שיטה מעשית ורומן לחלץ הדנ"א הגנומי מערכות דם אוסף לשימור חלבון פלזמה

סרטון זה יתאר שיטה מעשית וחדשנית למיצוי DNA גנומי ממערכת שימור חלבוני פלזמה חדשה מסוג BDP 100, המכונה מבחנות P 100. מיצוי מתוך מבחנות סרום או פלזמה היה הליך נפוץ למדי בעבר, אך השילוב של מבחנת P 100 החדשה ושיטת המיצוי המוצגת כאן מציע גישה חדשנית ופשוטה יותר להשגת DNA באיכות טובה יותר ובמאמץ מופחת משמעותית. פנים מבחנת ה-P 100 מצופה ב-potassium EDTA ובמעכבי פרוטאז (protease inhibitors).

פעולה זו מונעת קרישה ומייצבת חלבונים בפלזמה. דם נאסף למבחנות אלו לצורך השגת פלזמה לבדיקה לאחר סרטיפוגציה. דם המוכל ב-P 100 יופרד לשכבות על בסיס צפיפות, כאשר הפלזמה תהיה בחלק העליון, תאי דם אדומים בתחתית ותאי דם לבנים ביניהם.

שכבת ה-Buffy coat נמצאת בין שתי השכבות הללו. הפקת פלזמה היא בדרך כלל השימוש העיקרי במבחנות אלו. מדידות שונות מבוצעות באמצעות פלזמה זו, כגון רמות של נוגדנים וחלבונים.

שכבת ה-buffy coat נזרקת בדרך כלל, אך כפי שיוצג בסרטון זה, היא מכילה מספיק DNA עבור מספר ניתוחים, כולל ריצוף, גנוטיפיקה, זיהוי סמנים ביולוגיים וכדומה. ה-P one hundreds מורכבים משלושה רכיבים עיקריים: מכסה, מבחנה ומפריד. המפריד המכני נע למקום שמעל שכבת ה-buffy coat.

כדי להשיג גישה לשכבת ה-buffy coat, יש להגדיל את המרחק בין המפריד לשכבה זו. הדבר מתבצע באמצעות הוספה של 17% sucrose. בדרך כלל השכבה נזרקת יחד עם ה-P 102, אך כפי שיוצג בסרטון זה, ניתן להפיק בקלות מספיק DNA משכבה זו כדי לבצע מספר בדיקות אנליטיות לפני שליפת מבחנות P 100 מהמקפיא בטמפרטורה של 80-.

חממו מראש מקבץ מים ל-37 °C, הניחו כל מבחנה מסוג P 100 בתוך מקבץ המים החמים והדגירו למשך כחמש דקות כדי להפשיר את כל הדגימות. לאחר שכל הדגימות הופשרו לחלוטין, יש להסיר כל סרום שנותר מעל המפריד. לאחר מכן, יש להוסיף 5 mL של סוכרוז בריכוז 17% מעל המפריד. לאחר הוספת הסוכרוז, סבבו את כל המבחנות בצנטריפוגה למשך 20 דקות במהירות של 2,500 G. כעת, כאשר המפריד נמצא בחלקו העליון של המבחנה ונקי משכבת התאיים הלבנים והטסיות (buffy coat), ניתן להסיר אותו בקלות.

רססו את 70% ethanol על מגבון כימי ועקרו וו מסיכה על ידי ניגוב יסודי של כל פני השטח. החזיקו את שפופרת ה-P 100 בזווית של 45 מעלות עם מסיכה המעוקרת. התחילו להוציא את המפריד מהשפופרת על ידי משיכה עדינה כלפי מעלה של שפת המפריד והנחתו לתוך שקית פסולת ביולוגית.

כאשר המפריד בחוץ, הסיר כמה שיותר משכבת ה-17% sucrose מבלי להפריע לשכבת ה-buffy coat או לשכבות תאי הדם האדומים; ה-buffy coat צריך להיות כעת השכבה העליונה ביותר במבחנה. העבר שכבה זו למבחנה קונית חדשה ומסומנת של 15 milliliter. נפח ה-buffy coat שיוסר מכל מבחנה יהיה משתנה, אך צריך להיות פחות משלושה milliliters.

כדי לנרמל את הנפח של כל המבחנות, יש להוסיף מספיק PBS (סליין עם בופר פוספט) עד להבאת הנפח של כל מבחנה לשלושה milliliters. כעת, כאשר כל שכבות ה-buffy coat תלויות בנפח שווה, יש להסיר כל תאי דם אדומים שנותרו על ידי הוספה של תשעה milliliters של תמיסת ליזיס לתאי דם אדומים RBC.

בשלב הבא, הפוך את המבחנות מספר פעמים במהלך דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להפריד את תאי הדם האדומים המנותחים משכבת ה-Buffy coat. סבב בצנטריפוגה במשך חמש דקות ב-2,500 G; הסבב יוצר משק ממנו יופק ה-DNA. שפוך את השאריות מכל מבחנה אל תוך מיכל לפסולת ביולוגית נוזלית, והשאר נפח קטן שבו יסומסס המשק מחדש. השתמש במערבל וורטקס (Vortex) כדי לשחרר ולסמסס מחדש את המשק.

הוסיפו שלושה מיליליטר של תמיסת ליזיס לתאים וערבלו במכשיר וורטקס בעוצמה למשך 10 שניות לפחות. לאחר ליזיס התאים, החלבונים וה-DNA תלויים כעת באופן חופשי בתוך התמיסה ויש להפרידם; התחילו בהשקעת חלבונים באמצעות מיליליטר אחד של תמיסת השקעת חלבונים, וערבלו בוורטקס בעוצמה גבוהה למשך 15 שניות לפחות. כעת, סובבו את המבחנות בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-2,500 G כדי להשקיע את החלבונים בתחתית המבחנה במהלך סבב צנטריפוגה זה.

בצעו את השלבים כנדרש. סמנו מבחנה קונית אחת בנפח 15 milliliters עבור כל דגימה המועברת למבחנה חדשה. העבירו שלושה milliliters של 100% isopropanol.

לאחר שהחלבונים שקעו ועברו סרצ'פוגציה, בכל מבחנה אמור להיווצר משקא גדול יחסית ונוזל על שקוף. העבירו את נוזל העל המכיל את ה-DNA מכל מבחנה למבחנת האיסופרופנול המתאימה שהוכנה בשלב הקודם; האיסופרופנול יגרום ל-DNA בתמיסה לשקוע לצורת סיבים לבנים דקים וקטנים. הפכו את כל המבחנות 50 פעמים כדי להבטיח ערבוב טוב. לאחר מכן, סרצ'פוגו את כל המבחנות למשך שלוש דקות במהירות של 2,500 G כדי ליצור משקא DNA. ה-DNA נראה בדרך כלל כמשקא לבן קטן בתחתית המבחנה, עם זאת, תפוקת DNA נמוכה עשויה להיות בלתי נראית לעין. המשיכו עם כל ההפקות עד למדידת הריכוזים.

ללא קשר לנוכחות של משקע DNA, השליכו את האיסו-פרופנול. שטפו את ה-DNA על ידי הוספת 70% ethanol. פעולה זו תסיר רכיבים לא רצויים שנותרו ועשויים להפריע לאנליזות מאוחרות יותר; סבבו בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-2,500 G. כדי להבטיח שמשקע ה-DNA נצמד היטב לתחתית המבחנה, השליכו את כל ה-70% ethanol מהמבחנות, ולאחר מכן הפכו אותן על מגבת נייר נקייה לייבוש באוויר למשך שעה אחת.

אין להשאיר אתנול נראה לעין במבחנות בעת המשך הפרוטוקול. השלב האחרון בתהליך המיצוי הוא השעיה מחדש של ה-DNA בתמיסה. תמיסת הידראציה ל-DNA או מים הם אפשרויות מתאימות עבור רוב תהליכי המיצוי.

עבור דגימות שאינן מפיקות סיבי DNA גלויים או משקעים, או מפיקות מעט מאוד, יש להוסיף 250 µL פחות מתמיסת ההידרטציה של ה-DNA. לאחר מכן, יש לבצע ערבול עדין והדרגתי באמצעות וורטקס כדי להביא את ה-DNA למצב של התהייה. לבסוף, העבירו את כל ה-DNA המותהה למבחנת צנטריפוגה. בשלב זה, ניתן למדוד את ריכוזו וטוהרו של ה-DNA באמצעות NanoDrop או ספקטרופוטומטר אחר.

באופן כללי, רמת הטוהר של ה-DNA צפויה להיות קרובה לזו של DNA שהופק ישירות מדם מלא שהושג במבחנות עם potassium EDTA שנאספו למטרה בלעדית של השגת DNA; הריכוז תלוי בכמות חומר המוצא, אך יכול לנוע בין 50 nanograms per microliter לכמעט 1000 nanograms per microliter, עם ממוצע בטווח של 200 nanograms per microliter. היתרון בשימוש בפרוטוקול זה הוא כפול. ראשית, הוא מאפשר לקלינאים להשתמש בדגימת דם אחת לשתי בדיקות קליניות במקום לדגום דם פעמיים.

שנית, הדבר מפשט את תהליך ההשגה של גישה לתאים המכילים DNA על ידי שימוש במבחנות הפרדה מכניות מודרניות במקום בדורות קודמים. במבחנות הפרדה עם ג'ל מהדור הקודם, הן הג'ל המפריד עצמו והן קריש הדם שימשו כמחסומים לתאים המכילים DNA. בשימוש במבחנות P 100, ניתן להסיר בקלות את המפריד המכני באמצעות הפרדה בצפיפות עם 17%Sucrose.

זהו צילום מסך של קריאת ה-NanoDrop של מיצוי DNA ממוצע. בשימוש בשיטה זו עבור דגימה P 109, המיצוי הניב תמיסה של 250 µL בריכוז של 209 ng/µL של DNA. התוצאה הכוללת הייתה כ-52 µg.

יחס ה-260/280, המדד העיקרי לטוהר ה-DNA, היה בטווח האופטימלי של 1.8 עד 1.9 ועמד על 1.88. מדד משני לטוהר ה-DNA, יחס ה-260/230, היה קרוב לטווח הצפוי של 2 עד 2.2 ועמד על 2.35.

אלו הן תוצאות טיפוסיות למדי. באופן מציאותי, תחלצים ישתנו ביבול ובאיכות, בהתאם לנפח ומצב הדם לפני התחלץ תוך שימוש באלקטרופורזה של ג'ל סטנדרטית עם צביעת thio bromide. בדיקות איכות נוספות מראות כי DNA גנומי שהוצא מנבובות P 100 הוא שלם באותה מידה כ-DNA שהוצא מדם מלא.

דבר זה ניכר מהפס רחב ובהיר המופיע בחלקו העליון של כל נתיב המכיל genomic DNA. לשימוש בפרוטוקול זה במקום בשיטות קודמות יש שני יתרונות מרכזיים. ראשית, הוא מאחד שני דגימות דם, שבדרך כלל היו נדרשות בנפרד, לדגימה אחת.

שנית, פרוטוקול זה מהיר ונקי יותר מפרוטוקול הכולל מבחנות הפרדה עם ג'ל SST טיפוסיות. על ידי ביטול הצורך בפירוק שגרתי של קרישי דם, קלינאים שואבים שתי מבחנות דם כאשר נדרשות בדיקות גנטיות וסרולוגיות. בדרך כלל, משתמשים במבחנת הפרדה עם ג'ל SST המכונה "מכסה זהב" ובמבחנת EDTA של אשלגן המכונה "מכסה סגול"; הסרום מופק ממבחנת ה-SST וה-DNA מופק ממבחנת המכסה הסגול. שימוש בשיטה זו מאפשר שאיבה של מבחנת P 100 אחת עם מכסה אדום בלבד.

בעוד שמוסדות המוכרים את שיטת מפריד הג'ל למיצוי DNA עשויים כבר להשתמש במבחנה אחת הן לבדיקות סרולוגיות והן לבדיקות גנטיות, השיטה המוצגת כאן מהווה שיפור הדרגתי אך משמעותי ביחס לשיטות מפריד הג'ל הקיימות. שתי השיטות דורשות הסרה של סוג כלשהו של מפריד, אם כי ג'ל נוטה להיות פחות נקי ממפריד ג'ל פלסטי.

שפופרות הפרדה דורשות הומוגניזציה של דם קרוש באמצעות רשת תילים לפני מיצוי ה-DNA. תהליך הומוגניזציה זה עלול להיות מלכלך, ומיצוי ה-DNA הופך למסובך יותר כאשר תאי דם אדומים, שאינם מכילים DNA, נוכחים בכמות ניכרת. שיטת מיצוי ה-P 100 מאפשרת הפרדה של תאי דם לבנים המכילים DNA מההמטוקריט, ובכך נותרים מעט תאי דם אדומים שעלולים להפריע למיצוי ה-DNA.

למערכת זו של הפקת DNA מתוך מבחנה של פלזמה מסוג P 100, במקום ממבחנות הפרדה של ג'ל מדורות קודמות, יתרונות רבים. מבחנות P 100 מכילות EDTA, המעכב אנדונוקליאז תלוי מגנזיום, וחומר נוגד קרישה למניעת קרישת דם. התוצאה הסופית היא שלמות גבוהה יותר של ה-DNA בפרוטוקול מיצוי פשוט בהרבה, שכן נמנעת הצורך בריסוק והומוגניזציה של דם קרוש.

בנוסף, ניתן לאחסן את הדם המדולל בפלזמה באنبובות P100 ללא הגבלת זמן, שנבדק עד לשלוש שנים, עד למועד שבו נדרשת הפקת DNA. יתרה מכך, קלינאים יוכלו להפיק נתוני מטופלים שימושיים יותר עם פחות דגימות דם, ובכך להפחית את רמת הלחץ של המטופלים העוברים את הפרוצדורות.