באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות ג elegans
13 בפברואר 2013
אנו מדגימים כיצד להשתמש בטכניקת RNAi ההאכלה להפיל גני המטרה ופנוטיפ גודל גוף בניקוד ג elegans. שיטה זו יכולה לשמש עבור מסך בקנה מידה גדול כדי לזהות רכיבי פוטנציאל גנטי של עניין, כגון אלה מעורבים בויסות משקל גוף על ידי איתות DBL-1/TGF-β.
סרטון זה מדגים הליך לזיהוי גנים המווסתים, ראו גדילת אלגן וגודל גוף. באמצעות הפרעות RNA או עין RNA כדי לנטרל גנים מועמדים מכינים תחילה לוחות המכילים חיידקים המבטאים RNA דו-גדילי, המכוונים לגנים המעניינים. הרמפרודיטים בשלב הזחל הרביעי מועברים ללוחות ה-RNAi.
ברגע שהם מגיעים לשלב הבוגר הצעיר, הם מועברים לצלחות RNAI חדשות כדי להטיל ביצים. לאחר מספר שעות, הם מוסרים ומשאירים אוכלוסיות מסונכרנות של עוברים. בשלב ההתפתחות הרצוי, הצאצאים נאספו והורכבו על שקופיות.
לבסוף, מתקבלות תמונות מיקרוסקופיות של התולעים. ניתוח התמונה מדגים שינויים בגודל הגוף הנגרמים על ידי השבתת גנים. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו כדי לזהות מווסתים של מסלול איתות TGF בטא, ניתן ליישם אותה גם על מסלולים אחרים המווסתים את ההתפתחות הפוסט-עוברית באלגנטיות הים, כגון מסלול איתות האינסולין.
התחל הליך זה על ידי שיבוט רצפי גן המטרה לווקטור L 4 4 4 0 פלסמיד RNAi תולעת נפוץ הופך את הפלסמיד הרקומביננטי לזן החיידקים. HT אחד 15 DE שלוש תרבות. החיידקים שעברו טרנספורמציה על לוחות אגר LB עם 25 מיקרוגרם למיליליטר פחמן ו-12.5 מיקרוגרם למיליליטר טטרציקלין, ואז בוחרים שיבוט יחיד לשימוש עתידי.
בינתיים, הפוך את הווקטור הריק L 4 4 4 0 לזן החיידקים. HT אחד 15. כדי להשתמש כבקרה לתרבית הניסויים, החיידקים שעברו טרנספורמציה במיליליטר אחד של מרק LB עם 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס.
טטרציקלין אינו מתווסף מכיוון שהוא מקטין את יעילות ה-RNAI. הוסיפו עוד חמישה מיליליטר של מרק LB עם 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין לתרבית הלילה ואז דגרו עוד ארבע עד שש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר שהתרבית מוכנה, זרעו 0.5 מיליליטר של חיידקי ניסוי או בקרה על לוחות תולעת RNAI המסומנים בשם השיבוט המתאים.
יש להכין לפחות שתי צלחות לכל תנאי. דגרו את הצלחות למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. למחרת.
צריך להיות מדשאה של חיידקים המבטאים RNAi עם או בלי רצף גן המטרה. בעלי החיים ישתמשו בחיידקים כמקור מזון. ברגע שלוחות הזנת ה-RNAI מוכנים, הלהבות מעקרות את קצה חוט הפלטינה.
לאחר מכן השתמש בחוט הפלטינה כדי להעביר שישה עד עשרה שלבים של זחל רביעי או L ארבעה הרמפרודיטים של אלגן C לכל לוחית RNAi. תן להרמפרודיטים לגדול ב -20 מעלות צלזיוס בן לילה. למחרת, החיות יהיו בוגרים צעירים.
העבירו אותם לצלחת RNAI חדשה מתויגת ומוכנה כראוי. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך ארבע עד שש שעות כדי לאפשר לבוגרים להטיל ביצים. לאחר הדגירה, הוציאו את כל הבוגרים מהצלחת כדי לסנכרן את הצאצאים.
לאחר הסרת הבוגרים, התחל לספור זמן. זה זמן אפס. דגרו את הלוחות ב-20 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לבעלי החיים לגדול לשלב ההתפתחותי המעניין.
כאן ייבחרו צעירים לניתוח פנוטיפי. עבור נוקדאונים המתפתחים בקצב רגיל, נדרשת דגירה של 72 שעות. זכור שגנים שונים משפיעים על התפתחות בעלי חיים בצורה שונה, ולכן ייתכן שיהיה צורך להתאים את זמני הדגירה.
אם ה-RNAi גורם לבעלי חיים לגדול בקצב שונה, ניתן לזהות בוגרים צעירים ככאלה שעברו לא יותר מ-24 שעות אחרי L ארבע עם התפתחות VUL מלאה ושניים עד שישה עוברים ברחם כפי שמוצג כאן. כדי לזהות שלבי התפתחות אחרים, על החוקר להשתמש בהתפתחות בלוטות המין וה-VUL כמדריך. לאחר שבעלי החיים גדלו לשלב המתאים, התכוננו לדרג את הפנוטיפים בגודל הגוף של תולעים שטופלו ב-RNAi.
לאחר מכן הניחו שתי שכבות של סרט תווית צבעוני על זכוכית, שקופית דגימה בעובי מילימטר אחד כפי שמוצג כאן. צור שתיים משקופיות הזכוכית האלה. לאחר מכן הניחו שקופית זכוכית חדשה בין שתי המגלשות עם הסרט ומרחו טיפה של 2% אגרוס מומס במים.
למרכז מגלשת הזכוכית החדשה, לחץ על שקופית זכוכית שנייה למעלה כדי ליצור כרית אגרוס דקה. לאחר שהאגרוס התמצק, הסר את הזכוכית העליונה. החלק את המגלשה כשכרית האגרוס מוכנה להעמסת תולעים.
סמן את השקופית בשם השכפול. הוסף 10 מיקרוליטר של אזיד נתרן 25 מילי-מולרי לכרית הארוס. לאחר מכן בעזרת חוט פלטינה כמו קודם, העבירו 30 עד 40 בעלי חיים לתמיסת הנתרן אזי.
כדי לשתק אותם, הניחו תלוש כיסוי בחלקו העליון. עשה זאת הן עבור בעלי חיים רקומביננטיים והן ריקים L 4 4 4 0 הנושאים RNAi. לאחר מכן, הנח את שקופית המיקרומטר מתחת למיקרוסקופ החיתוך עם עדשת אובייקט של פי 2.5.
באמצעות Q Capture או תוכנה דומה, צלם תמונה של סרגל המיקרומטר ושמור אותה. לאחר מכן הנח את התולעים מתחת לסקופ וצלם תמונות. כדי למדוד תחילה את אורך הגוף, פתח את התמונה של סרגל המיקרומטר בתוכנת Image Pro.
לאחר מכן לחץ על מדידה ובחר כיול. לאחר מכן בחר אשף כיול מרחבי עם כיול התמונה הפעילה שנבחרה. לחץ על הבא.
הזן את השם עבור הכיול וודא שיחידות הייחוס המרחביות מוגדרות למיקרון. לאחר מכן סמן את צור כיול הפניה כפתור ולחץ על הבא. לחץ על צייר קו ייחוס.
יופיע סרגל קנה מידה של הפניה. מקם מחדש את סרגל קנה המידה כך שיתאים לקצות המיקרומטר. לאחר מכן ציין שההפניה מציינת 1000 יחידות.
לחץ על אישור. הבא וסיום. לאחר כיול התוכנה, פתח תמונת תולעת.
לאחר מכן, תחת תפריט המדידה, בחר כיול ולאחר מכן לחץ על בחר מרחבי. בתפריט הנפתח, בחר את שם הקובץ שנוצר עבור כיול המיקרומטר. לאחר מכן, תחת תפריט המדידה, בחר מידות בחלון שנפתח.
בחר בכלי הציור החופשי ובאמצעות עכבר המחשב עקוב אחר קו במרכז גוף החיה מהראש ועד הזנב. האורך ידווח בחלון. חזור על תהליך זה עבור כל בעלי החיים בשדה.
ייצא את מדידות האורך לקובץ Microsoft Excel או לתוכנה סטטיסטית מתאימה אחרת. נתח את הנתונים על ידי חישוב הממוצע וסטיית התקן עבור כל מדגם. לאחר מכן השווה את התוצאות עבור כל קבוצה באמצעות מבחן T של תלמיד.
גורם הגדילה הטרנספורמטיבי בטא או חלבון TGF beta SUPERFAMILY DBL אחד נדרש להפעלת מסלול TGF beta. בתגובה להפעלת האות, מתמרי אותות smad תוך-תאיים, עוברים לגרעין ויוזמים שעתוק גנים. ראה אלגנטיות שבה מסלול הבטא של TGF מופרע עם גודל גוף קטן יותר, כולל אורך גוף קצר יותר מחיות בר.
כך מסכים לאלגנטיות הים. מוטציות בגודל הגוף מסוגלות לזהות רכיבי איתות בטא TGF ומשנים כדי לבדוק את יעילות ה-RNAi על ידי הזנה לזיהוי מוטציות בגודל הגוף. RNAi שימש כדי להפיל את רכיבי המסלול האחד של DBL SMA שלוש ב-SMA שישה בארבעה זנים שונים של אלגנטיות ימית.
זני האלגנטיות C שנבדקו כללו שניים בעלי רגישות יתר של RN AI A אחד, Lin 15 B ו-RF שלוש, כמו גם הזן הסטנדרטי מסוג N 2 וזן LIN 36, שרגישות ה-RNAi שלו דומה ל-N 2 כפי שמוצג כאן. כאשר ביטוי SMA 3 או SMA 6 שובש, החיות הראו גודל גוף קצר משמעותית מחיות ביקורת למעט SMA 6 RNAi ב-Lin 36. רקע ב-RF 3.
אורכי הגוף של מבוגרים צעירים לאחר טיפול ב-RNAi היו 84 עד 95% מהווקטור בלבד. ב-A One Lin 15 B אורך הגוף של בוגרים צעירים לאחר RNAi היה 68 עד 86% מחיות הביקורת. עם זאת, הזן A one lin 15 B מייצר צאצאי תצוגה.
זה הופך אותם ללא מתאימים להקרנה בקנה מידה גדול. לכן, השימוש בזן RF 3 מוצע לטכניקות אלה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות גנים המווסתים את הצמיחה ואת גודל הגוף באמצעות טכניקת הפרעות RNI.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים נוהל לשימוש בהשתקה של RNA (RNAi) לזיהוי גנים המסדירים צמיחה וגודל גוף ב-C. elegans. השיטה מאפשרת סינון בקנה מידה גדול כדי לחשוף מרכיבים גנטיים המעורבים בוויסות גודל הגוף דרך איתות DBL-1/TGF-β.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- גנטיקה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- C. elegans הוא אורגניזם מודל לחקר ויסות גנטי.
- השתקה של RNA היא כלי רב עוצמה להשתקת גנים.
- ויסות גודל הגוף מושפע מגורמים גנטיים שונים.
- איתות DBL-1/TGF-β משחק תפקיד בצמיחה והתפתחות.
מטרת המחקר
- להדגים את טכניקת האכלה של RNAi.
- לזהות גנים המשפיעים על גודל הגוף ב-C. elegans.
- לאפשר סינון גנטי בקנה מידה גדול.
שיטות ששימשו
- הכנת צלחות RNAi עם חיידקים המבטאים RNA דו-גדילי.
- העברת הרמפרודיטים בשלב הזחל הרביעי לצלחות RNAi.
- איסוף של אוכלוסיות מסונכרנות של עוברים לאחר הטלת הביצים.
- הרכבת הצאצאים על שקופיות לצורך תצפית.
תוצאות עיקריות
- השתקה מוצלחת של גנים מטרה באמצעות RNAi.
- תצפית של פנוטיפים של גודל הגוף ב-C. elegans.
- זיהוי של מרכיבים גנטיים פוטנציאליים המעורבים בוויסות הצמיחה.
- הדגמה של האפקטיביות של RNAi בהקשר התפתחותי.
מסקנות
- טכניקת האכלה של RNAi יעילה להשתקת גנים ב-C. elegans.
- שיטה זו יכולה לשמש לסינון גנטי בקנה מידה גדול.
- הממצאים תורמים להבנת הוויסות הגנטי של גודל הגוף.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This RNAi feeding strategy enables scalable, cost-effective screening for genes regulating body size in C. elegans, supporting target validation in developmental pathways. By linking phenotypic readouts to TGF-β signaling, it provides mechanistic de-risking for early discovery programs focused on growth regulation. The method’s reproducibility and minimal equipment needs make it suitable for academic-industrial collaboration in preclinical target identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by knocking down candidate genes to assess body size phenotypes.
- Operational Value: Uses RNAi hypersensitive strains like rrf-3 to enhance knockdown sensitivity and reduce false negatives.
- Predictive Value: Identifies TGF-β pathway components such as sma-3 and sma-6, supporting target confidence in growth regulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces synchronized worm populations for consistent developmental staging and phenotypic scoring.
- Quantitative Output: Enables body length measurement via microscopy and image analysis, generating continuous data for statistical comparison.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and bacterial feeding systems for medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with conserved TGF-β signaling pathways implicated in fibrosis, oncology, and metabolic disorders.
- Translational Continuity: Supports progression from target hit to preclinical validation by confirming phenotypic impact in a whole-organism context.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables go/no-go decisions based on body size penetrance and expressivity across genetic backgrounds.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, where genetic hits are prioritized for pathway validation and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene function in body size regulation through loss-of-function phenotyping.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative body size readouts essential for assay standardization and hit confirmation.
- Analytics: Generates length measurements analyzed via mean, standard deviation, and Student’s T-test to evaluate statistical significance.
- Translational Research: Connects to preclinical work by validating hits in conserved pathways like TGF-β, which have mammalian orthologs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable RNAi feeding platform applicable to other phenotypes such as motility, lifespan, or stress resistance.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking gene knockdown to defined phenotypic outcomes in a genetically tractable model.
- Operational Value: Standardizes worm handling, RNAi feeding, and imaging protocols across users and laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early-stage target triage using low-cost, high-information-content assays.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on phenotypic strength and pathway relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling, RNAi techniques, and microscopic imaging.
- Depends on bacterial culture systems, RNAi plasmids, and temperature-controlled incubators.
- Necessitates standardization of worm staging, feeding duration, and phenotypic scoring across teams.
- Must account for variable RNAi efficiency across genetic backgrounds, as seen in lin-36 and rrf-3 strains.
- Limited to phenotypes observable in whole worms; not suitable for subcellular or biochemical readouts without adaptation.
