Name: לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של טבורית ארבידופסיס אפידרמיס במהלך הנביטה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: למדו הדמיה קונפוקלית של זמן פקיעה באפידרמיס של Arabidopsis לחקירת התפתחות תאי העור והבדלת פומיות. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר חלוקת תאים ותנועת חלבונים מתויגים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים אמנדה Rychel לסיוע בפיתוח זמן פקיעת הפרוטוקול ולין Pillitteri לבניית POLAR :: POLAR-eGFP. אנו מודים גם לABRC למתן pm-RB לבנות. פרוטוקול זה פותח באמצעות תמיכה מPRESTO הפרס מטכנולוגיה והסוכנות יפניות למדע. מחקר על POLAR נתמך גם על ידי אוניברסיטת וושינגטון Royalty קרן מחקר (RRF-4098) והקרן הלאומי למדע (MCB-0855659). KMP הוא עמית מחקר למוסמכי NSF (dge-0718124), וKUT הוא חוקר HHMI-GBMF.

1. עיקור זרעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תמיסת זרע עיקור: 33% אקונומיקה ביתית, 0.1% Triton X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעי Place נשאו מבנה רצוי ניאון כתב (הים) וגנוטיפ (הים) בצינור מ&quot;ל 1.7 ולהחיל 1 מ&quot;ל של תמיסת חיטוי. דגירה על nutator במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במכסת מנוע סטרילי, השתמש pipettor להסיר פתרון עיקור מצינור, מותיר אחריו זרעים. לשטוף עם מי 1 מ&quot;ל סטרילי. חזור על התרגיל ארבע פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך ימים או יותר. </li></ol> 2. הכנה של לשכת שקופיות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערבב 20 מ&quot;ל של תמיסה 0.5% מאגר Bacto (לא טהור agarose) במים בבקבוק ml 200, ומיקרוגל עד להמסה. היה זהיר בעת הרתחת הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרר את הפתרון לסביבות 60 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 1 המ&quot;ל של פתרון אגר עם pipettor ולהחיל לאט לכיסוי הזכוכית בתוך השקופית הקאמרית (מערכת Coverglass # 1.5 גרמניה המעבדה Tek השני קבורים). הפתרון which חם מדי או מהר מדי מיושם עלולה להמס דבק או זכוכית סדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להוסיף מ&quot;ל שני של פתרון אגר. תקשורת אגרה צריכה עכשיו לכסות לחלוטין את החלק התחתון של השקופית הקאמרית. תקשורת המינימאלית זה מספיק כדי לתמוך בפיתוח פסיג מפעל, אשר מכיל חומרים מזינים מאוחסנים, במשך ארבעה עד חמישה ימים על ידי שמירה על לחות ומאפשר חילוף גזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופית מגניבה על benchtop עם חדר מכוסה. אם המכל יהיה מכוסה היטב, פתרון עשוי להישמר וחומם מחדש לשימוש עתידי. </li></ol> 3. Dissection זרעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת צינור זרע סטרילי מ4 ° C אחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח ממחטת נייר על הבמה של מיקרוסקופ לנתח ולהרטיב במים. התאם רקמות כדי ליצור משטח חלק. רקמה משמשת לייצוב זרעים לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 20-30 זרעים מהצינור לרקמות, תוך שהוא מקפיד למקם אותם בתחום של ביתור ההיקף של נוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים חדים (Roboz, טיפ # 5 ביולוגיה), להסיר את קליפת הזרע בזהירות מבפנים השתיל. שניהם נעשה עור חיצוני ופנימי יש להסיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הדמית הפסיג, זה מועיל להסיר hypocotyl וradicle. פסיגים מכילים חומרים מזינים מספיק כדי לפתח במשך מספר ימים לפי פרוטוקול זה. אם שלם, hypocotyl יתיישרו ולהאריך באופן דרמטי, נע פסיג משדה זמן הפקיעה של נוף. השתמש באזמל כדי לחתוך את הפסיגים ללא hypocotyl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק פסיגים גזורים שקועים במים, בmicrotube או דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על 3.4-3.6 עד המספר הרצוי של פסיגים הוא הגיע. 15-20 ניתוחים מוצלחים מומלצים לפני שעלה. </li></ol> 4. Cotyledons הרכבה בשקופיות הקאמריות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש (18 מ&quot;מ 2) תלוש כיסוי קטן, לחתוך דרך התקשורת אגר ולהרים את כל השכבה מבסיס הזכוכית של השקופיות הקאמריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet גזור פסיגים עם מינימום של מים מהחזקהצינור לתוך השקופית הקאמרית, מתחת לשכבה אגרה התרוממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוריד את אגר על גבי הפסיגים. אם מים עודפים הוא הווה, יש להשרות אותו בממחטת נייר, נזהר לא להפריע לפסיגים. דגימות כבר לא צריכות לעבור בקלות כאשר ההר הוא מוחלט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח כיסוי על שקופית ושקופית קאמריות מעבר לשלב מיקרוסקופ. </li></ol> 5. זמן לשגות הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת confocal מיקרוסקופ ההפוך לתמונת fluorophore הרצוי (הים). LSM700 פרמטרים המשמשים ל: GFP, עירור ב488 ננומטר וגבייה עם פס, מסנן ב440-530 ננומטר; למכרז, בעירור 555 ננומטר וגבייה עם פס, מסנן ב570-610 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק דגימות רכובות לניזק. לתכנת את המיקומים של שלם, מורכבים כראוי פסיגים לתוך תוכנת מיקרוסקופ. בזן 2009: דגש על פסיג עם 20x אובייקטיבי ולהעביר אובייקטיביים למרכז השקופית קאמרית. תחת מצב רכישה, לשנות זום ​​ל 0.5 וגודל מסגרת &lt;/ Em&gt; כדי 48x48 פיקסלים. סמן את תיבת סימון פוזיציות ותמונת סריקת סקירה ... כפתור מתחת פוזיציות, ואז להגדיל את מספר אריחים אנכי ואופקי ל30-35. כאשר הסריקה הסתיימה, לחץ על כפתור המשרות תחת לשונית המידות וכוונת מקום בכל פסיג להתבונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת סדרת z מקיפה את האפידרמיס הפסיג מכל זן samples.In 2009: לחץ על תיבת סימון Z-סטאק. בחר כל עמדה תחת רשימת מיקום ולחץ על ההעברה לכפתור. התמקד במישור העליון של האפידרמיס הפסיג ולחץ על הכפתור הראשון שנקבע במסגרת Z-סטאק. פוקוס כדי המיקום הנמוך ביותר שבו האפידרמיס הוא מועיל גלוי ולחץ על הכפתור האחרון הסט. לחץ על הלחצן שליד אופטימלי, המציג את מיטב עובי Z-פרוסה, כדי להגדיר. בדקו כל פסיג כדי לוודא שהגדרות אלה להקיף את כל הדגימות; פרמטרי z לא ניתן להגדיר עבור indivעמדות idual בשנת 2009 זן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת סדרת זמן ברזולוציה ואורך רצויים. מרווחים של 15-30 דקות במשך שלושה ימים הם יעילים לדינמיקת חלבון בחלוקת תאי האפידרמיס. מרווח זה ניתן לשינוי בהתאם לצורך. בזן 2009: לחץ על תיבת סימון הסדרות עתיות. תחת סדרות עתיות, להגדיר מחזורים למספר התמונות הרצויות באמצעות מחוון או הקלדה בשדה הטקסט. הגדרת פרק זמן ל30 והשתמש בתפריט הנפתח כדי לבחור דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין סריקת xyzt במספר המיקומים. שים לב כי מספר התפקידים חייב להיות מוגבל על ידי סריקת המפרטים; אם זמן סריקה כולל הוא גדול יותר מהמרווח הרצוי, את נקודתי הזמן לא תהיינה נכונות. מקסימום של שש עמדות בו זמנית הם אפשרי כאשר ההדמיה GFP וRFP ב59 Z-פרוסות במרווח 30-דק באמצעות המערכת שלנו. בזן 2009: גודל מסגרת שינוי לרזולוציה רצויה ולחץ על התחל ניסוי. </li></ol> 6. עריכת וידאו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקובץ נתוני confocal, להפוך את עוצמתו מרבית Z-השלכה של כל שילוב זמן / עמדה ויצוא כקבצי תמונה בפורמט lossless כמו TIFF. שמות קבצים צריכים להיות בסדרה אחת למשרה (למשל, POLAR-GFP_pos1_0001, POLAR-GFP_pos1_0002, וכו &#39;, לא POLAR-GFP_0001_pos1) לתוכנה לשלב אותם לתוך סרט. בזן 2009: העתק שימוש: Subset תחת לשונית העיבוד לפצל עמדות לקבצים נפרדים, ולאחר מכן הקרנת עצמה מרבית. לבסוף, לייצא כקובץ TIFF (קובץ: יצוא חלון תמונה, תמונה ברזולוציה גבוהה - סדרה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיג&#39;י 7,8 ליישר תמונות רצופות על ידי הפעלת bUnwarpJ 9 מאקרו (Plugins: הרשמה: bUnwarpJ). שינוי מצב רישום למונו. כל האפשרויות המתקדמות יכולות להשתמש בערכי ברירת מחדל. לרצפי זמן לשגות ארוכים, להוריד ולהתקין את המאקרו &quot;רישום affine + העקבי אלסטיים 2D תמונה&quot;, אשר יחול bUnwarpJ לסדרה של תמונות באופן אוטומטי, וy הפתוחהנתונים שלנו באמצעות קובץ: יבוא: תמונה ברצף כדי להשתמש בו. בטל מגבי חילוץ וטווח ציוני דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפיג&#39;י / ImageJ או QuickTime Pro כדי לפתוח את הרצף של תמונות מיושרות ולשמור בפורמט וידאו הרצוי (AVI הוא בחירה טובה). </li></ol>

<ol><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Embryonic+Cell+Lineage+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64(1983).</li>
<li>Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoe%2C+V+%22Development+of+Drosophila+melanogaster%22">Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1993).</li>
<li>Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Lineage+Patterns+and+Homeotic+Gene+Activity+During+Antirrhinum+Flower+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development.</a> Current Biology. 5, 1449(1995).</li>
<li>Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854(2002).</li>
<li>Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Analysis+of+Cell+Division%2C+Cell+Growth%2C+and+Differentiation+at+the+Shoot+Apical+Meristem+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74(2004).</li>
<li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Profiling+of+Stomatal+Meristemoids+Reveals+New+Component+of+Asymmetric+Cell+Division+and+Commonalities+among+Stem+Cell+Populations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (9), 3260(2011).</li>
<li>Fiji Is Just ImageJ. , Fiji. Available from: 
		
 <a target="_blank" href="http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji">http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji</a> (2008).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36(2004).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. ánchez, Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. rtiz-, C,, Kybic, J. Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArganda-Carreras%2C+I+%22Computer+Vision+Approaches+to+Medical+Image+Analysis%2C+ser.+Lecture+Notes+in+Computer+Science%22">Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science</a>. 4241, Springer. Heidelberg, Berlin. 85-95 (2006).</li>
<li>Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Out+of+the+Mouths+of+Plants%3A+The+Molecular+Basis+of+the+Evolution+and+Diversity+of+Stomatal+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development.</a> Plant Cell. 22 (2), 296(2010).</li>
<li>Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -Y., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Time-lapse+Documentation+Using+Confocal+and+Multi-Photon+Microscopy+Reveals+the+Mechanisms+of+Invasion+into+the+Arabidopsis+Root+Vascular+System+by+Fusarium+oxysporum%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum.</a> Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011(2007).</li>
<li>Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Lapse+Analysis+of+Stem-cell+Divisions+in+the+Arabidopsis+thaliana+Root+Meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem.</a> Plant Journal. 48, 619(2006).</li>
</ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

טכניקת confocal זמן לשגות זה מאפשר מחקרים ארוכים טווח של ביטוי ולוקליזציה בתאים בודדים של האפידרמיס הפסיג ארבידופסיס, אשר במקרה של חלבוני POLAR והשני דינמי הוא קריטי להבנה נכונה של תפקודם חלבון מתויג fluorescently. בעבר, זמן לשגות הדמיה מתמשכת נעשתה שימוש כדי לבחון זיהום פטרייתי ארבידופסיס שורש 11 וצמיחת meristem 5,12, אך הוספת האפידרמיס הפסיג מרחיבה את הרבגוניות של טכניקה זו ומאפשרת את השימוש בו לחלבונים נוספים, בעיקר סיוע בתחום ההרחבה של פ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> אגר Bacto </td><td> BD </td><td> 214010 </td><td></td></tr><tr><td> שקופית אחת קאמרית </td><td> Nunc (Thermo Scientific) </td><td> 155360 </td><td> או שני הקאמריים (155379) </td></tr><tr><td> confocal מיקרוסקופ סריקת ליזר </td><td> Zeiss </td><td> LSM700 </td><td> 2009 תוכנת זן </td></tr><tr><td> עדשה אובייקטיבית 20x </td><td> Zeiss </td><td> 420650-9901 </td><td> NA 0.8, תכנית-APOCHROMAT </td></tr><tr><td> ביתור מיקרוסקופ </td><td> נץ (הלאומי) </td><td> 431TBL </td><td> מאיר מלמטה </td></tr><tr><td> # 5 מלקחיים, ביולוגית קצה </td><td> מכשיר כירורגי Roboz </td><td> RS-4978 </td><td> טיפים יפים מאודהם קריטיים </td></tr></tbody></table>

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

הדמיה בדינמיקת vivo של התנהגות תאית לאורך רצף ההתפתחותי יכולה להיות טכניקה רבה עצמה להבנת המכניקה של דפוסי רקמה. במהלך התפתחות בעלי חיים, התפשטות תאים מרכזיות ואירועי דפוסים להתרחש מהר מאוד. לדוגמה, בelegans Caenorhabditis כל חלוקות התא הנדרשות לתכנית גוף זחל סקרים בתוך שש שעות לאחר הפריה, עם שבעה מחזורי mitotic 1; את mitoses 16 או יותר של התפתחות עוברת תסיסנית להתרחש בפחות מ 24 שעות 2. לעומת זאת, חלוקות תא במהלך התפתחות צמח הן איטיות, בדרך כלל על סדר יום 3,4,5. זה מטיל אתגר ייחודי וצורך בהדמיה חייה לטווח ארוך לתיעוד התנהגות דינמית של חלוקת תאים והתמיינות במהלך אירועי organogenesis צמח. האפידרמיס ארבידופסיס הוא מערכת מודל מצוינת לאיתות חקירה, גורל תא, ופיתוח במפעלים. בטבורית, רקמה זו מורכבת מאוויר ותאים עמידים במים וביניהם ריצוף הפיוניות מופצת באופן שווה, שסתום שפתוח וקרוב לשליטת חילוף גזים ואובדן מים. מרווח נכון של הפיוניות אלה הוא קריטי לתפקוד שלהם, ופיתוחם כדלקמן רצף של חלוקה סימטרית ושלבי התמיינות תאים לייצר האפידרמיס המאורגן (1 איור). פרוטוקול זה מאפשר תצפית של תאים וחלבונים באפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח. מסגרת זמן זו מאפשרת תיעוד מדויק של חטיבות תאי גזע והתמיינותם של תאי אפידרמיס, כולל תאי הפיוניות ומדרכת אפידרמיס. חלבוני ניאון ניתן התמזגו לחלבונים של עניין להעריך הדינמיקה שלהם במהלך חלוקת תאים ותהליכי התמיינות. טכניקה זו מאפשרת לנו להבין את הלוקליזציה של חלבון רומן, 6 POLAR, בשלב ההתפשטות של תאי הפיוניות-שושלת בדואר האפידרמיס ארבידופסיס פסיג, שבו הוא מתבטא בתאים שקדמו לאירועי חלוקה סימטריים ועובר לאזור אופייני לקליפת תא זמן קצר לפני חלוקה מתרחשת. תמונות יכולות להיות רשומות ווידאו יעיל בקלות הופק באמצעות תוכנת תחום ציבורית לדמיין לוקליזציה חלבון דינמית וסוגי תאים כפי שהם משתנים עם זמן.

<html> סט של נקודתי זמן אינפורמטיבי שנאספו בשיטה זו הנו שמוצג באיור 3. קרום תא מסומן עם RFP (PM-RB) והוא התמזג GFP לחלבון POLAR תחת האמרגן המקורי שלו (POLAR :: POLAR-GFP) 6 בסולם הזמן 30-דקות, אנו רואים חלוקות תא יחד עם השינויים בלוקליזציה חלבון שקדם להם. חלוקות סימטריות בצורת שושלת הפיוניות תאי גזע דמוי מבשרי הפיוניות נקראים meristemoids, אשר שומר על היכולת לעבור חלוקות אסימטריות נוסף, ותאי האחות שלהם, הנקרא תאים קרקעי שושלת הפיוניות (SLGCs). S...

אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שקופיות קאמריות ותקשורת כדי לשתק פסיגי צמחים עבור הדמית confocal של האפידרמיס על פני כמה ימים של פיתוח, המתעד את בידול הפיוניות. חלבוני fluorophore מתויג-ניתן לעקוב באופן דינמי על ידי ביטוי ולוקליזציה subcellular, להגביר את ההבנה של התפקידים האפשריים שלהם במהלך חלוקת תאים והתמיינות תאים מסוג.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של<em&gt; טבורית ארבידופסיס</em&gt; אפידרמיס במהלך הנביטה

דימוי של דינמיקה בחי (in vivo) של התנהגות תאית לאורך רצף התפתחותי יכול להיות טכניקה רבת עוצמה להבנת המכניקה של רקמה...

מטרת הניסוי הבא היא להדמיות של האירועים המוקדמים בהתפתחות האפידרמיס לאחר נביטת הזרעים ברמה התאית. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הסרת מעטפת הזרע כדי לאפשר תצפית ברורה על ה-kosin כשלב שני. ה-kosin מורכבים תחת שכבת מצע אגר שמקבעת אותם ותומכת בהתפתחותם; לאחר מכן, מבוצע דימוי בשיטת Time-Lapse על פני מספר ימים כדי לתבונן בצמיחה ובחלוקה של תאי האפידרמיס in vivo.התוצאות שהתקבלו מראות ביטוי גנים דינמי ומיקום חלבונים בהתבסס על פלואורסצנציה נראית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תמונות סטטיות של צביעת Gus או איחויי GFP, הוא שהיא מראה תנועה דינמית של חלבונים במהלך חלוקת תאים ודיפרנציאציה. זרעי ה-Arabidopsis לניסוי זה עוברים סטריליזציה בתמיסת סטריליזציה של זרעים המורכבת מ-33% bleach ביתי ו-0.1% Triton X 100; יש להניח זרעים הנושאים את מבני הדוחות הפלואורסצנטיים והגנוטיפים הרצויים במבחנה של 1.7 milliliter ולהוסיף מיליליטר אחד של תמיסת סטריליזציה, ולאחר מכן לדגרה על שייקר במשך 15 דקות.בתוך מנדף סטרילי, השתמשו בפיפט כדי להסיר את תמיסת הסטריליזציה מהמבחנה כך שהזרעים יישארו בפנים. שטפו עם 1 mL של מים סטריליים. חזרו על הפעולה ארבע פעמים לאחר השטיפה הרביעית.דגרו בטמפרטורה של 4°C למשך יומיים או יותר. כדי להכין את תווך סרטית התא (chamber slide), ערבבו 20 mL של תמיסת bact to agar בריכוז 0.5% במים בתוך בקבוק ערבוב (flask) של 200 mL, וחממו במיקרוגל עד להמסה מלאה. יש לנקוט זהירות בעת רתיחת התמיסה.חממו את התמיסה לטמפרטורה של כ-60 °C. תמיסה חמה מדי או כזו שמועברת במהירות רבה מדי עלולה להמיס את הדבק או לסדוק את זכוכית השקופית של התא (chamber slide). כאשר תמיסת האגר קרה מספיק, שאבו מיליליטר אחד באמצעות פיפטה והעבירו אותו באיטיות אל זכוכית הכיסוי שבתוך השקופית באופן מיידי.הוסיפו מיליליטר שני של תמיסת אגר. מצע האגר צריך כעת לכסות לחלוטין את תחתית למסחת התא (chamber slide). מצע מינימלי זה מספיק כדי לתמוך בהתפתחות של גלובולין שומני מצמח (plant olein), המכיל חומרי הזנה מאובסנים לארבעה עד חמישה ימים, על ידי שמירה על לחות ואפשור דיפוזיה של גזים.הניחו את השקופית עם התא המכוסה על משטח העבודה. כדי להתחיל בהליך זה, הוציאו את מבחנת הזרעים הסטריליים מאחסון בטמפרטורה של 4 °C. הניחו נייר סופג על בסיסו של מיקרוסקופ דיסקסקציה, הרטיבו אותו במים וכווננו אותו ליצירת משטח חלק.הרקמה משמשת לייצוב הגרעינים במהלך הניתוח. העבירו בפיפטה 20 עד 30 גרעינים מהמבחנה אל הרקמה, תוך הקפדה להניחם בשדה הראייה של מיקרוסקופ הניתוח. ניתוח ה-co leadin הוא החלק המאתגר ביותר בפרוצדורה זו.שימוש בהגדלה נמוכה ובפינצטה חדה, תוך הפעלת זהירות רבה, יסייע להבטיח דיסקציה מוצלחת. בעזרת פינצטה חדה, הסירו בזהירות את מעטפת הזרע מהנבט שבתוכו; יש להסיר הן את הגלומת החיצונית והן את הגלומת הפנימית. לאחר מכן, השתמשו בסכין מנתחים (scalpel) כדי לחתוך את ה-cotyledon ולהפרידו מה-hypocotyl ומהשורשון (radicle).מומלץ להסיר את ה-hyper cot ואת ה-radical לצורך הדמיה, שכן אם הם נשארים שלמים, ה-hyper cott יתיישר ויתארך באופן דרמטי. לאחר העברת ה-Koss Leadin אל מחוץ לשדה הראייה של צילום השהיית הזמן (time-lapse), יש להשאיר את ה-cos leadin המנותח טבול במים. חזור על ניתוח הזרעים עד להגעה למספר ה-Olean הרצוי.מומלץ לבצע בין 15 ל-20 ניתוחים מוצלחים לפני קיבוע ה-olean בתוך שקופית התא. כדי להכין את שקופית התא לקיבוע ה-cotan, השתמשו בכיסוי זכוכית קטן כדי לחתוך את מצע האגר ולהרים את השכבה כולה מבסיס הזכוכית של התא. העבירו בעזרת פיפט את ה-cotan המנותח, עם כמות מינימלית של מים, מתוך מבחורת ההחזקה אל תוך התא.החליקו את הכלי תחת שכבת האגר שהורמה. הורידו בעדינות את האגר על ה-sedins. אם קיים עודף מים, ספגו אותו בעזרת טישיו.יש להיזהר לא להפריע למשקעי הקרקע כאשר ההרכבה הושלמה. הדגימות לא אמורות לזוז בקלות יותר. הנח את כיסוי המכסה על שקופית התא והעבר את השקופית לבמה של המיקרוסקופ.לפני הדמיה, הגדירו את המיקרוסקופ הקונפוקאלי ההפוך להדמיה של הפלואור (Fluor) הרצוי. הפרמטרים של ה-LSM 700 הם עבור עירור של GFP באורך גל של 488 nanometers ואיסוף, עם מסנן חסמה (band pass filter) בטווח של 440 עד 530 nanometers, ועבור עירור של RFP באורך גל של 555 nanometers ואיסוף.באמצעות מסנן חסימה (band pass filter) בטווח של 570 עד 610 ננומטרים ועדשה עם הגדלה של 20. התמקד ב-ACO lead-in והזז את העדשה למרכז התא. במצב רכישת נתונים (acquisition mode), שנה את הזום ל-0.5 ואת גודל הפריים ל-48 על 48 פיקסלים.סמנו את תיבת הסימון positions (מיקומים) ואת תמונת ה-scan overview (סקירת סריקה), ולאחר מכן הגדילו את מספר האריחים האופקיים והאנכיים ל-30 עד 35. לחצו על כפתור ה-scan (סריקה) כדי להתחיל בסריקה. עם השלמת הסריקה, לחצו על כפתור ה-positions (מיקומים) תחת לשונית ה-dimensions (מימדים) ומקמו סימני כוונת (Cross hairs) בכל cot lead שברצונכם לצפות בו.בדוק את הדגימות המורכבות לאיתור נזקים. מחק מיקומים התואמים ל-coss leadin פגומים כדי להשאיר רק דגימות מתאימות לדימות. לאחר מכן, הגדר סדרת Z המקיפה את האפידרמיס של ה-coss leadin בכל הדגימות.לחצו על תיבת הסימון של Zack. בחרו בכל מיקום תחת רשימת המיקומים (position list) ולחצו על כפתור ה-move to. התמקדו במישור העליון ביותר של ה-cos lead באפידרמיס ולחצו על כפתור ה-set first תחת Zack.כוון את הפוקוס למצב הנמוך ביותר שבו האפידרמיס נראה באופן יעיל. לחץ על כפתור set last. לחץ על הכפתור שליד optimal, המציג את עובי פרוסת ה-Z האופטימלי להגדרה.בדקו כל הקדמה של kos כדי לוודא שהגדרות אלו כוללות את כל הדגימות. לא ניתן להגדיר את פרמטרי ה-Z עבור מיקומים בודדים. בתוכנת Zen 2009 המשמשת כאן, הגדירו סדרות זמן ברזולוציה הרצויה ובמרווחי אורך של 15 עד 30 דקות למשך שלושה ימים, אשר יעילים לבדיקת דינמיקה של חלבונים בחלוקת תאי אפידרמיס, אך ניתן לשנות את המרווחים לפי הצורך.לחצו על תיבת הסימון time series תחת time series set cycles עבור מספר התמונות הרצוי על ידי הקלדה בשדה הטקסט, הגדירו את ה-set interval ל-30 והשתמשו בתפריט הנפתח כדי לבחור ב-MIN כדי להתחיל XY, ZT multi-position scan, שנו את גודל הפריים (frame size) לרזולוציה הרצויה ואספו נתונים על ידי לחיצה על start experiment. שימו לב כי מספר המיקומים חייב להיות מוגבל על ידי מפרטי הסריקה. אם זמן הסריקה הכולל גדול מהמרווח הרצוי, נקודות הזמן לא יהיו מדויקות.באמצעות מערכת זו, ניתן להדמות עד שישה מיקומים בו-זמנית עבור GFP ו-RFP ב-59 פרוסות Z בפרקי זמן של 30 דקות. דוגמה לקבוצה של נקודות זמן אינפורמטיביות שנאספו בשיטה זו מוצגת כאן. קרומי התאים מסומנים ב-RFP וב-GFP המהודפים לחלבון פולרי תחת הפרומוטור הטבעי שלו.התמונות בסדרה A מראות כי GFP פולרי מופיע בתחילה כבעל התפלגות אחידה, ולאחר מכן בערך שעתיים לפני החלוקות האסימטריות המסומנות בראשי חצים. GFP פולרי מופרד מהאתר של ה-OID הראשוני בסדרה B בעקבות החלוקה האסימטרית הראשונית המסומנת בראש חץ בשעה 47. GFP פולרי נעלם בשני התאים.במעבר מהיר למצב של תא אם של נקב (guard mother cell) על ידי ה-meris oid, תא האם של הנקב המסומן בכוכבית מתחלק באופן סימטרי ומבדיל את עצמו כדי ליצור תאי שמירה של הפה (stomatal guard cells), בעוד שתא ה-cysto מחזיר לעצמו ביטוי GFP פולרי, ככל הנראה לפני חלוקה אסימטרית מאוחרת יותר. מוצג כאן סרטון רשום ומואץ של לוקליזציית GFP פולרית במהלך הגברה ומרווח של תא מקדים אחד של פה. בתחילה, GFP פולרי מופיע באופן אחיד בתא עד 39 שעות לאחר הנבטה.הוא עובר קיטוב חזק רגע לפני חלוקה בשעה ה-40, וממקם תא בתה (maid) קטן יותר בקצהו הנגדי של התא. התא הגדול יותר מימין מקבל בחזרה את זהות השושלת הסטומטית, ובשעה ה-45 לוקליזציה פולרית של GFP נעה אל הסמוך לסלוללול הפרוקורסור הסטומטי. החלוקה בשעה ה-47 מייצרת סטרואיד חדש מימין, המכוון הרחק מהמסטמואיד הקיים משמאל, מהמסטמואיד הראשון.התוצאה הסופית היא ששני פתחי סינון (stoma) מופרדים על ידי תא אחד. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בצילום time lapse לטווח ארוך של נבט co leadin כדי להעריך ביטוי גנים ומיקום חלבונים באפידרמיס במהלך ההתפתחות.

long-term-high-resolution-confocal-time-lapse-imaging-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מתארים את השימוש perfluorodecalin כמדיום הרכבה infiltrative. זוהי שיטה פשוטה לשיפור עומק...

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

מאמר זה מספק פרוטוקול לגידול שתילים של ארבידופסיס ב RootChip, פלטפורמת הדמיה microfluidic המשלבת שליטה אוטומטית של תנאי הגידול עם מעקב שורש מיקרוסקופי ו להתרגז על בסיס מדידת רמות מטבוליט תאיים.

זמן לשגות דימות פלואורסצנטי של צמיחה רוט ארבידופסיס עם מניפולציה מהירה של הסביבה רוט שימוש RootChip

פרוטוקול זה מתאר תהליך לאיסוף מהיר של תמונות של שתילי ארבידופסיס להגיב לגירוי הכבידה באמצעות סורקים שטוחים, זמינים מסחרי. השיטה מאפשרת לכידה של תמונות ברזולוציה גבוהה נוחות לניתוח אלגוריתמים במורד הזרם זול, בנפח גבוה.

שימוש במשטח סורקים לאיסוף תמונות-פקע זמן ברזולוציה גבוהה של ארבידופסיס רוט Gravitropic התגובה

איתות 2 + Ca מסדירה תהליכים ביולוגיים מגוונים בצמחים. כאן אנו מציגים גישות לניטור לחץ אביוטי המושרה Ca מרחב ובזמן 2 + אותות בתאי ארבידופסיס ורקמות באמצעות Ca 2 + אינדיקטורים מקודד גנטי Aequorin או Case12.

מדידת מרחב ובזמן Ca 2 + אותות בצמחים ארבידופסיס

המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לפקח דינמיקת fluorescently- מתויג חלבון על משטחי תא צמח עם מיקרוסקופיה epifluorescence זווית משתנה, מראה מהבהב נקודות של PATROL1 מתויג GFP, חלבון סחר קרום, בקליפת התא של המתחם הפיוניות ב thaliana ארבידופסיס.

הדמיה של Dynamics שטח תא הצמח עם זווית משתנה epifluorescence מיקרוסקופית בזמן אמת

הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדמית confocal לחיות לפתח פרחים ארבידופסיס.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

מוצג כאן היא טכניקה פשוטה עבור ברזולוציה גבוהה confocal זמן לשגות הדמיה של פיתוח שורש היפוקוטיל עד 3 ימים באמצעות מטרות צמצם גבוהה מספריים ו perfluorodecalin כמו מדיום טבילה.

חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח

מאמר זה מדגים כיצד תרבות תודרנית לבנה השתילים בשטח פלטפורמה דו שכבתי microfluidic מגבילה את הבסיס העיקרי ואת שערות השורש למישור אופטי יחיד. פלטפורמה זו יכולה לשמש עבור הדמיה אופטית בזמן אמת מורפולוגיה שורש בסדר גם באשר דימות ברזולוציה של באמצעים אחרים.

הדמיה המורפולוגיה שורש השיער של תודרנית השתילים בשטח פלטפורמה Microfluidic דו שכבתי

אנחנו מדווחים על שיטה פשוטה רב-תכליתי לביצוע פלורסנט לחיות-הדמיה של עלים תודרנית לבנה על פני תקופה ארוכה של זמן. אנו משתמשים צמח תודרנית הטרנסגניים לבטא גן כתב פלורסנט תחת השליטה של יזם הקשורות חסינות כדוגמה להשגת הבנה ייתכן של תגובות חיסוניות הצמח.

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ

מאמר זה מתאר שתי שיטות פנוטיפ ללא שימוש בקליפות אפידרמיס כדי לאפיין את הגנים השולטים בהתפתחות הסטומטלית. השיטה הראשונה מדגימה כיצד לנתח פנוטיפ סטומטלי באמצעות אפידרמיס צמחי מוכתם O כחול טולוידין. השיטה השנייה מתארת כיצד לזהות ליגנדות סטומטיות ולנטר את פעילותן הביולוגית.

זיהוי הגנים המעורבים בהתפתחות סטומאטלית באמצעות ניקוד פנוטיפ אפידרמלי

במאמר זה אנו מתארים כלי מתקדם המיועד לניטור ביוסינתזה של כלורופיל בשלבים המוקדמים של דה-אטיולציה של שתילי ארבידופסיס . המתודולוגיה החדשנית מספקת דימות פלואורסצנטי כלורופיל לא פולשני בזמן אמת ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה.

בדיקה לא פולשנית לביוסינתזה של כלורופיל קביעת קינטיקה בשלבים מוקדמים של דה-אטיולציה של ארבידופסיס

למדו הדמיה קונפוקלית של זמן פקיעה באפידרמיס של Arabidopsis לחקירת התפתחות תאי העור והבדלת פומיות. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר חלוקת תאים ותנועת חלבונים מתויגים בזמן אמת.

לטווח ארוך הדמיה, ברזולוציה גבוהה Confocal זמן פקיעה של

גלה סרטונים נוספים