Pyrosequencing לזיהוי ואפיון חיידקים

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות חיידק באמצעות ניתוח רצף DNA ריבוזומלי של 16 שניות באמצעות מתודולוגיית ריצוף פירו. זה מושג על ידי הגברה ראשונה של DNA המטרה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז באמצעות פריימר ביוטיניל. לאחר מכן, האמפליקון הביוטיני משותק באמצעות חרוזי ספרוס מצופים סטרפטווידין ומטוהר באמצעות מאגרי כביסה.

לאחר מכן, האמפליקון עובר דנטורציה ופריימרים לריצוף ריבוזומלי של 16 s הם ELL לגדילים הבודדים של ה-DNA. מטרת שלב זה היא להכין את הדנ"א לריצוף. לבסוף, תגובת ריצוף ה-DNA מתרחשת על ידי ריצוף פירו, שיטה מהירה ומדויקת לרצף חומצות גרעין המבוססת על עקרון הריצוף על ידי סינתזה.

האליקון הביוטיניל משמש כתבנית על ידי DNA פולימראז כדי לשלב DN TPS בסיס אחד בכל פעם, מה שמוביל ליצירת פירופוספט. TP Sul Urease ממיר באופן פרופורציונלי פירופוספט ל-A-T-P-A-T-P מזרז את ההמרה בתיווך לוציפראז של לוציפר ללוציפר, מה שמייצר אור פרופורציונלי לכמות ה-TP. האור נרשם כשיא על עקבות הפיירו ומצביע על שילוב נוקלאוטידים. ה-DN NTPs הלא משולבים מתפרקים על ידי אפרה לפני הוספת ה-DNTP הבא להמשך הסינתזה.

האות הכימילומינסנט שנרשם ברוגרמה מאפשר לקבוע את רצף ה-DNA. התוצאות המתקבלות הן 16 רצפי SDNA ריבוזומליים, המשמשים לזיהוי החיידק בהשוואה למאגר ייחוס DNA ריבוזומלי. ריצוף Pyro הוא טכניקה רב-תכליתית המאפשרת ריצוף גנום מיקרוביאלי וניתן להשתמש בו לזיהוי מיני חיידקים, להבחין בין זני חיידקים ולזהות מוטציות גנטיות המעניקות עמידות לחומרים אנטי-מיקרוביאליים.

בסרטון זה, יודגם ההליך ליצירת אמפליקון חיידקים רצף אמפליקון פירו וניתוח רצף DNA כדי להתחיל בהליך להגברת תבנית, יש להפשיר את כל הפתרונות הנדרשים ולערבב כל אחד מהם ביסודיות. ניתן לבצע את כל העבודות בטמפרטורת החדר. הגדר את תגובת ה-PCR לפי טבלה זו.

שימו לב כי ריכוז סופי של מגנזיום כלוריד של 1.5 מילימולר יספק תוצאות משביעות רצון ברוב המקרים. עם זאת, אם נדרש ריכוז מגנזיום גבוה יותר עד 3.5 מיקרוליטר של 25 מילימולר, ניתן להוסיף מגנזיום כלוריד לתגובה. פריימר אחד חייב להיות ביוטינילציה בקצה החמישי שלו, ומומלץ לטהר את הפריימר HPLC ביסודיות.

מערבבים את תערובת התגובה על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה, ולאחר מכן מחלקים נפחים מתאימים לצינורות PCR. לאחר מכן, הוסף תבנית DNA לכל צינור PCR. מומלץ 10 ננוגרם של DNA גנומי לכל תגובה.

הנח את צינורות ה-PCR באופניים והתחל את תוכנית הרכיבה הזו לפני הכנת תערובת המאסטר. סובב את בקבוק חרוזי הסרוס הנלהבים והמצופים כדי להבטיח השעיה הומוגנית. צור תמהיל ראשי בהתאם לתרשים זרימה זה.

שילוב חרוזים, מאגר קשירה ומים בטוהר גבוה בצינור מיקרו צנטריפוגה. בהתאם לנפח מוצר ה-PCR בו נעשה שימוש, חילק 60 עד 75 מיקרוליטר של תערובת מאסטר לכל באר של צלחת PCR כך שהנפח הכולל הוא 80 מיקרוליטר לבאר. הוסף חמישה עד 20 מיקרוליטר של מוצר PCR ביוטיניל לכל באר.

הנפח לבאר צריך להיות כעת 80 מיקרוליטר. אטמו את הבארות עם מכסי רצועה וערבבו את לוחית ה-PCR ב-1,400 סל"ד למשך חמש עד 10 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות שייקר מסלולי. התחל הליך זה על ידי דילול פריימרים לרצף ל-0.3 מיקרו-מולר עם חיץ כריעה וחלוקת 25 מיקרוליטר לכל באר של לוחית התגובה.

מקם את הצלחת על תחנת העבודה הוואקום. מלא את שקתות תחנת העבודה לפי תרשים זה. 50 מיליליטר של 70% אתנול בשוקת אחת 40 מיליליטר של תמיסת דנטורציה בשוקת שתיים 50 מיליליטר של מאגר כביסה בשוקת שלוש 50 מיליליטר מים בטוהר גבוה בשוקת ארבע ו-70 מיליליטר של מים בטוהר גבוה בשוקת חמש.

הפעל את משאבת הוואקום וודא שהמתג בכלי הוואקום מוגדר למצב שטוף את בדיקות המסנן במים בטוהר גבוה. בשוקת חמש, מקם את לוחית ה-PCR עם חרוזים על תחנת העבודה וודא שגם ה-PCR וגם לוחות התגובה נמצאים באותו כיוון. הורד את כלי הוואקום לבארות של לוחית ה-PCR.

למשך 20 שניות או עד לשאיבת כל הנפח, החרוזים יילכדו על ידי כלי הוואקום כשהוואקום עדיין דולק. שטוף את הכלי עם 70% אתנול למשך 20 שניות או עד לשאיבת כל הנפח. לאחר מכן, שטוף את הכלי בתמיסת דנטורציה למשך 20 שניות או עד לשאיבת כל הנפח.

לאחר מכן, שטפו את הכלי עם מאגר כביסה למשך 20 שניות או עד שכל הנפח נשאב כשהוואקום עדיין פועל. הרם את כלי הוואקום מעבר ל-90 מעלות אנכית למשך חמש שניות כדי לאפשר לכל הנוזל להתנקז מכלי הוואקום. כעת כבה את המשאבה ויישר את כלי הוואקום עם שלוש לוחיות תגובה.

הורד את כלי הוואקום לבארות. לאחר מכן יש לנער בעדינות מצד לצד למשך כ-10 שניות כדי לשחרר את החרוזים לבארות המכילות פריימר לריצוף. הנח את כלי הוואקום בשוקת המים לניקוי כדי לקלוט את פריימר הרצף ל-DNA.

הנח את צלחת התגובה במחזיק צלחת חם מראש. מחממים את הצלחת בחום של 80 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. הסר את הצלחת מהמחזיק והנח אותה על השיש כדי לקרר אותה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

התחל הליך זה על ידי הפעלת המכשיר באמצעות מתג ההפעלה הממוקם מעל כבל החשמל כדי לקבוע את עוצמת הקול הדרושה. הגדר הפעלה file בתוכנת המכשיר ותחת תפריט הכלים, בחר מידע לפני הפעלה. מלא מיכל דיו בהתאם להוראות המופיעות בדף המידע לפני ההפעלה.

שים את קצה הפיפטה בפינה של כל באר רחוק ככל האפשר, וודא שאין בועות אוויר. פתח את שער מיכל הדיו והכנס את המחסנית כשהתווית פונה קדימה. ודא שהמחסנית מוכנסת כהלכה וסגור את השער.

פתח את מסגרת החזקת הצלחת ומקם את לוחית התגובה בתוך המכשיר. סגור את מסגרת החזקת הצלחת ואת מכסה המכשיר. הכנס את מקל ה-USB עם הריצה files שנוצרו עם תוכנת המכשיר ליציאת ה-USB בקדמת מכבש המכשיר.

בסדר לראות את התפריט של קבצי ההפעלה הרצויים. השתמש בחיצי הגלילה כדי לבחור את קובץ ההפעלה הרצוי ולחץ על בחירה. כאשר מגיעים לכל רמות הלחץ והטמפרטורה שנקבעו מראש, המכשיר יתחיל לחלק ריאגנטים במהלך ריצה.

מסך המכשירים מציג את הפיירו של הבאר שנבחרה בזמן אמת. השתמש בחיצי הגלילה כדי להציג את הפירוס של בארות אחרות. כאשר המכשיר מאשר שהריצה הסתיימה והריצה file נשמר במקל ה-USB, לחץ על סגור.

הסר את מקל ה-USB. התוצאות של ריצוף פירו טיפוסי מוצגות כאן. פריימרים PCR קדימה ואחורה מיועדים לאזורים שמורים של תבנית ה-DNA, שהוא הרצף הריבוזומלי של 16 שניות.

בדוגמה זו, פריימר הרצף ממוקם מיד במעלה הזרם של רצף DNA היפר-משתנה המאופיין היטב בתוך האמפליקון המוצג בכחול. רצף היפר-משתנה זה מאפשר זיהוי חיידקי של מספר רב של מיני חיידקים באמצעות פריימר הריצוף השמור כבקרת איכות פנימית, ניתן לבדוק את רצף ה-DNA הסוגר את האזור המשתנה כדי לוודא שאזור ה-DNA הנכון נותח. תוכנת ריצוף ה-pyro מאפשרת השוואה והתאמה של הרצף שנוצר למסד נתונים פנימי של רצפים ריבוזומליים חיידקיים לזיהוי חיידקים.

בנוסף, ניתן לנתח רצף כדי לקבוע מוטציות המעניקות עמידות לתרופות אנטיביוטיות. לדוגמה, ניתוח מוטציות בגנים הריבוזומליים 23 s של הליקובקטר פילורי חושף שני דפוסי מוטציה, GAA או GA המעניקים עמידות לאנטיביוטיקה. ריצוף Pyro הוא טכניקה רב-תכליתית המאפשרת ריצוף גנום מיקרוביאלי.

היתרונות של ריצוף פירו מיישומי מיקרוביולוגיה כוללים סינון מהיר ואמין בתפוקה גבוהה וזיהוי מדויק של חיידקים ומוטציות בגנום מיקרוביאלי. בנוסף, מתודולוגיית ריצוף הפיירו יכולה לנתח את המגוון הגנטי המלא של עמידות לתרופות אנטי-מיקרוביאליות, כולל הקלדת מוטציות נקודתיות של SNPs, הוספות ומחיקות, כמו גם כימות של עותקי גנים מרובים שעלולים להתרחש בדפוסי עמידות אנטי-מיקרוביאליים מסוימים. תודה שצפית בסרטון זה ובהצלחה בניסויי הריצוף שלך.