הזרקת subretinal של וקטורי ריפוי גנטי ותאי גזע לעיניים המאוסות
25 בנובמבר 2012
טכניקה ניתוחית זו ממחישה את הזריקה של וקטורים בריפוי גנטי ותאי גזע לתוך חלל subretinal של עין העכבר.
השלב הראשון הוא הרכבת המכשיר מתוך ערכה לאיסוף דם. גזרו מחט בכיל 25 ורבע (25 3/4 gauge) מקטע של 8 cm של צינור סטרילי. באמצעות חיבור מסוג lure lock, ניתן לרכוש מחט קפילרית מזכוכית בקוטר של 100 micron, או להכין אחת באופן עצמאי באמצעות Sutter P 97 pipette Puller, ולאחר מכן שאבו תמיסת סליין סטרילית כדי למלא את הנפח המת של הצינור.
חבר צינור נימי מזכוכית לקצה הצינור הפלסטי הסטרילי, והזרק מעט תמיסת מלח דרך המחט כדי לוודא שהיא מחוברת כראוי וללא דליפות. אם תסתכלו תחת מיקרוסקופ, תוכלו לראות כמה לחץ מופעל ומהו קצב פליטת הנוזל דרך הקצה הדק; נשתמש בתמיסה צבעונית כדי לייצג את הווקטור הוויראלי או את תאי הגזע. הנח זאת בצלחת פטרי סטרילית, שאב מעט אוויר ולאחר מכן את תמיסת ההזרקה.
לצורך מטרותינו, אנו משתמשים בעכברים מסוג P five. בתמונה זו ניתן לראות את החרטום. מיקום העין מכוסה על ידי עפעף.
הקווים המקווקווים מראים את שולי העפעף ואת קפל העפעף שבהם יבוצע החתך. נעשה שימוש במספריים ישרים כדי לבצע חתך של 1.5 mm לאורך העפעף הסגור. נעשה שימוש בפינצטת הרחבת חריץ כדי להפריד בין העפעפיים ולחשוף את העין, כאשר שולי העפעף נמצאים מעט מאחורי גלגל העין.
כדי לבצע את הסקלרוטומיה (sclerotomy), חשוב להיות מסוגל לזהות מספר נקודות ציון. המעבר מהקרנית השקופה לסקלרה מסומן על ידי הלימבוס (limbus). ממש בתוך הסקלרה נמצא אפיתל הפיגמנט של הרשתית, לאחר מכן הרשתית, ואז הוויטריאוס. ה-Matomy ממוקם במחצית הדרך לאחור או בקו המשווה של גלובוס העין, באמצעות חריטה של הפני השטח עם להב מיקרו-כירורגי של 15 מעלות ובבעלי חיים בעלי פיגמנט כהה.
רקמה בעלת פיגמנט חום כהה תהפוך לנראית בנקודת החתך. אם החתך עמוק מדי, תראה נוזל יוצא. נוזל זה הוא הגוף הזجاجי (vitreous), ופירוש הדבר הוא שהחתך עמוק מדי.
מעבר דרך ה-RPE של הרשתית. חתך זה יכול לשמש להזרקה תוך-זגגית (intravitreal). כעת, הכנת החיה.
בשלב זה החתך הושלם. חתכים ושריטות נוספים ישחררו את הזגוגית לצורך הזרקה סוב-רטינלית (תת-רשתיתית); המטרה היא להחדיר את צינורית הזכוכית המיקרו-קפילרית לחלל הסוב-רטינלי, בדיוק בין הרשתית לבין ה-RPE. אם החתך היה עמוק מדי, המחט עלולה לעבור את הרשתית ולהיכנס לזגוגית. הכניסו את המחט במקביל לדופן החיצונית של העין.
כדי להיכנס לחלל התת-רשתי, הפעל לחץ קל על הבוכנה והתחל בהזרקת הנוזל. אם המחט ממוקמת נכון, יורגש לחץ נגדי בינוני, ויווצר BLE בחלל התת-רשתי.
אם המחט נמצאת בגוף הזגוגית, לחץ הגב נמוך משמעותית. כדי למנוע רפלקס (reflux) משמעותי, החזקו את הבוכנה במקומה למשך 15 שניות נוספות לפני הוצאת המחט. פעולה זו תאפשר ללחץ התוך-עיני להתייצב.
דחפו בעדינות את העין חזרה אל מאחורי העפעפיים לתוך המ Orbita באמצעות פינצטת דריסינג מעוקלת. הנה דוגמה נוספת להזרקה סוב-רטינלית (subretinal injection) שבה הצבע ממלא את החלל הסוב-רטינלי ונראה בבירור בבעל חיים אלבינו. המניסקוס של האוויר מאפשר לכם לראות מתי הגעתם לסוף ההזרקה.
הזרקות של נוזלים לעין בעלת פיגמנטציה כהה הן מאתגרות מעט יותר. הכנסה זהירה של המחט תביא לתוצאות מצוינות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
טכניקה כירורגית זו מדגימה הזרקה של וקטורים לטיפול גנטי ותאי גזע לחלל הסוב-רטינלי (subretinal space) של עין העכבר. התהליך כולל הרכבה קפדנית של מכשיר למתן מדויק של החומרים הטיפוליים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- תרפיה גנית
- מחקר תאי גזע
- Oftאלמולוגיה (רפואת עיניים)
רקע
- טיפול גנטי שואף לטפל במחלות או למנוע אותן על ידי החדרת חומר גנטי לתאים.
- לתאי גזע יש פוטנציאל לחדש רקמות פגומות.
- החלל התת-רשתי (subretinal space) הוא אזור קריטי עבור התערבויות עיניות.
- מודלים של עכברים משמשים בדרך כלל למחקרים פרה-קליניים בחקר הראייה.
מטרת המחקר
- להדגמה של טכניקה כירורגית להחדרת וקטורים לטיפול גנטי.
- לבחינת הפוטנציאל של תאי גזע בטיפול במחלות רשתית.
- לשיפור שיטות להזרקות מדויקות לעין.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרכבת התקן מתוך ערכה לאיסוף דם.
- הכנת מחט קפילרית מזכוכית להזרקה.
- שאיבת תמיסת סלין סטרילית למילוי ההתקן.
- שימוש בתמיסה צבעונית לייצוג הווקטור הוויראלי או תאי הגזע במהלך הפרוצדורה.
תוצאות עיקריות
- המכשיר מאפשר הזרקה מבוקרת לחלל התת-רשתי (subretinal space).
- הדמיה מוצלחת של פליטת הנוזל תחת מיקרוסקופ.
- הדגמת היתכנות הטכניקה ליישומי טיפול גנטי.
- השלכות פוטנציאליות לטיפולים עתידיים במחלות הרשתית.
מסקנות
- טכניקה זו מספקת שיטה מהימנה להחדרת טיפול גנטי.
- נדרשים מחקרים נוספים כדי להעריך תוצאות ארוכות טווח.
- היא פותחת נתיבים לטיפולים חדשניים בהפרעות רשתית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טכניקה כירורגית זו מאפשרת הזרקה מדויקת של וקטורים לטיפול גנטי ותאי גזע לחלל התת-רשתי (subretinal space) בעיניהם של עכברים בשלב הפרינטלי, ובכך תומכת בתיקוף פרה-קליני של טיפולים עיניים. על ידי מזעור נזקי הרקמה והבטחת מיקוד מדויק, השיטה משפרת את השחזוריות בתהליכי גילוי בשלבים מוקדמים עבור מודלים של מחלות רשתית. היא מספקת פלטפורמה ניתנת להרחבה להערכת מועמדים טיפוליים לפני המעבר למחקרי בעלי חיים גדולים יותר או למחקרים המאפשרים הגשת IND.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה תפקודית של מבני ג'ינו-תרפיה בסביבה מיקרוסקופית עינית הרלוונטית למחלה.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף המטרה על ידי אישור המסירה לשכבות תאי הרשתית המיועדות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר מדדים כמותיים של התפלגות וקטורים או תאים באמצעות ויזואליזציה של היווצרות בלוביות (blebs) בחלל התת-רשתית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרמטרי ההזרקה לצורך מינון הדיר ורפיקבילי של תרכובות או תאים בין קבוצות מחקר.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות להערכה אורכית של השתרשות או ביטוי במודלים פרינטאלים.
- ערך תפעולי: מאפשר בדיקת תגובה למסלול מינון, שהיא קריטית לאפיון בטיחות ויעילות בשלב הפרה-קליני.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי מובילים ועד להערכה פרה-קלינית, במיוחד עבור תרפיה גנטית ותאית עינית.
- ביולוגיה של גילוי: בחינת היפותזות בנוגע לטרופיזם של וקטורים, פעילות פרומוטורית, או השתחון של תאי גזע בנישה הרטינלית.
- סריקה: הזרקת נפחים סטנדרטיים של חומרים טיפוליים כדי לאפשר סריקה השוואתית של מועמדים.
- אנליטיקה: אספקת תוצאות חזותיות ומרחביות (למשל, גודל הבלב, פלואורסצנציה) לכימות הצלחת ההחדרה.
- מחקר תרגומי: גישור בין שלב הגילוי למחקרים פרה-קליניים באמצעות תיקוף ההחדרה במודל פיזיולוגי רלוונטי של עין י新生 (neonatal).
- שימוש חוזר ארגוני: ביסוס פלטפורמה כירורגית הניתנת לשימוש חוזר לבדיקה איטרטיבית של וקטורים או שורות תאים מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במעורבות המטרה על ידי אישור הלוקליזציה התת-תאית של החומרים שהועברו.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות הרכבת מכשיר וטכניקת הזרקה סטנדרטיות.
- ערך אסטרטגי: מצמצם עיכובים בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לתיקוף פונקציונלי מוקדם in vivo.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהחלטות go/no-go המבוססות על מדדי יעילות ההעברה ושלמות הרקמה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה והיכרות עם האנטומיה של העין ב新生born (נאונטליים).
- תלוי במכשור מדויק, הכולל להבים למיקרו-כירורגיה, פינצטות וכלי הכנה לקפילריות זכוכית.
- מחייב הכשרה סטנדרטית כדי לצמצם את השונות בעומק החתך ובמיקום המחט בין מנתחים שונים.
- חייב להביא בחשבון קשיי ויזואליזציה התלויים בפיגמנטציה בעת ההסתגלות לזני עכברים שונים.
- מוגבל על ידי המיומנות הטכנית הנדרשת כדי למנוע חדירה לזגוגית העין ולהבטיח מיקום סוב-רטינלי.
