Citrobacter rodentium דגם עכבר: תרומות הפתוגן ומארח לומדים קוליטיס המדבק
19 בפברואר 2013
זיהום rodentium Citrobacter מספק מודל יקר ללמוד זיהומים חיידקיים enteric כמו גם לארח תגובות וקוליטיס חיסוניים בעכברים. פרוטוקול זה מתאר מדידה של יושרת מכשול, עומס הפתוגן ופגיעת היסטולוגית מאפשרת אפיון היסודי של תרומות פתוגן ומארח לקוליטיס המדבק העכברי.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום לקוליטיס על ידי הדבקת עכברים בפתוגן שיקוף גרם שלילי, מכרסם ציטרובקטר, המאפשר לחקור אינטראקציות של פתוגן ומארח במערכת העיכול. זה מושג על ידי חיסון ראשון, תרבות של אפס גאולה בן לילה. בשלב השני, עכברים נדבקים על ידי גבאז' דרך הפה עם חיסון הלילה.
לאחר מכן, ביום השביעי לאחר ההדבקה, נאספים המעי הגס ותכולת הלומינל במהלך השלב האחרון. הרקמות מצופות, מושבות החיידקים נספרות, והרקמות הן צביעה חיסונית עבור החלבונים המארחים המעניינים. בסופו של דבר, ניתן להעריך את עומס הפתוגן, תפקוד המחסום, הנזק ההיסטולוגי ושינויים בתגובת המארח באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
למרות ששיטה זו מציעה מודל חזק של קוליטיס זיהומית, המאפשרת לחקור אינטראקציות של פתוגנים מארחים ותגובות חיסוניות, ניתן להתאים אותה גם לבחינת ההשפעות של זיהום חיידקי על הסיכון לסרטן המעי הגס. בדרך כלל אצל אנשים חדשים בשיטה זו יתמודדו באופן טבעי עם זיהום חיידקי של העכברים, עם או עם, או מד. התחל בשימוש בלולאת חיסון סטרילית כדי לפספס פדיון C בר-קיימא ממלאי גליצרול קפוא על פלטת אלקטרו LB.
לאחר דגירה של לילה ב-37 מעלות צלזיוס, השתמש בלולאת חיסון כדי להעביר מושבות מצלחת LB לשלושה מיליליטר של מרק LB סטרילי. לאחר מכן, דגרו את תרבית ה-ERO Dunum באופן אירובי בשייקר דגירה ספסל ב-200 סל"ד למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, מרק הקילוגרמים המחוסן אמור להיראות מעונן.
מערבבים בעדינות את התרבית כדי להפיץ באופן שווה את תרבית תאי החיידקים, ואז טען מזרק מיליליטר אחד עם מרק והצמד אותו למחט קיבה. בחר עכבר לגבאז' על ידי אחיזה חזקה בעור הרפוי מעל צווארו וגבו עם אישה ואצבעות. לאחר מכן משוך לאחור את ראש החיה באצבע המורה כדי לשתק את ראש החיה וליישר את הוושט להחדרה.
שמירה על העכבר במצב זקוף, כוון את קצה הנורה של מחט הקיבה לאורך צד הפה של החיה ומעל הלשון שלה. העבירו בעדינות את המחט לאורך גג הפה של החיה וקדמו את המחט במורד הוושט. לבסוף, השתמש במזרק כדי להזריק לאט 100 מיקרוליטר של החיסון החיידקי, ולאחר מכן הסר בעדינות את מחט הגאווג'.
עקוב אחר קצב הנשימה וההתנהגות של העכבר לאחר החזרתו, הכלוב שלו ביום הבדיקה, קשקש את העכבר כפי שהודגם זה עתה, ולאחר מכן גבר על החיה עם 150 מיקרוליטר של דקסטרין פיצי טרי שהוכן מראש. הוצא מזון מהכלוב בשלב זה, ארבע שעות לאחר הגאווג', ולאחר מכן הרגעה של החיה. השתמש בניקור לב כדי לאסוף כמה שיותר דם מהחיה המורדמת.
הוסף את הדם לריכוז סופי של 3% חומצה ציטראט דקסטרוז בצינור מיקרו צנטריפוגה כדי להרתיע קרישה. לאחר מכן, סובבו את דגימות הדם למשך 12 דקות בחום של 1000 גבינה וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן אוספים את הסרום ומדביקים אותו לאחד עד 10 ואחד ל-100 ב-PBS ב-100 מיקרוליטר מכל דגימה.
בשני אלה דילול לצלחת באר 96 בשכפול. להכנת העקומה הסטנדרטית, יש לדלל 100 דגימות מיקרוליטר מתוך 80 מיליגרם למיליליטר המקוריים. פיץ דקסטרין נהג לתקוף את העכברים ב-PBS בצינורות מיקרו-צנטריפוגות כהים.
לאחר מכן הוסף את הדגימות הסטנדרטיות לצלחת של 96 בארות בשלוש עותקים. לאחר מכן השתמש בפלואוריומטר כדי לכמת את הקרינה של כל דגימה וכדי לקבוע את ריכוז דקסטרין FXI בטכניקה אספטית, התחל שלב זה על ידי הוספת מיליליטר אחד של PBS סטרילי וחרוז מתכת חיטוי כדי לעגל את התחתית לשני צינורות צנטריפוגה של מיליליטר. לאחר מכן שקלו כל צינור.
לאחר מכן, לאחר הוצאת הסאום והמעי הגס מהעכבר, הפרד את הסאום מהמעי הגס וחתוך אותם לאורך. אוספים את תכולת הלומינל בעזרת מלקחיים ומוסיפים את התוכן לשפופרת של PBS. שטפו את רקמות ההמשך והמעי הגס עם PBS סטרילי לפני הנחתם בצינורות נפרדים.
כעת שקלו את צינורות הרקמה והומוגניזציה של הדגימות באמצעות מקצף חרוזים למשך שש דקות. ב -30 הרץ, הוסף 180 מיקרוליטר PBS סטרילי לבאר לצלחת של 96 בארות. לאחר מכן מוסיפים 20 מיקרוליטר מכל דגימה הומוגנית לבאר הראשונה בכל שורה ומערבבים היטב.
יש לדלל את הדגימות באופן סדרתי על ידי הוספת 20 מיקרוליטר מכל באר קודמת כדי לקבל דילול מ-10 למינוס אחד בבאר הראשונה עד 10 למינוס שש. לאחר מכן צלחו 10 מיקרוליטר מכל דילול מכל דגימה בשלוש פעמים על צלחת LB עם תחתית מרובעת עם רשת לאחר דגירה של לילה ב-37 מעלות צלזיוס. ספרו את היחידות היוצרות את המושבה בצלחת אחת.
ממוצע המשולש עבור כל דגימה, ולאחר מכן רשום את הדילול שבו כל דגימה נספרה. הכפילו את ה-CFU הממוצע ב-50 ובגורם הדילול שבו נספרה הדגימה, וכתוצאה מכך CFUs למיליליטר. לבסוף, חלקו במשקל הרקמה כדי לקבוע את ה-CFUs לגרם לאחר לילה, רשמי וקיבוע של המעי הגס וקטע המעי הגס והסקום שנשמר קודם לכן.
למחרת בבוקר, שטפו את הטישו עם אתנול 70% והכניסו לקסטה כדי לשלוח למתקן היסטולוגי כדי להטמיע אותה בפרפין ולצבוע בהמטין ואאוזין כדי לפזר את הרקמות. מניחים את השקופיות בצנצנת מכתים קופלן באמבט מים של 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. כעת, הניחו את השקופיות בקסילן למשך ארבע שטיפות של שתי דקות.
כל אחת מהן החזירה לחות את השקופיות עם שתי שטיפות של חמש דקות ו-100% אתנול, ולאחר מכן שטיפה אחת של חמש דקות בכל אחת מהפעולות הבאות. 95% אתנול, 75% אתנול ומים מזוקקים. מניחים את השקופיות השטופות בצנצנת קופלן עם מאגר נתרן ציטראט חם מראש, ולאחר מכן מכניסים את הצנצנת לסיר קיטור למשך 30 דקות לאחר שנתנו לצנצנת לשבת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות נוספות, שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם PBS Zied למשך חמש דקות.
כאשר השקופיות יבשות, סמן את האזור סביב הרקמה בעט פאפ. לאחר מכן חסום את הרקמה עם מאגר חוסם בתא לחות מכתים חיסוני בטמפרטורת החדר. לאחר שעה, שפכו את המאגר החוסם ודגרו על הרקמות ב-50 עד 100 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.
לאחר תקופת הדגירה יש לשטוף את הטישו שלוש פעמים עם PBS Azi למשך חמש דקות. לאחר מכן דגרו את השקופיות ב-50 עד 100 מיקרוליטר של הנוגדן המשני בחושך בטמפרטורת החדר לאחר שעה, שטפו את המגלשות שלוש פעמים במים מזוקקים למשך חמש דקות. לבסוף, ייבשו את הרקמות, כסו את השקופיות ב-dpi, מדיום הרכבה זהב ממושך, ולאחר מכן מרחו החלקת כיסוי שנצפתה בשקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
איור ראשון זה מראה דקסטרין פיץ שנמדד בסרום של שישה עכברים שחורים C 57, כמו גם מקולטן דמוי טול לעכברי נוק-אאוט, שנמצאו בעבר כבעלי פגיעה בשלמות מחסום האפיתל במהלך הזיהום בנוכחות מחסום אפיתל מעי שלם. דקסטרין ZI חדיר בצורה גרועה דרך שכבה זו. לכן, רמות מוגברות של דקסטרין פיץ בסרום מצביעות על פגיעה בשלמות מחסום האפיתל של המעי במהלך הזיהום, מה שמאפשר למולקולה זו לדלוף כרמות סרום בקרה בעכברים לא נגועים.
מוצגים גם גבאג' עם דקסטרין פיץ. הסכמה היא פתוגן לומינלי שיכול להיצמד באופן אינטימי לתאי אפיתל המעי. עומסי חיידקים בתכולת הלומינל, רקמות ההמשך והמעי הגס יכולים להיות ביום השביעי. לאחר הדבקה.
נמצא כי עומסי החיידקים במעי הגיעו לשיא בסביבות 10 עד ה-CFU התשיעי לגרם. רוב הפתולוגיה שנצפתה במהלך זיהום C DUM בשישה עכברים C 57 PL מתרחשת בשני הסנטימטרים הדיסטליים של המעי הגס באופן מקרוסקופי ביום השביעי לאחר ההדבקה. עיבוי של רירית המעי הגס, כמו גם קיצור ואורך המעי הגס נצפה בדרך כלל במהלך ההדבקה.
C 57 PL שישה עכברים סובלים רק מדלקת ופתולוגיה בינונית כפי שמאופיין מבחינה היסטולוגית על ידי חדירת תאי חיסון, התארכות קריפטות המעי הגס ודלדול תאי מין. כדי לאפיין עוד יותר את תגובות הפונדקאי המותקנות במהלך הדבקה עם אפס פדיון, ניתן להשתמש בצביעה אימונו-פלואורסצנטית כדי לבחון שינויים בחלבונים המעניינים, כגון סמני התפשטות, או בבחינת היבטים של התגובה החיידקית כגון מיקומה בתוך הרקמה הנגועה. דוגמה לטכניקת צביעה זו, בחינת החלבון המארח KI 67, סמן לשגשוג תאים המופיע באדום וקרע החלבון אפס דה, המופיע בירוק כדי לבחון לוקליזציה של חיידקים ביום ה-12 לאחר ההדבקה, מודגמת באיור זה.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך דקות אם היא נעשית כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב שטכניקת המדידה תבוצע כראוי כדי להבטיח שהעכברים נגועים ושבריאות החיה מנוטרת לאורך כל מהלך ההדבקה. ב-10 עד 15 השנים האחרונות, מודל המכרסמים של ציטרובקטר הפך לסטנדרט הזהב למחקר של הצמדת פתוגנים חיידקיים כמו epec לעזאזל.
יתר על כן, הוא הפך למודל מוכר לחקר תגובות חיסוניות ריריות לחיידקים, כגון התפתחות תגובות TH 17 בתוך המעי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את השראת קוליטיס בעכברים באמצעות הדבקה ב-Citrobacter rodentium, פתוגן גרם-שלילי. הוא מאפשר לחקור אינטראקציות בין פתוגן למארח ולהעריך פרמטרים שונים הקשורים לקוליטיס זיהומית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- אימונולוגיה
- גסטרואנטרולוגיה
רקע
- Citrobacter rodentium משמש כמודל לחקר זיהומים חיידקיים במעיים.
- מודל זה מסייע בהבנת התגובות החיסוניות של המארח.
- הוא רלוונטי במיוחד למחקר על קוליטיס בעכברים.
- הערכה של שלמות מחסום הרירית ונזק היסטולוגי היא קריטית.
מטרת המחקר
- להשראת קוליטיס בעכברים למטרות מחקר.
- לבחינת האינטראקציות בין הפתוגן למאכסן.
- להערכת השפעת הזיהום על בריאות מערכת העיכול.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הדבקת עכברים בתרבית לילה של Citrobacter rodentium.
- מתן נוזלים דרך פיה (Oral gavage) להדבקת העכברים בפתוגן.
- איסוף של העקום (cecum), המעי הגס ותוכן הלומן ביום השביעי לאחר ההדבקה.
- צביעה אימונוהיסטוכימית של רקמות להערכת תגובות חלבונים של המאכסן.
תוצאות עיקריות
- הערכה של עומס הפתוגן ותפקוד המחסום.
- הערכה של נזק היסטולוגי ברקמות מזוהמות.
- ניתוח שינויים בתגובת המערכת החיסונית של המארח באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
- אפיון של תרומת הפתוגן והמארח לקוליטיס.
מסקנות
- המודל מספק תובנות לגבי המנגנונים של קוליטיס זיהומית.
- הממצאים יכולים להוות בסיס למחקרים עתידיים על זיהומים במערכת העיכול.
- הבנת אינטראקציות אלו חיונית לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל העכבר של Citrobacter rodentium מאפשר חקירה קפדנית של אינטראקציות בין מאחס לפתוגן ושל תפקוד מחסומי ההגנה בקוליטיס זיהומית, ובכך מספק מידע ישיר לתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים של מחקר על מחלות מעיים. הערכה כמותית של שלמות האפיתליום, עומס הפתוגנים והתגובה החיסונית מעניקה ביטחון חיזוי לגילוי ביומרקרים תרגומיים ולהפחתת סיכונים מכניסטיים. מודל זה תומך בהחלטות פורטפוליו בקווי פיתוח של מחלות דלקתיות וזיהומיות על ידי הבהרת מסלולים רלוונטיים למחלה וגורמי רגישות של המאחס.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ניתוח מכניסטי של תרומות המארח והפתוגן לפתוגנזה של קוליטיס.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות הקשורות למערכת החיסון ולמחסום ביולוגי במערכת רלוונטית למחלה.
- מקל על הערכה מבוססת-השערות של רגישות גנטית ומסלולי תגובה של המארח.
- מספק פלטפורמה להפחתת סיכונים מכניסטית לפני זיהוי מועמד מוביל (lead identification).
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק פרוטוקולי הדבקה וקריאה סטנדרטיים וניתנים לשחזור עבור תהליכי סריקה המשכיים.
- תוצרים כמותיים, כגון ספירות CFU ומדידות של שלמות המחסום, מאפשרים פיתוח מהימן של בדיקות.
- תומך במדרגיות וב khả thể השוואה בין מחקרים לבדיקת התערבויות תרופתיות או גנטיות.
- מכין מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך הערכה מהימנה של מועמדים טיפוליים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתכתב עם אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים באמצעות מידול של תפקוד לקוי במחסום האפיתל וחדירה חיסונית.
- מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות באינטראקציה בין המאחס לפתוגן.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכונים על ידי אספקת נתונים חיזויים לגבי מנגנוני מחלה.
- מקל על חקירת הקשרים בין טריגרים זיהומיים למחלות דלקתיות כרוניות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
מודל זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשר בין מחקרים מכניסטיים מוקדמים למחקר תרגומי על מחלות מעי זיהומיות ודלקתיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערת האפס לגבי גורמי מאכסן ופתוגן בהיווצרותה של קוליטיס ובהתקדמותה.
- סקר (Screening): מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור להערכת יעילות התערבות והשפעה ביולוגית.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה סטטיסטית של שלמות מחסום הרירית, עומס פתוגנים וסממנים חיסוניים בין קבוצות ניסוי.
- מחקר תרגומי: ממדל תגובות אפיתליאליות וחיסוניות רלוונטיות למחלה לצורך התאמה של סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה מאומתת וניתנת לשימוש חוזר למגוון מחקרי מנגנונים והתערבויות במחקר מחלות מעי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרות ואת ההבנה המכניסטית של קוליטיס.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של פרוטוקולי ההדבקה, הדגימה והניתוח לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות של go/no-go ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתיקי מחלות דלקתיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות והתערבויות מותאם-סיכון על בסיס נתונים חסונים in vivo.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במודלים של זיהום בעכברים ובאנליזה אימונוהיסטוכימית.
- מצריך גישה למתקני בעלי חיים, לתרביות מיקרוביולוגיות ולתשתיות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לפרוטוקולים של זיהום, דגימה וקריאת נתונים.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור זני עכברים שונים או רקעים גנטיים שונים כדי להעריך את הרגישות.
- ניטור קפדני של בריאות בעלי החיים ומיומנות טכנית בביצוע gavage הם קריטיים להשגת הדירות.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:35
Preparation of Citrobacter rodentium Inoculum and Oral Gavage of Mice
3:03
Measuring Colonic Epithelial Barrier Permeability in C. rodentium-infected Mice
4:18
Measurement of Bacterial Load in Tissues of C. rodentium-infected Mice
6:06
Histological Assessment and Immunofluorescence Staining of Infected Colon Tissues
8:02
Results: Representative Overnight Culture Infection Data from a Frozen Glycerol Stock
10:14
Conclusion
