תיאור חזותי של Dissection של מערכת כלי הדם המוחית ומשטח קרום המוח הקשורים ודמה עין המקלעת ממוח חולדה
14 בנובמבר 2012
מצגת וידאו זה מציגה שיטה של קצירת שני המבנים החשובים ביותר בכלי הדם גבוה התומכים תפקוד מוח קדמי. הם המשטח המוחי (שטחי) vasculature יחד עם קרומי מוח קשורים (MAV) ודמה עין המקלעת שהנן הכרחיים לזרימת דם במוח ונוזל שדרה (CSF) הומאוסטזיס.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לנתח ביעילות ובמהירות את חלקי הקליפה והארכנואידים של קרומי המוח וכלי הדם העורקיים הנלווים, לכסות את פני השטח של קליפת המוח הקדמית והמוח האמצעי, התלמוס והקאלי, כמו גם לקצור את מקלעת הכורואיד מהחדרים הצדדיים. זה מושג תחילה על ידי הסרת בלוטת האצטרובל והפרדת קרומי המוח ועצי העורקים למוח הקדמי. שנית, העורקים והעורקים על פני השטח בקליפת המוח מוסרים בזהירות, החל ממעגל הגחון של וויליס, ולאחר מכן ממשיכים למשטחי קליפת המוח הגביים כך שהקליפה והממברנות הארכנואידיות הנותרות נשארות מחוברות לכלי הדם, תוך הקפדה למזער את הקציר של רקמות פני השטח הסמוכות בקליפת המוח.
לאחר מכן, קליפת המוח וסיבי הקומיסורה מנותחים הרחק מהמחיצה וההיפוקמפוס, וחושפים את החדרים הצדדיים כדי לאפשר את קצירת מקלעת הכורואיד. לבסוף, ההיפוקמפוס מוסר, וחושף את התלמוס והקלי של המוח האמצעי. לאחר מכן מנותחים קרומי המוח וכלי הדם הנלווים מעל אזור זה.
בסופו של דבר, ניתן לקבוע את השלמות והספציפיות של קרומי המוח המנותחים וכלי הדם העורקיים הנלווים, כמו גם מקלעת הכורואיד, על ידי השוואת פרופילי ביטוי הגנים של כל אחד מהאזורים הללו. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחקר הקשור לכלי הדם התומכים בתפקוד המוח. הוא כולל קווי דמיון והשוואות והבדלים בתפקוד מקלעת הכורואיד בהשוואה לקרומי המוח וכלי הדם העורקיים הקשורים אליו ביחס לזרימת הדם, תפקוד CSF, עלבונות נוירוטוקסיים וטראומה מוחית.
כדי להתחיל בפרוטוקול זה, הניחו מוחות שזה עתה הוצאו מחולדות מיד לאחר שהן הורדמו לתמיסת מלח קרה כקרח למשך חמש דקות. חשוב לאפשר למוח להתקרר למשך פרק זמן זה לפני הניתוח, כך שניתן יהיה להפריד את ארבעת קרומי המוח וכלי הדם העורקיים הקשורים אליהם או MAV מפני השטח של קליפת המוח. לאחר מכן, הניחו את המוח בתחתית צלחת פטרי מזכוכית המונחת על קרח עם סנטימטר אחד של קרח, קר, תמיסת מלח רגילה או 0.1 נתרן פוספט מולארי ב-pH של 7.4.
כל הנתיחה צריכה להיעשות עם המוח, בעיקר שקוע במי מלח. כדי להתחיל בדיסקציה, הניחו את הצד הגבי של המוח כלפי מעלה בצלחת הפטרי ואתרו את בלוטת האצטרובל, שנמצאת באזור הגחון המקושקש ביותר בין שתי ההמיספרות. רק רוסטרל למוח הקטן וממש מתחת, או על פני קרומי המוח.
מעל הקולי. הסר את בלוטת האצטרובל באמצעות שני מלקחיים קטנים עם קצה כפוף. שימו לב שבלוטת האצטרובל היא בצבע ורוד כמו קליפת המוח, אך לעתים קרובות היא מוקפת בשאריות של שאריות דם וכלי דם מהסרת המוח.
לאחר מכן, הפוך את המוח הפוך בצלחת הפטרי. לאחר מכן הפרד את עורק החוליות והעורקים וקרומי המוח הקטנים יותר המכסים את הפונים מקרומי המוח וכלי הדם של המוח הקדמי. לאחר מכן, התחל בהסרת ה- MAV.
חשוב להתחיל דרך הגחון בתהליך הדיסקציה עם העורקים העיקריים של מעגל וויליס, עורקי המוח האמצעיים והעורקים הקדמיים. לאחר מכן, החל מאחת משתי ההמיספרות, השתמש במלקחיים קטנים עם קצה כפוף כדי לנתק את העורק המתקשר האחורי ממש מאחור לצומת הצוואר הפנימי, ובכך להפריד בין עצי העורקים הקדמיים והאחוריים יותר של המוח הקדמי. לאחר מכן חזור על אותו תהליך עבור חצי הכדור הנגדי.
כעת, אוחזים ב-MCA ובעורק הקדמי עם המלקחיים, מושכים בעדינות לכיוון הגב הקדמי כך שה-MAV המכסה את קליפת המוח הקדמית הגחונית מורם מעל ומסביב לדרכי הריח. זה מסיר חלק גדול מה-MAV המכסה את קליפת המוח הקדמית. סובב את המוח בזווית של 45 עד 90 מעלות לצלחת הפטרי כך שניתן יהיה לשחרר את האזורים הקדמיים יותר של ה-MAV המקיפים את אזורי קליפת המוח הצדדית, לאחוז ב-MCA ובעורקים הקשורים ולמשוך בעדינות גב לאורך קליפת המוח.
במידת הצורך, ניתן להשתמש בקצות המלקחיים כדי להרים ולשחרר את העורקים העיקריים מקליפת המוח במהלך הדיסקציה. כעת, הסר את האזורים הצדדיים האחוריים יותר של ה-MAV. שימו לב שעדיף לעבור מחצי כדור אחד לשני במהלך תהליך קציר זה כדי להבטיח שה-MAV יישאר קר ורווי לחות גם להחליף חצאי כדור אם נתקלים בהתנגדות כלשהי בשחרור ה-MAV מקליפת המוח.
לבסוף, כדי להסיר את האזורים הגביים ביותר של ה-MAV המקיפים את הקורטקס הסומטוסנסורי והמוטורי הראשוני, סובב את הצד הגבי של המוח כלפי מעלה כדי לשחרר את החלק הזה מהמוח, השתמש בקצות המלקחיים לאורך הסינוס הסגיטלי. חלק זה של ה-MAV שנקטף יכול להישמר באופן זמני במי מלח קרים כקרח עד שיהיה צורך בבדיקה וניתוח, או להקפיא לעיבוד מאוחר יותר. לעתים קרובות ה-MAV המכסה את האזורים האחוריים ביותר של קליפת המוח נשאר מחובר.
הסרתו מוצגת בחלק הבא של סרטון זה. כדי להסיר את מקלעת הכורואיד במיקום הראשון, הצד הגבי של המוח כלפי מעלה והחזק אותו במקומו עם המלקחיים הגדולים יותר. לאחר מכן דחף את המלקחיים הקטנים יותר כלפי מטה דרך קו האמצע בין ההמיספרות והשתמש בקצוות כדי לנקב דרך קליפת המוח והקורפוס קלוסום לחלק העליון של קו האמצע של ההיפוקמפוס.
לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי למשוך את קליפת המוח עם קלוסום הרחק מההיפוקמפוס הגבי והמחיצה תוך חשיפת רוב החדר הצדדי. ניתן לאתר ולזהות את מקלעת הכורואיד על ידי הקו האדום הגלי התוחם את העורק הראשי העובר לאורכו. השתמש בשני קצוות המלקחיים כדי לחטט את הדפנות הצדדיות של החדר השלישי ולהגדיל אותו בקצהו המפונק ביותר.
לאחר מכן בעזרת המלקחיים הקטנים, משוך את הקצה הזה של מקלעת הכורואיד לחופשי. לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי להגדיל את האזור הקדמי מאוד בין המחיצה לאזור הפוטמן הזנבי ולמשוך את מקלעת הכורואיד לחופשי גם בקצה זה. בצע גם את אותו הליך בחצי הכדור הנגדי כדי להשיג את מקלעת הכורואיד השנייה שנותרה.
שוב, רקמה זו יכולה להישמר באופן זמני בקרח, קר, מלוח או קפוא לעיבוד מאוחר יותר. כדי להסיר את ה-MAV הנותר המכסה את אזורי ה-coddle האחוריים ביותר של קליפת המוח, ראשית, הסר את כל ההיפוקמפוס משתי ההמיספרות וחושף את ה-MAV מעל התלמוס והקוליקולי. שימו לב שהסרתו של חלק זה של ה-MAV תהיה הרבה פחות קשה מהסרתו מקליפת המוח עבור ה-MAV הנותר.
על ידי אחיזת כלי הדם הגדולים יותר המכסה את החלק הקדמי של התלמוס ומשיכה עדינה בקלילות, כלי דם זה מחובר לרשת הקוקוריקולרית העל-קולרית ומספק דם להיפוקמפוס הגבי ולרשת התלמוס הגבי. משוך משם בקלילות ובסופו של דבר רשת הסופרה תשתחרר ואז ניתן יהיה להגיע לחלקים האחרונים של מעגל העורקים המפונקים. בשלב זה, יש לנקוט בזהירות רבה יותר כדי להסיר את כל ה-MAV שנותר על פני קליפת המוח הראשונית, השמיעתית והחזותית הגרגירית.
יש להסיר את כל ה-MAV האחורי של קליפת המוח האחורית שנקטף עם קטע MAV תלמי וקאלי השני הזה ולהוסיף אותו לקטע ה-MAV הראשון בקליפת המוח שנותח אם יש לנתח אותם בנפרד. לאחר מכן, כדי להשוות פרופילי ביטוי גנים בין קליפת המוח הקודקודית של הסטריאטום לאזורי MAV בתנאי בקרה, ניתן לבצע ניתוח ביטוי גנים באמצעות Agilent 0 1 4 8 7 9 גנום חולדה שלמה, ארבעה על 44, 060 מערכי אוליגונוקלאוטידים של MER. פרטים נוספים על עיבוד, סריקה ואחסון נתונים ראשוני ניתן למצוא ב-Thomas et al.
כאשר הדיסקציה מבוצעת כהלכה. רקמות ה-MAV המתקבלות צריכות להיות בשתי ישויות שלמות במשקל של כ-35 עד 45 מיליגרם בסך הכל. ה-MAV שנותח בתחילה המקיף את רוב קליפת המוח אמור לשקול כ-25 מיליגרם, וזה המכסה את התלמוס, הקלי וקליפת המוח העורפית צריך לשקול כ-15 מיליגרם.
הרקמה צריכה להיות בצבע ורדרד מעט משאריות הדם בכלי הדם. מקלעת הכורואיד הדו-צדדית שנקטפה צריכה להיות בשתי דגימות רקמה שלמות, כל אחת במשקל של מיליגרם עד שניים כפי שניתן לראות כאן. כאן אנו רואים השוואה של פרופילי ביטוי גנים בקליפת המוח הקודקודית של הסטריאטום ו-MAV בתנאי בקרה.
התרשים העליון מראה את הביטוי בסטריאטום בהשוואה לקליפת המוח הקודקודית. בעוד שהתרשים התחתון מראה ביטוי ב-MAV בהשוואה לקליפת המוח הקודקודית, ניתן לראות כי הסטריאטום וקליפת המוח הקודקודית קשורים זה לזה הרבה יותר מאשר ה-MAV. כאן אנו רואים את ביטוי הגנים הדיפרנציאלי ב-MAV בתגובה להיפרתרמיה בהשוואה לביקורת, בתגובה לאמפטמין בהשוואה לביקורת ובהיפרתרמיה לעומת אמפטמין.
לבסוף, כאן אנו רואים גנים עם ביטוי גדול מפי 15 ב-MAV בהשוואה לקליפת המוח הקודקודית והסטריאטום המאופיינים בתפקוד. רבים מהגנים הללו קשורים למערכת כלי הדם ו/או למערכת החיסון. גנים אחרים עם שינויים גדולים מאוד בקפל הם חלבוני מטריצה חוץ-תאיים, טרנספורטרים מוקפצים ומטבוליזם של שומנים וחומצה רטינואית.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להתאזר בסבלנות בעת ניתוח ה-MAV. חשוב גם שהמוח יישאר שקוע בתמיסת מלח איזוטונית או במי מלח עם פוספט במהלך כל הדיסקציה. כמו כן, הוא ממליץ לתרגל את החלק של ה-MAV על ארבע או חמש חולדות לפני השגת רקמות להפקת נתונים ניסיוניים.
סקירה כללית
מצגת וידאו זו מדגימה שיטה לאיסוף כלי הדם המוחיים והפלקסוס הכורואידי, החיוניים לשמירה על זרימת הדם המוחית והומאוסטזיס הנוזל השדרתי.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- ביולוגיה של כלי הדם
- נוירואנטומיה
רקע
- כלי הדם המוחיים והפלקסוס הכורואידי חיוניים לתפקוד המוח.
- הבנת תפקידיהם יכולה לסייע במחקר על דינמיקת הנוזל השדרתי.
- טכניקות ניתוח חיוניות לחקר מבנים אלו.
- פרופילי ביטוי גנים יכולים לחשוף הבדלים פונקציונליים בין רכיבי כלי הדם הללו.
מטרת המחקר
- לפרק ולאסוף באופן יעיל את המנינג'ים וכלי הדם הנלווים.
- לחקור את הקשר בין הפלקסוס הכורואידי ותפקוד הנוזל השדרתי.
- לספק תובנות לגבי פגיעות נוירוטוקסיות וטראומה מוחית.
שיטות ששימשו
- ניתוח של המנינג'ים וכלי הדם העורקיים ממוחות חולדות.
- הסרה זהירה של הפלקסוס הכורואידי מהחדרים הצדדיים.
- שימוש במלקחיים לאיסוף מדויק תוך צמצום נזק לרקמות סמוכות.
- השוואה בין פרופילי ביטוי גנים כדי להעריך את שלמות הרקמות שנאספו.
תוצאות עיקריות
- פרק מוצלח של המנינג'ים וכלי הדם הנלווים.
- איסוף הפלקסוס הכורואידי הושג עם נזק מינימלי לרקמות.
- ניתוח ביטוי גנים הראה פרופילים שונים לכל אזור שנאסף.
- תובנות שהושגו לגבי התפקידים הפונקציונליים של הפלקסוס הכורואידי והמנינג'ים.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה אמינה לחקר מבני כלי הדם במוח.
- הבנת רכיבים אלו יכולה לשפר את הידע על דינמיקת הנוזל השדרתי.
- מחקר עתידי יכול לבנות על ממצאים אלו כדי לטפל בתפקוד המוח ובפתולוגיה.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma researchers to isolate and analyze two critical neurovascular structures—the meninges-associated vasculature (MAV) and choroid plexus—supporting target validation in CNS drug discovery. By providing biochemically viable tissue for gene expression profiling, it facilitates mechanistic de-risking of vascular and fluid homeostasis pathways implicated in neurodegenerative and neuropsychiatric disorders. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking vascular function to neurotoxic insults such as amphetamine exposure and hyperthermia.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular and immune-related gene expression in MAV to validate targets involved in neurovascular coupling and blood-brain barrier function.
- Operational Value: Provides a standardized dissection workflow yielding intact MAV and choroid plexus tissues suitable for downstream omics analysis.
- Predictive Value: Supports biomarker discovery by revealing differential gene expression in response to neurotoxic challenges, aiding in target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates tissue preparations with preserved vascular integrity, enabling reliable assay development for cerebrovascular and CSF-regulating targets.
- Operational Value: Dissection takes 5–10 minutes, allowing high-throughput tissue preparation for screening campaigns.
- Reproducibility Value: Consistent harvesting of MAV (~25–35 mg cortex-associated, ~15 mg thalamic) and choroid plexus (1–2 mg per side) supports standardized input for comparative analyses.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Harvested tissues are disease-relevant models for studying vascular responses to insults mimicking clinical conditions such as traumatic brain injury and neurotoxicity.
- Mechanistic De-risking: Gene expression comparisons between MAV, choroid plexus, and cortical regions help de-risk targets by clarifying vascular-specific versus CNS-parenchymal signaling.
- Preclinical Continuity: Enables longitudinal assessment of vascular target engagement across discovery to preclinical stages using consistent tissue isolation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation and feeding into lead identification through vascular pathway elucidation.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification by isolating meningeal vasculature and choroid plexus to study their distinct roles in cerebral blood flow and CSF homeostasis.
- Screening: Produces standardized tissue inputs enabling reproducible compound testing in vascular and neuroimmune assays.
- Analytics: Generates quantitative gene expression outputs (e.g., via Agilent whole rat genome arrays) that allow comparison of vascular responses across experimental conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking MAV and choroid plexus molecular profiles to pathophysiological states such as hyperthermia-induced neurotoxicity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue isolation platform applicable across multiple CNS projects studying vascular, meningeal, or choroid plexus targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in neurovascular and CSF-related pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized dissection technique and tissue handling in isotonic saline.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early vascular response data, reducing late-stage failure risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on vascular target engagement and functional relevance to brain homeostasis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy and microsurgical dissection techniques to isolate delicate meningeal and vascular tissues.
- Dependent on dissection instrumentation such as fine forceps and controlled environment (ice-cold saline) to maintain tissue viability.
- Necessitates cross-team standardization between histology, molecular biology, and pharmacology teams for consistent tissue preparation and analysis.
- Adaptation considerations include adjusting dissection depth for different rat strains or ages to avoid cortical contamination.
- Practical limitation: Risk of meningeal tearing or vascular damage if dissection is performed too rapidly or without proper tissue hydration.
