כמותי Assay לחקר חלבון: אינטראקציות-DNA, רגולטורים גלו תעתיק של ביטוי גנים, ולזהות חומרים אנטי סרטניים רומן

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים בדיקת קשירת DNA כמותית, השימושית בבחינת אינטראקציות DNA חלבון, גילוי מווסתי שעתוק של ביטוי גנים ובזיהוי חומרים אנטי-גידוליים חדשים. זה מושג על ידי הכנת לוחית בדיקה מצופה סטרפטווידין עם יעד DNA ביוטיניל מתאים. השלב השני הוא להוסיף חלבוני תמצית גרעינית עם או בלי מעכבים פוטנציאליים ולאפשר להם להיקשר למטרת ה-DNA.

לאחר מכן, גורמי השעתוק הקשורים מתגלים עם נוגדנים ראשוניים ונוגדנים משניים בשילוב צנון סוסים. השלב האחרון הוא להוסיף מצע פרוקסידאז צנון סוס לבארות על מנת לעורר התפתחות צבע. בסופו של דבר, התפתחות הצבע נמדדת באמצעות הספקטרופוטומטר.

עם הזמן, כמות שינוי הצבע תצביע על מידת קשירת ה-DNA ועל ההשפעה של מעכבים פוטנציאליים של קשירת DNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות אחרות, כגון בדיקת שינוי ניידות אלקטרופורטית, הוא שמדובר בבדיקת קשירת מעכב DNA כמותית. כדי להתחיל, הכינו מספר מספיק של תרביות תאים המורכבות לפחות שלוש פעמים 10 עד שבעת התאים עבור כל מצב שנבדק.

כאן משתמשים בתאי אנדותל מח עצם אנושיים, המבטאים את חלבון הריצה X שתיים. ברגע שהתאים הם 80% מתלכדים. טפל בתאים עם 0.2 מיקרוגרם למיליליטר, ללא קונזול כדי לעצור את צמיחת התאים בגבול מחזור התאים G 2 M.

זה ייצב את החלבון Run X two וייצור קשירת DNA מקסימלית לאחר 16 שעות. יש ללמד את התאים ולבודד את החלבון לפי ההוראות בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר בידוד החלבון, מדוד את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת BCA סטנדרטית.

לאחר מכן אחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס ב-10 מיקרוליטר עם ריכוזים בין שניים לחמישה מיליגרם למיליליטר. תקן צלחת של 96 באר עם תמיסה מולרית של 0.1 נתרן פחמתי על ידי הוספת 300 מיקרוליטר מהתערובת לכל . ובכן התכוננו מספיק טוב כך שכל דגימה תופעל בשלוש עותקים.

דגרו את הצלחת למשך שעתיים על פלטפורמת נדנדה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את הצלחת שלוש פעמים עם 300 מיקרוליטר של סטרפטוקוס ושטפו את המאגר ודגרו עם 100 מיקרוליטר ביוטין המסומנים אוליגונוקלאוטידים דו-גדיליים ב-1.25 ננומול לבאר למשך שעתיים תוך כדי נדנדה. לאחר מכן, שטפו את הצלחות שלוש פעמים נוספות עם מאגר שטיפת הסטרפטוק

לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר לבאר של תערובת המאסטר המכילה חלבוני קשירת DNA מחייבים XDNA בשלושה עד תשעה מיקרוגרם לבאר ופולי DIGC במיקרוגרם אחד לבאר. לאחר מכן הוסף את תערובת המאסטר המכילה כל מעכב פוטנציאלי כגון ויטמין D שלוש או את הדילול המתאים של בקרת הממס, כגון אתנול לבארות שלהם. לאחר מכן כסו את הצלחת והניחו אותה על משטח נדנדה בארבע מעלות צלזיוס בלילה שלאחר הדגירה עם התמציות הגרעיניות.

שטפו את הצלחת שלוש פעמים עם הסטרפטוקוס ושטפו את המאגר. לאחר מכן הוסף 90 מיקרוליטר לבאר של ריצה X, שני נוגדנים חד שבטיים ספציפיים מדוללים ל-0.2 ננוגרם למיקרוליטר ומאגר סטרפטוקוקוס וכביסה. מכסים את הצלחת ומדגרים אותה בטמפרטורת החדר על פלטפורמת נדנדה למשך שעה.

לאחר מכן שטפו שוב את הבארות עם מאגר סטרפטוקוס ושטיפה והוסיפו 90 מיקרוליטר לבאר מתערובת הנוגדנים המשנית המכילה חמישה ננוגרם למיקרוליטר זיקה ספציפית מטוהרת HRP מדוללת בסטרפטוק. AVID ומאגר כביסה. דגרו את הנוגדן המשני למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על משטח נדנדה.

לאחר מכן שטפו אותו שש פעמים עם 300 מיקרוליטר לבאר של Strp ומאגר כביסה. לאחר מכן, פתח את התוצאות על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של מצע טטראתיל בנדין לכל באר ישירות מבקבוק המלאי לניטור רציף של הדגימות. הנח את הדגימות בספקטרופוטומטר ומדוד את הספיגה ב-635 ננומטר ברציפות.

למדידה חד פעמית, דגרו את הדגימות למשך 10 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. במהלך תקופה זו, הבארות צריכות להשתנות מדרגות כחולות בהירות לדרגות שונות. עצור את התגובה על ידי הוספת 50 מיקרוליטר חומצה גופרתית לכל אחד.

ובכן, לאחר מכן מדוד את הספיגה של כל באר ב-450 ננומטר באמצעות קורא צלחות של 96 בארות. הגרף המוצג כאן הוא דוגמה לניטור רציף של ההשפעה של ויטמין D 3 הפעיל ביולוגית על קשירת NA Run X 2D. לריכוזים שנבדקו הייתה השפעה מועטה על קשירת Run X 2D NA.

למרות שתרכובות אחרות של ויטמין D שלוש הוכחו כבעלות השפעות דרמטיות. התרכובת 5 2 2 1 9 7 5 שנבדקה כאן זוהתה באמצעות תכנון תרופות בעזרת מחשב. לאחר הבדיקה, התרכובת הראתה עיכוב תלוי מינון של rux two binding מננו-מולרית אחת ל-100 מיקרו-מולרית 50% מקשירת ה-renx 2D NA הצליחה להיות מעוכבת עם 0.01 מיקרו-מולרי בלבד של התרכובת.

לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לכם מושג טוב כיצד לבצע את בדיקת קשירת ה-DNA ולבדוק מעכבים פוטנציאליים של קשירת DNA.