Assay Explant להערכת התנהגות ניידת של mesenchyme הגולגולת

מטרתו של הליך זה היא לנטר את התנהגות תרבית ה-cranial meen chiming תחת תנאי תרבית מוגדרים. השלב הראשון הוא איסוף הקרניים הרחמיות מעכברה בהריון בתזמון ידוע.

8.5 ימים לאחר ההפריה. לאחר הבידוד, העוברים מוסרים מהדסידואה (decidua) ושק החלמון מוסר לצורך גנוטיפיקה. לאחר מכן, אזורי המנח הקרניאליים מבודדים במיקרו-דיסקציה ומועברים לפלטות תרבית רקמה מצופות במטריצה חוץ-תאית.

מניחים לרקמות המושתלות (explants) להיצמד ומגדלים אותן למשך עד 48 שעות בנוכחות או בהיעדר סוכנים פרמקולוגיים מוגדרים. לבסוף, מצלמים את הרקמות המושתלות כדי להראות הבדלים בנדידת תאים. שיטה זו שימושית למענה על שאלות מפתח, כגון מהם נתיבי האיתות וחלבוני המטריקס החוץ-תאי המעורבים בשליטה בהתנהגות ה-cran using kind במהלך הרמת קיפולי העצבים (neuro fold elevation).

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלבי המיקרו-דיסקציה קשים ללמידה ודורשים סבלנות ותרגול כדי להגיע לשליטה בהם. כדי להתחיל, אם תבוצע אימונוהיסטוכימיה, הכינו לוחות כיסוי; אחרת, דלגו על שלב זה וצפו את פלטות תרבית הרקמה ישירות ב-ECM. סטריליזו לוחות כיסוי מעגליים מזכוכית בקוטר 12 millimeter על ידי טבילתם באתנול. הניחו להם להתייבש באוויר. לאחר מכן, הניחו לוח כיסוי סטרילי בכל באער של פלטה בעלת 12 באערים.

עבודו תחת מנדף למינאר (laminar hood). הוסיפו 1 mL של מטריקס חוץ-תאי (extracellular matrix או ECM) כדי לצפות את לביבות הזכוכית (cover slips) או את תחתיתו של פלטת תרבית רקמה. הדגירו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש שעות. לאחר ההדגרה, שאבו את תמיסת ה-ECM ושטפו שלוש פעמים ב-PBS. בשלב זה, ניתן להשתמש בפלטות המצופות באופן מיידי, או לעטוף אותן ולאחסן בטמפרטורה של 4 °C למשך עד שבועיים.

מסייע בהדמיה של העובר השקוף. מכינים לוחיות Syl guard עם רקע שחור עמיד, בהתאם לפרוטוקול היצרן.

הכינו את כלי הניתוח על ידי הכנסת סיכה דקיקה (minutian pin) למחזיק סיכות. השתמשו בבלוק השחזה כדי להשחיז את הפינצטות לאחר שכל ההכנות הושלמו. אספו את הרחם מעכברה בהריון בנקודת זמן של 8.5 ימים לאחר ההחלפה (quot).

העבירו את הרחם המבודד לכלי עם PBS סטרילי ושטפו אותו. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הפרידו את כל דצידואה (decidua) בודדת באמצעות מספריים ופינצטה. הסירו את רקמת החיבור הרחמית בתנועת קריעה, תוך הקפדה שלא להפעיל לחץ שעלול לגרום להוצאת העובר מהדצידואה.

השתמשו בפינצטה כדי לקרוע בזהירות את רקמת הרחם בצד הנגדי לשליה. כדי לחשוף את העובר העטוף בשק החלמון, השתמשו בפינצטה כדי לתלוש את העובר ואת שק החלמון מהשליה והסירו את רקמת הרחם מהצלחת. לאחר מכן, בעזרת קרעים עדינים עם פינצטה, הסירו את שק החלמון מהעובר.

העבירו את שק החלמון למבחנת אפנדורף לצורך גנוטיפינג באמצעות פיפטה; לאחר הבידוד, קבעו את שלב העובר על ידי ספירת הסומיטים. באופן אידיאלי, העובר יהיה בין השלב השישי לעשירי, כלומר שלבי חמיש. בשלב זה, קיפולי העצב רק מתחילים להתרומם, ומורפוגנזה משמעותית של המזנכימה הקראניאלית טרם התרחשה.

לאחר שנקבע שלב ההתפתחות, העבירו את העובר לפלטת הגנה שחורה לתאים (cell guard plate) המכילה DMEM ללא phenol red. ראשית, תחת מיקרוסקופ דיסקציה בהגדלה המקסימלית האפשרית, התמקדו בראש העובר כאשר ביד כל אחת מחזיקים מחט דיסקציה, ובצעו דיסקציה לראש קדמית ל-rmba meres. לאחר מכן, גזרו לאורך קו האמצע לבי.

חלקו את הראש לשני חצאים שווים בעזרת מחט דיסקציה בכל יד. בצעו דיסקציה של השוליים החיצוניים לאורך שולי ראש העובר וקו האמצע. הסירו רקמות מיותרות כדי למנוע בלבול בין המבנים המבוקשים לבין רקמות בלתי רצויות.

האקספלאנט יכיל תאי רב-עצביים של הרכס העצבי הגולגולתי נודדים, מזודרמה פרא-אקסיאלית ואקטודרמה שטחית, כדי להסיר תאים שאינם קשורים היטב. בצעו פיפטינג עדין למעלה ולמטה באמצעות טיפ של פיפטה של 200 microliter. עבור הפיפיטינג, הסירו בזהירות את האקספלאנט באמצעות טיפ של פיפטה.

בכ-10 µL של DMEM, מקם במרכז באר של תרבית רקמה מצופה 20 µL של DMEM חם מועשר ב-15% FBS; כעת ניתן להעביר את צלחת התרבית לאנקובטור לתרבית רקמה. לאחר כשעה עד שעתיים, האקספלנט (explant) ייצמד, וניתן להוסיף 250 µL נוספים של מצע גידול. לאחר כ-24 שעות, האקספלנט יהיה צמוד היטב לזכוכית המכסה.

בשלב זה, ניתן להוסיף סוכנים פרמקולוגיים למצע לאחר 24 שעות נוספות, כאשר התאים ינדדו מהם. בדרך כלל נרכשות תמונות כדי לתעד את המרחק ואת מספר התאים שנדדו מהם. בנקודה זו, מתחילים להופיע סימנים לירידה בחיוניות עם התארכות זמן הדגירה.

להלן דוגמאות לתאים הנודדים מנבטים של קשקש ראשון (cranial me) ו-chix. לאחר 48 שעות בתתי-מצעים שונים, הן הצורה והן הגודל של התאים הנודדים מהרקמה המבודדת (explan) תלויים במצע. הנדידה נתמכה על פיברונקטין, למינין, matrigel, ECM וחומצה היאלורונית.

בעקבות פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון אימונופלואורסצנציה ודימוי חי כדי לחקור לעומק את המסלולים המווסתים את התנהגות ה-cranial mesenchyme במהלך התרוממות מקפלי העצבים.