מודלים של גרורות עצם

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להחדיר תאי גידול באופן שיגרום לצמיחת תאי הגידול בעצם ולהרס עצם עוקב. הדבר משיג תחילה על ידי השהיית תאי הגידול ב-PBS קר והנחתם על קרח. לאחר מכן, מספר תאים מתאים מוחדר לחדר השמאלי של הלב או לטיביה (tibia) של עכבר תחת הרדמה.

לאחר מכן, צמיחת גידול העצם ומדדי העצם מנוטרים לאורך זמן באמצעות טכניקות דימות מרובות. לבסוף, מבוצעת כימות של מדדי הגידול והעצם בנקודת הסיום. בסופו של דבר, שילוב של פלואורסצנציה או לומנסצנציה in vivo ו-ex vivo, רדיוגרפיה דו-ממדית ותלת-ממדית.

Micro CT והיסטולוגיה משמשים להדגמת צמיחת הגידול ושינויים במיקרו-סביבה של העצם ברמה התאית וברמת מבנה הצמיחה. שיטות אלו יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום גרורות הסרטן, כגון אילו גורמים בעצם מאפשרים התנחלות גרורתית של סרטן השד וסרטן הערמונית. את הכנת התאים תדגים אליסה מרקל, עוזרת מחקר במעבדתי, שתתחזק את התאים למשך פחות משבוע.

מגדלים את שיבט תאי ה-MDA-MB-231 המסומנים ב-GFP במצע DMEM המכיל 10% FBS ו-0.1 mg/mL פניצילין-סטרפטומייצין, בטמפרטורה של 37 °C ובסביבה של 5-8% CO2. מעבירים את התאים לדילול של 1:10 כאשר הם מגיעים ל-80-90% התמסכות (confluence). כדי להכין את התאים להעברה, מבצעים להם טריפסיזציה ב-80-90% התמסכות באמצעות 10 mL של 0.15% trypsin-EDTA.

העבירו מיד את התאים לשפופרת קונית של 50 מיליליטר באמצעות DMEM קר מאוד עם 10% FBS, וסבבו בצנטריפוגה למשך חמש דקות. השעיקו מחדש את המשקע בשפופרת קונית של 50 מיליליטר ב-25 מיליליטר של PBS קר מאוד ללא סידן ומגנזיום וספרו את התאים; השעיקו מחדש את התאים ב-PBS קר מאוד בריכוז של 10⁶ תאים למיליליטר עבור הזרקה תוך-לבבית (intracardiac inoculation) ו-250,000 תאים למיליליטר עבור הזרקה תוך-שוקית (intra tibial injection).

לניסויים אלו נעשה שימוש בעכברות נקבות עם מערכת חיסון מוחלשת, בגיל ארבעה עד שישה שבועות, שהוזנו בתזונה מסוג Tela 29 20 x חמישה עד עשרה ימים לפני ההזרקה. לאחר הרדמת העכברה בתא עם 2.5% isof fluorine, העבירו את העכברה תחת מapay עם אוורור למסכת אף והנחיתו את העכברה על גבה. השתמשו בתמיסת 10% povidone iodine כדי לחטא את החזה, ולאחר מכן ב-70% Ethanol.

סמנו את בית החזה של העכבר לצורך ההזרקה בנקודה מרכזית בין השקע הסטרנלי (sternal notch) לבין החלק העליון של תהליך החרב (xiphoid process), מעט משמאל לעצם הסטרנום. לאחר מכן, השתמשו במזרק אינסולין בנפח 300 microliter, מחט gauge 28 באורך חצי אינץ'. שאבו בועה קטנה של אוויר כדי ליצור מרווח בין הבוכנה למניסקוס, ולאחר מכן שאבו 100 microliters של תאים תוך כדי מתיחת עורו של העכבר ביד אחת.

החזיקו את המחט במצב אנכי; הכנסה מוצלחת לתוך החדר השמאלי של הלב תביא להופעת פעימה מובחנת של דם אדום בהיר בתוך המזרק. בעומק זה, לחצו בזהירות על בוכנת המזרק ללא תזוזה משמעותית של המחט, כדי למנוע ניקוב של הלב או דליפה של תאים לחלל החזה. כדי להפחית את טפטוף התאים לחלל החזה, משכו מעט את הבוכנה למעלה כדי ליצור כמות קטנה של לחץ שלילי.

לאחר מכן, משוך את המחט ישירות מהחזה תוך הקפדה להימנע מהטיית המחט בזמן השליפה, שכן פעולה זו עלולה לקרוע את מעטפת הלב ולגרום לדימום. הפעל לחץ עדין על אתר ההזרקה למשך כדקה להפחתת הדימום. בעת הסרת קונוס האף, העבר את העכבר למשטח חימום עד שיהיה בהכרה מלאה.

מיד לפני הפרוצדורה התוך-שוקית (intra tibial), הזרק לעכבר bup printex. לאחר הרדמת העכבר והצבתו במסיכת חמצן (nose cone), נקה את שתי הרגליים ב-10% povidone iodine, ולאחריו באתנול, תוך שימוש בארבע אצבעות ובבוהן.

אחזו בעדינות בממלטוס הלטרלי (הבליטה החיצונית של קרסול), בממלטוס המדיאלי (הבליטה הפנימית של קרסול) ובחצי התחתון של הטיביה (שוקה). לאחר מכן, כופפו את הרגל כך שהברך תהיה גלויה ונגישה. בעזרת 70% ethanol, הרטיבו את העור כדי להגביר את הנראות של רצועת הפיקה שמתחתיו, אשר אמורה להיראות כקו לבן עבה ומובחן בעת אחיזה חזקה בקרסול.

החדירו מחט במידה 28 באורך חצי אינץ' מתחת לפיקה, דרך מרכז רצועת הפיקה, אל תוך האזור האינטרקונדילרי הקדמי בראש השוקה (tibia). הפעילו לחץ יציב וחזק עם פעולת קידוח קלה כדי להנחות בזהירות את המחט דרך לוח הגדילה. עם חדירת המחט אל לוח הגדילה של השוקה, היא תפגוש התנגדות נמוכה משמעותית.

בצעו תנועה צידית עדינה של המחט כדי לוודא שהיא נמצאת בתוך הטיביה ועוברת דרך לוח הגדילה. התנועה תהיה מוגבלת אם המחט נמצאת במיקום הנכון בתוך הטיביה. לחצו באיטיות על הבוכנה כדי להזריק 10 µL של תמיסת תאים.

בשלב זה לא אמורה להורגש התנגדות, או שהיא תהיה מינימלית. לאחר מכן, הוצא את המחט באיטיות. הוצא את העכבר מההרדמה והשאר אותו על משטח חימום עד להחלמתו.

יש לעקוב אחר העכבר פעמיים עד שלוש פעמים בשבוע. טכניקות דימות שונות, כגון לוסיפראז, פלואורסצנציית GFP וצילומי רנטגן, מבוצעות בעכברים תחת הרדמה. הפלואורסצנציה מעידה על אזורי הגידול.

סריקת एस्ट्रון משמשת לאיתור נגעים. הנגעים תואמים לתמונות הפלואורסצנציה. פרטים נוספים על טכניקות ההדמיה ניתן למצוא בחלק הכתוב של פרוטוקול זה.

21 עד 35 ימים לאחר ההזרקה. יש להקריב את העכברים בשיטה המאושרת על ידי ה-IACUC ולאחסן את העצמות ב-4% Formalin. יש לבצע אנליזה ex vivo באמצעות micro CT ו-histomorphometry עם צביעת hematoxylin ו-DSN על העצמות שהבודדו. פרטים נוספים ניתן למצוא בפרוטוקול הכתוב בעקבות הזרקה תוך-לבבית או תוך-שקיית של תאי גידול.

מעקב אחר העכברים מבוצע מדי שבוע באמצעות רדיוגרפיה ופלואורסצנציה או לומינצנציה. נגעים הופכים בדרך כלל לנראים בצילומי רנטגן בין השבוע השני לשלישי. בעוד שהם עשויים להיות נראים בפלואורסצנציה ולומינצנציה כבר בשבוע השני, בהתאם למודל המוצג כאן, הנגעים נראים כחורים כהים בעצם ועשויים להפוך לבולטים יותר עם הזמן. הנגעים כוונתו באופן כמותי באמצעות ניתוח metamorph של צילומי הרנטגן והפלואורסצנציה.

כמותם נקבעה באמצעות תוכנה לרכישת והניתוח של דימות Maestro. בדמות זו, אובדן עצם כמתה באמצעות ניתוח micro CT. נתונים מבניים ומינרליים של העצם ממדידות micro CT מוצגים כתמונות תלת-ממדיות של עצם בריאה ועצם עם גידול, שבה אזורים של הרס העצם מוצגים כשטח ריק.

לאחר מכן בוצע ניתוח גאומטריה מורפולוגית-היסטולוגית לדגימות כדי לקבוע את עומס הגידול ואת יחס נפח העצם לנפח הרקמה. בעת ביצוע הליכים אלו, חשוב לגלות סבלנות ולפרוס כל עכבר בזהירות, תוך ניטור הדוק של העכברים. אם הם מתחילים למות, סביר להניח שהדבר נובע מהצטברות גושים של תאים ויש להכין תאים חדשים באופן מיידי.

הדבר הגרוע ביותר שניתן לעשות הוא להאיץ את הפרוצדורות או להתייאש. זכרו, עם תרגול רב יותר ועם הזמן, תשתפרו ותבצעו את הפעולות במהירות רבה יותר. טכניקות אלו סללו את הדרך עבור חוקרי סרטן ללמוד גרורות בעצם in vivo.