לומד Proteolysis של cyclin B ברמת התא הבודד באוכלוסיות תאים שלמות

מטרת הליך זה היא לנטר כיצד פרוטאוליזה של ציקלין B מובילה לתחילת האנפהזה וליציאה מהמיטוזה. הדבר משיג תחילה על ידי זריעת תאי repoter snap של ציקלין B על שקופיות מיקרוסקופיה. השלב השני הוא סימון מולקולת ה-reporter snap הכימרית של ציקלין B באמצעות התסריף הפלואורסצנטי TMR star.

בשלב הבא, סדרת התמונות נרכשת בתחנת מיקרוסקופיה. השלב הסופי הוא ניתוח התאים וחישוב עוצמת הפלואורסצנציה של TMR star לאורך זמן, המשקפת את הפרוטאוליזה של cycling B. בסופו של דבר, מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה של תאי דגמי (reporter cells) חיים חושפת את קינטיקת הפרוטאוליזה של cycling B המתרחשת במהלך המיטוזה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ניטור cyclone BGFP, הוא ש-cyclone B SNAP מאפשר ניטור של הפירוק של cyclone B במקום ביטוי של החלבון השלם. תאי ה-snap reporter עבור ניסוי זה גדלים בתחילה באופן א-סינכרוני בפאזה לוגריתמית למשך 48 שעות לפחות. כדי להתחיל, הפרוטוקול לטיפול בטריפסין הוא השמצת תאי snap reporter בתת-קונפלואנסיות לצורך זריעת תאים בתוך שמונה תאי מיקרוסקופ, תוך שמירה על התפלגות קבועה על פני כל שטח תא הצנטריפוגה.

השעה 10,000 תאים ו-Resus ב-350 µL של מצע גידול רגיל ללא פנול אדום. העבר את תרחיף התאים לתא המיקרוסקופ לצורך זריעת תאים בשמונה תאי מיקרוסקופ, כאשר צפיפות התאים המקסימלית תהיה במרכז התא. ראשית, טען את התא עם 300 µL של מצע גידול רגיל ללא פנול אדום.

בשלב הבא, העבירו בזהירות 5,000 תאים למרכז תא המיקרוסקופ לצורך זריעת תאים על פלטות אופטיות מיוחדות בעלות 96 בארות, תוך השגת התפלגות קבועה על פני כל שטח הבארה. סבבו במצנטריפוגה 5,000 תאים ושחזרו אותם ב-300 µL של מצע גידול רגיל ללא פנול אדום, בהתאם למספר הכולל של הבארות המכילות תאים הנדרשות. התאימו את מספר התאים ואת הנפח הכולל של מצע השביקה.

לאחר מכן, העבירו את תרחיף התאים לפלטת 96 בארות לצורך זריעה של התאים על פלטות אופטיקה מיוחדות בעלות 96 בארות, כך שצפיפות התאים המקסימלית תהיה במרכז הבארה. הוסיפו בזהירות 1,500 תאים ב-15 µL של מצע גידול רגיל ללא phenol red, כטיפה קטנה למרכז כל בארה.

פעולה זו תגביל את צמיחת התאים למרכז הבאר. יש לאפשר לכל התאים שנזרעו לצמוח למשך 18 שעות לפחות בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים, 30 דקות לפני תחילת הליך הצביעה. יש לחמם מנות של מצע גידול רגיל ללא phenol red ל-37 °C.

הסובסטרט של ה-snap בהדגמה זו הוא TMR star לצורך טיפול קל. המיסו את ה-TMR star ב-DMSO כדי להשיג תמיסת מלאי בריכוז של 400 micromolar. דללו 0.5 microliters של תמיסתו המלאית של ה-TMR star ב-200 microliters של מצע גידול רגיל, חמים וללא phenol red, כדי להגיע לריכוז סימון סופי של one micromolar. לאחר מכן, הסירו את מצע הגידול הרגיל מהתאים הגדלים באופן אסינכרוני והחליפו אותו במצע הסימון. הדגירו את התאים במצע הסימון למשך 25 דקות בתנאי תרבית סטנדרטיים.

לאחר 25 דקות, יש להסיר את מצע הסימון ולשטוף את התאים ארבע פעמים עם מצע גידול רגיל וחמים נטול phenol red. לאחר השטיפה האחרונה, יש לדגור את התאים ב-300 microliters של מצע גידול רגיל וחמים נטול phenol red למשך 30 דקות לפני ההעברה למיקרוסקופ. החלף את המצע במצע גידול רגיל, טרי וחמים נטול phenol red כדי להסיר שאריות של substrate של snaps שאינו קשור, והעבר את התאים למיקרוסקופ בתוך קופסת styrofoam על גבי בלוק חימום שחומם מראש ל-37 degree Celsius.

כדי למזער את שינויי הטמפרטורה, שעתיים לפני מדידת עוצמת הפלואורסצנציה, יש להתאים את טמפרטורת האוויר בתא האקלים ל-37 °C במצב ייבוש (dry mode), וזאת על מנת להביא את המיקרוסקופ ואת כל מרכיביו לטמפרטורה הרצויה. כדי למנוע התעבשות ולנזק עוקב למיקרוסקופ, חשוב לבצע חימום מקדים לפני קביעת הלחות.

כאשר כל מערכת המיקרוסקופ הגיעה ל-37 °C, כוון את לחות האוויר ל-60% ואת ריכוז הפחמן הדו-חמצני ל-5%. הפעל את תוכנת הסריקה או הרכישה והגדר הגדרות סטנדרטיות. הגדר את מיקומי הבארים המיועדות לניתוח. הגדר את ה-delta T או את זמן מחזור הרכישה ואת המספר המוחלט של מחזורי הרכישה.

בהדגמה זו, פונקציית המיקוד האוטומטי בחומרה (Hardware autofocus) נבחרה מראש לצורך ניתוח של מספר רב יותר של בארות. התחל את הרכישה ופקח על שני מחזורי הרכישה הראשונים.

המיקרוסקופ יתמקד באות ה-GFP של ההיסטון H2, ולאחר מכן תילקח תמונה ראשונה בערוץ זה, לפני שישונה המסנן ותילקח תמונת TMR star התואמת. תהליך זה יחזור על עצמו עבור כל המיקומים בתוך באער ועבור כל אחד מהבארים שייבחנו, לפני חזרה על המחזור הבא. כדי לנתח פרופילים פרוטאוליטיים, הפעל את תוכנת ניתוח ה-scan R.

נתחו את התמונות של גרעיני התאים כפי שהם מוצגים על ידי histone H2 GFP, אשר הוגדרו כאובייקט הראשי באמצעות סף המבוסס על עוצמת האות ואלגוריתם watershed לסיוע בהפרדה בין תאים שכנים. יש ליצור אובייקט משני המורכב מגרעין עם ציטופלזמה לצורך ניתוח TMR*. תכונות חשובות של האובייקט הראשי הן מיקומי X ו-Y, זמן, ועוצמות מקסימליות וממוצעות של GFP עבור האובייקט הראשי, וכן העוצמה הכוללת חלקי השטח.

עבור תת-האובייקט TMR star, עברו למצב מעקב (trace mode) כדי להציג את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של TMR star בתת-האובייקט לאורך זמן, או את עקובות התאים המשויכות לאובייקטים הראשיים שנותחו. בחינה של מספר רב של תאים מאפשרת קבלת מבט ראשוני מייצג ואובייקטיבי, אך ניתן לצמצם את מספר התאים לבדיקה על ידי סינון (gating) של אותן מדידות שנמשכו לפחות 140 מחזורים והכילו עוצמת מקסימום גבוהה של histone H2 GFP. בחרו עקובת תא רלוונטית כדי להציג בו-זמנית את הפלואורסצנציה של histone H2 GFP ו-TMR star ברמת התא הבודד.

באמצעות לחיצה ימנית בעכבר, לחץ על התא הרצוי וצור תמונה שניתן לייצא. גלריה להדגמה של histone H2 GFP ו-cycling B snap TMR star עבור כל נקודת זמן. שנה למצב אוכלוסייה (population mode) בתוכנת ניתוח הסורק, ובצע בחירה (gate) של האזור שבו התא הרצוי מיוצג ב-dot blot.

החיל חלון dot plot חדש על האזור שנבחר (gated region) והצג את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של TMR star לאורך זמן. ייצא את הנתונים ל-Microsoft Excel לצורך חישובים נוספים. האיורים כאן מתארים את קינטיקת ה-Cyclin B, המיוצגת על ידי עקומת עוצמת פלואורסצנציה של TMR star של תא העובר מיטוזה רגילה ללא סימנים של חוסר יישור כרומוזומלי בעת דחיסת הציטופלזמה בעקבות פירוק מעטפת הגרעין, או NEBD, כפי שמוסמן על ידי המשולש האדום; עוצמת הפלואורסצנציה של TMR star מראה עלייה חדה עד להגעה לחלון האיזומורפי.

כאשר התא נכנס לשלב הפרומטפאזה, עוצמת הפלואורסצנציה נותרת ברמה יציבה כל עוד התא ממשיך דרך הפרופאזה והמטפאזה, ולאחר מכן מתחילה לרדת במהירות. ברגע שכל הכרומוזומים ביסלו לוח מטפאזה יציב, ירידה זו קודמת להפרדת הכרומוזומים. במהלך האנפאזה, המסומנת בנקודה הכחולה על העקומה בשלב מאוחר של המיטוזה, הכרומטין מתחיל להתרחב (decondense) והתא מאמץ מורפולוגיה של שלב האנפאזה.

בעוד שעקומת עוצמת הפלואורסצנציה שואפת לפלטו, הנמוך מהפלטו שלפני המיטוזה לאחר התפתחותה. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיטוזה לחקור את האיזון הדק בין מחזוריות, פירוק וסינתזה, המווסתים את התקדמות המיטוזה.