאי (vehicle). כל המינונים של TSA הראו דרגה מסוימת של עיכוב גדילה ב-3D OIDs. בריכוזי TSA של 125 nano molar ו-250 nano molar גדילת ה-3D steroids דוכאה באופן חזק כדי להבין את ההיסטולוגיה של ה-net 3D steroid.

צביעת H&E וצביעה אימונוהיסטוכימית בוצעו על ספרואיד תלת-ממדי שגודל במשך 17 ימים. KI 67 הוא סמן לתאים בשלבי התחלקות, בעוד ש-cleaved caspase three הוא סמן לתאים אפופטוטיים. התוצאות מצביעות על כך שהתאים בשכבה החיצונית של הספרואיד התלת-ממדי נמצאים בתהליכי התחלקות פעילים, אך התאים בליבת הספרואיד הם ברובם נמקיים או אפופטוטיים.

בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע בדיקות נוספות, כגון בדיקת CellTiter-Glo, כדי לקבוע את חיוניות התאים של סטרואידים בתלת-ממד אלו. לאחר פיתוחה, ניתן להרחיב טכניקה זו לפלטות של 96 בארות לביצוע סריקות בספיקה גבוהה (high throughput screens), דבר שיסייע לגילוי תרופות טיפוליות במחקר הסרטן.