ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג תמונות כמותיות של תאי גידול ערמונית מטופלים כדי למדוד את מידת והיקף האוטופגיה בנקודות זמן שונות. זה מושג על ידי טיפול ראשון בתאים עם ארגינין, dase או ריאגנטים ניסיוניים אחרים כדי לגרום לאוטופגיה ו/או מוות של תאים. השלב השני הוא להחליט אם לדמות תאים חיים או תאים קבועים ולהכין דגימות בהתאם.

לאחר מכן, השג תמונות פלואורסצנטיות תלת מימדיות של תאים חיים או קבועים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבה, דה-קונבולוציה או תאורה מובנית. השלב האחרון הוא איסוף נתונים סטטיסטיים על התפלגות גודל האוטופאגוזום וקולוקליזציה עם מבנים תוך-תאיים אחרים. באמצעות תוכנת ניתוח תמונות תלת מימד דיגיטליות, גישה זו יכולה להשיג תוצאות המראות לא רק שהשראת הפאג'ים האוטומטיים על ידי ארגינין יכולה לגרום למוות של תאי גידול בערמונית, אלא גם שתאים אלה מציגים שינויים מבניים הנבדלים מבחינה מורפולוגית משינויים הקשורים לאפופטוזיס ונמק.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות הקיימות כיום הוא שהדמיה תלת מימדית כמותית יכולה להראות מתי והיכן אירוע מולקולרי ספציפי המתרחש בתוך תא חי ולאחר מכן להציג אותו בפורמט תלת מימדי כדי להתחיל לגדל תאי סרטן ערמונית אנושיים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק, יש לצבוע שרשרת אור משולבת שלוש על 35 מילימטר פולי דה ליצין מצופה כלי תרבית תחתית זכוכית מצופה פולי דה ליצין כמתואר בתאי פרוטוקול הטקסט בצפיפות מספקת כדי לאפשר התפשטות מהירה, אך לא עד כדי כך שהתאים גדלים יתר על המידה ומתגבשים בזמן ההדמיה. טפל בדגימות תאים נבחרות עם ארגינין דאז או DI ב-PBS כדי לדלל תאים של ארגינין חופשי ולגרום ללחץ מטבולי בתאי הסרטן כשעה לפני ההדמיה, דלל 1.5 מיקרוליטר של Lyo tracker אדום עם 20 מיליליטר של RPMI המכיל 10% FPS ו-1% אנטיביוטיקה. הכן פתרונות עם DI לדגימות שנבחרו שטופלו לאחר חימום כל המדיה ל -37 מעלות צלזיוס.

הוסף את המדיה המתאימה לכל צלחת תרבית לדגור תאים עם RPMI המכיל LYO Tracker אדום למשך 15 עד 45 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, כ-30 דקות לפני ההדמיה. הפעל את המתחם הסביבתי של תחנת מזג האוויר ואפשר שיווי משקל לתאי שטיפה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני עם PBS והחלף את המדיה ב-RPMI סטנדרטי המכיל רק 10% FBS ו-1% אנטיביוטיקה. הוסף DI לדגימות כפי שמצוין.

הרכיבו כלי תרבות תחתית זכוכית בגודל 35 מילימטר במתאם מותאם אישית. השתמש בשמן טבילה על עדשת האובייקטיביות של שש הגדלות DX, צמצם מספרי של 1.42 ומקם את צלחת התרבות המותקנת על שלב המיקרוסקופ. בסרטון זה, מיקרוסקופיה תלת מימדית מודגמת באמצעות מיקום IDV אישי של דלתא ראייה, מיקרוסקופ דה-קונבולוציה וחבילת יישומי Associated Soft Works.

כדי להתחיל הפעל את מערכת המיקרוסקופ, כולל תחנת עבודה לרכישה ובקר מכשירים. פתח את אפליקציית בקרת המחשב התלת מימדית כדי לאתחל את שלב המיקרוסקופ ולהפעיל את מקור אור הקסנון. אפשר 10 דקות עד שמקור האור יתחמם ויגיע לתנאים יציבים.

הוסף טיפה של שמן טבילה על עדשת האובייקט עם שש הגדלות DX, 1.42 צמצם מספרי ומרכז את דגימת השקופית עם החלקת הכיסוי עם הפנים כלפי מטה מעל עדשת האובייקט באמצעות שדה בהיר או תאורה חיצונית כמו גם המיקוד הגס. כוונן את הכפתור הרם לאט את עדשת המטרה עד שפעימת שמן הטבילה יוצרת מגע עם זכוכית הכיסוי ההפוכה. מנקודה זו, שכבת התא אמורה להתמקד תוך כמה סיבובים של כפתור כוונון המיקוד העדין.

בעבודה עם דגימות קבועות בשקופיות, מומלץ להימנע מתאים בתוך או ליד אזורים עם בועות. בעת צפייה עם דגימות חיות על צלחת הזכוכית התחתונה, הימנע מהזזת עדשת האובייקט מחוץ לגבול החלקת מכסה הזכוכית. בחר את שדה הראייה הרצוי.

באופן אידיאלי, תאים צריכים להפגין אות פלואורסצנטי טוב בכל הערוצים המתאימים ולהיות מחוברים מספיק ולהתפזר על משטח החלקת הכיסוי כך שיהיה קל לדמיין את התוכן התוך-תאי. התאמות קטנות במיקוד X, Y ו-Z לרוחב ניתנות לשליטה על ידי המחשב באמצעות ממשק התלת-ממד הנרכש. הגדר את benning לאחד אחד או שניים על שניים בהתאם לשדה הראייה הרצוי עבור תמונה נתונה דרך החלק האמצעי של תא, הגדר את פרמטרי החשיפה כך שעוצמת הפיקסלים המקסימלית לא תעלה על 3000 ספירות.

בדרך כלל יש להגדיר את אחוז ההדבקה נמוך ככל האפשר מבלי להעלות את החשיפה המתאימה. זמן מעל שנייה אחת. חזור על הליך זה עבור כל צבע פלואורסצנטי שיש לצלם ועבור כל שדה ראייה נפרד.

כדי להשיג את התמונות האיכותיות ביותר, הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של ה-Zack על ידי התאמת המיקוד מעט מעל החלק העליון והתחתון של דגימת התא בהתאמה. המספר הכולל של תמונות בערימת Z נתונה ייקבע אפוא על ידי מגבלות אלה ועל ידי המרווח בין השכבות. כדי למזער את חפצי התנועה במהלך רכישת תמונה, ניתן להגדיר את מצב רכישת התמונה לאורך גל.

לאחר מכן מחסנית ZS עבור דגימות קבועות ומחסנית ZS ואז אורך גל עבור דגימות חיות. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, ניתן לרכוש את תמונות הקרינה. תמונות פלואורסצנטיות מואצלות לאחר מכן באמצעות עבודות רכות ומאוחר יותר מנותחות באמצעות מהירות.

רצף התמונות המוצג כאן מציג את השינויים הפיזיים המתרחשים בתאי cwr 22 במהלך 80 הדקות הראשונות של אינדוקציה אוטופגית. בתמונות אלה, הקו המקווקו הלבן מייצג את קווי המתאר של התא והאזור המוצלל בהיר מייצג את מיקום הגרעין. במהלך 80 דקות, התמונות חושפות תזוזה של הגרעין הרחק ממרכז התא, הפחתה של נקודות הידבקות מוקדיות וטרנסלוקציה כללית של אוטוזומים וליזוזומים לכיוון מרכז התא, המוצגים כאן בירוק ואדום בהתאמה בנקודות זמן מאוחרות יותר.

עלייה קטנה בקולוקליזציה נצפתה גם בין אוטוזומים לליזוזומים כפי שמצוין על ידי הצבע הצהוב. לאחר מכן נעשה שימוש בחבילת יישומי ההדמיה הדיגיטלית של המהירות כדי לזהות, לספור ולאסוף נתונים סטטיסטיים על אוטוזומים וליזוזומים מסומנים בתמונות של תאי CWR 22. מוצג כאן, מספרם וגודלם של האוטוזומים לאחר היווצרותם הראשונית בעת הופעתם משתנים עם הזמן.

לאחר 80 דקות של זירוז אוטופגיה, הייתה ירידה הדרגתית במספר האוטוזומים עם עלייה מקבילה בגודל הממוצע של האוטוזומים. בנוסף, חלה עלייה מדידה בקולוקליזציה של האוטוזומים והליזוזומים בהתבסס על ניתוח מקדם המתאם של פירסון. יחד, ממצאים אלה הצביעו על כך שעם גירוי האוטופגיה, אוטוזומים קטנים רבים יצרו אוטוזומים גדולים יותר לאורך זמן.

מוצגת כאן השוואה זו לצד זו של תמונות שנרכשו ושוחזרו במצב DV, סימולציה של דה-קונבולוציה של שדה רחב לעומת מצב תאורה מובנה. באמצעות מיקרוסקופ OMX, הרזולוציה הרוחבית שופרה עד 120 ננומטר, פי שניים מהרזולוציה של מיקרוסקופיה מוגבלת עקיפה קונבנציונלית. קולוקליזציה בקנה מידה קטן של אוטוזומים וליזוזומים ניכרה בבירור במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, בעוד שהם כמעט ולא ניכרו בהדמיה פלואורסצנטית קונבנציונלית.

אחד היתרונות בשימוש במיקרוסקופ דה-קונבולוציה הוא לשחזר את כל התמונות למודל תלת מימד שיחשוף מידע מרחבי מדויק יותר בין מולקולות שונות. מוצגת כאן תמונה כוללת של תא Cwr 22 RV אחד שעובר אוטופגיה בנקודת זמן מאוחרת יותר שבה מתחילה להתרחש כמות משמעותית של קולוקליזציה בין אוטוזומים לליזוזומים. הצביעה הקוהרנטית כפי שמצוין בצבע לבן, חושפת את קווי המתאר של תא המטרה בסרט זה.

המודל המשוחזר בתלת מימד מספק פרטים מרחביים נוספים על ההיתוך בין אוטוזומים לליזוזומים. כפי שמצוין בצבע צהוב, האינטראקציה בין אותות שלושה של שרשרת אור ירוקה לאותות ליזוזום אדום ניכרת בנוכחות האותות הממוזגים להפקת צהוב. לכן גישה זו תתמודד עם שני אתגרים עיקריים לחוקרים עם מחקרי אוטופגיה.

קודם כל, אנו רוצים לשמור על סביבה נטולת מתח על ידי שימוש במיקרו נוזל, תא השפע כדי לשמור על מצבו הפיזיולוגי המקורי בשלבי המיקרוסקופ. האתגר השני הוא לאסוף נתוני תמונה כמותיים רלוונטיים מבחינה סטטיסטית, ועבור התאים הקבועים אנו בדרך כלל לוקחים הרבה תמונות מתאים שונים ומרכיבים אותן למידע שימושי. עם זאת, עם תא חיים, אנו פשוט עוקבים אחר תא אחד לאורך זמן כדי להשיג מידע שווה ערך.

לכן אנו מאמינים שטכניקה זו תאפשר לחוקרים אחרים לחקור את התפקוד והתפקיד של אוטופגיה באיברים שונים ובמחלות שונות.