יצירת חיסון חדשני לתאים דנדריטיים באמצעות מלנומה ותאי גזע סרטניים קשקשיים

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את החסינות נגד גידולים של חיסון המבוסס על תאי דנדריטיים (DCs) המופקים מתאי גזע סרטניים (CSCs) במארח בעל מערכת חיסונית תקינה. הדבר מושג תחילה על ידי בידוד של CSCs חיוביים לאלדהיד דהידרוגנז (ALDH high) מתוך תאי גידול הטרוגניים. בשלב השני, מבודדים CSC dcs ולאחר מכן מחסנים אותם בליסאט עבור החיסון.

בשלב הבא, מחסן ה-DC המעובד ב-Pulses או ה-TP DC המעובד בליזאט של CSC מוחדר למארחים סינגנאיים תקינים בעלי מערכת חיסון תקינה (Immunocompetent). לאחר מכן, בשלב הסופי, נבחנת היעילות ההגנתית נגד הגידול של חיסון ה-C-S-C-T-P-D-C. לבסוף, ניתן לבצע ELI SA כדי להעריך את החסינות נגד CSC שהושרה על ידי חיסון ה-C-S-C-T-P-D-C באמצעות תאי t ונוגדנים של המארח.

פרויקט זה מאחד שניים מהתחומים המרתקים ביותר במחקר הסרטן: תחום תאי הגזע הסרטניים ותחום האימונותרפיה של גידולים. המעבדה שלנו הייתה בין הראשונות שגילו תאי גזע סרטניים בגידולים מוצקים. תאים אלו הם ה"זרעים" של הסרטן המניעים את צמיחתו וכן את הגריעות (מטסטזה).

מה שתראו היום הוא גישה חדשה המשתמשת באימונותרפיה כדי להתמקד באופן ספציפי בתאי גזע סרטניים אלו. אנו משתמשים בסמן מסוים הנקרא aldehyde dehydrogenase, שניתן לזהות באמצעות בדיקת Alde fluoro. תראו את הדוקטורים Lin Liu ו-Huon Tau עובדים יחד עם ד"ר Chow Lee.

אנו מקווים כי על ידי התמקדות בתאי גזע סרטניים אלו, נשפר את התוצאות עבור חולים עם סוגים רבים של סרטן. התחילו על ידי תליה של תאי הגידול הרלוונטיים בבופר בדיקה של alor בריכוז של 1×10⁶ תאים ל-mL. לאחר מכן, העבירו את כל תאי הגידול למעט 3 mL לכל אחת ממבחנות הדגימה, וסמנו ארבע מבחנות בקרה מפוליסטירן בגודל 12x75 ממ"ש באופן הבא: unstained, alor, ALOR plus DEAB ו-7-AAD. העבירו 1 mL מתליה התאים למבחנות ה-unstained וה-7-AAD, ו-2 mL למבחנת ה-alde floor.

לאחר מכן, הוסיפו 5 µL של DEAB למבחנה של ALOR פלוס DEAB. הניחו את המבחנות על קרח, ולאחר מכן ערבבו 10 µL של סובסטרט alor מופעל לתוך מבחנת ה-alor. העבירו מיד 1 mL של תמיסת הסובסטרט למבחנת ה-ALOR פלוס DEAB, ולאחר מכן הוסיפו 2 µL של סובסטרט alor מופעל לכל מיליון תאים לכל אחת ממבחנות הדגימה.

דגרו את כל המבחנות באמבט מים של 37 °C למשך 30 דקות, ולאחר מכן הוסיפו 5 µL של 7-AAD למבחנת ה-7-AAD ו-1 µL של 7-AAD לכל 1 מיליון תאים לכל מבחנת דגימה. החזיקו את המבחנות הללו בטמפרטורה של 4 °C למשך 10 דקות. סבבבבו את כל המבחנות למשך 5 דקות ב-250 ×g בטמפרטורת החדר וסספנדו מחדש את המשקעים בבופר של AldeFluor לצורך מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS).

כדי לקבוע את שערי המיון (sorting gates), השתמשו בתאי alde Fluor plus DEAB כביקורת שלילית ובתאים שנצבעו ב-seven A a D כביקורת חיוניות. על בסיס ביקורות אלו, הגדירו שער להבחנה בין תאי SCC seven לבין תאים חיוביים ל-alor ובעלי A LDH גבוה ו-D five גבוה. לאחר מכן, השתמשו בכך כדי למיין את תאי הדגימה לאוכלוסיות של SCC seven, תאים חיוביים ל-alor ובעלי A LDH גבוה ו-D five גבוה.

כדי להפיק את התאים הדנדריטיים, בידלו תחילה את עצמות הפמור והטיביה מעכברי C 57 black six ו-C3 H. סטריליזו את העצמות ב-75% ethanol למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ולאחר מכן שטפו אותן ב-HBSS. בשלב הבא, חתכו את קצות העצמות והשתמשו במזרק של 10 milliliter המצויד במחט במידה 21 gauge כדי לשטוף את מח עצם העצם אל תוך צלחת פטרי; בצעו אספירציה ופיזור של התאים מספר פעמים כדי ליצור סספנסיות של תאים בודדים, ולאחר מכן סובבו את התאים בצנטריפוגה להשקעה.

דגרו את המשקע בחמישה מיליליטר של בופר לליזת תאי דם אדומים למשך דקה אחת במקלח מים בטמפרטורה של 37 °C. לאחר ספירת התאים, התאימו את הנפח ל-1×10⁶ תאים למילליטר במצע גידול המועשר ב-G-M-C-S-F ו-IL-4. לאחר מכן, גרשו את התאים בטמפרטורה של 37 °C וב-5% CO2, תוך רענון של המצע והציטוקינים לאחר שלושה ימים.

ביום החמישי, קוצרו את התאים הדנדריטיים הבלתי בוגרים. לאחר סבב צנטריפוגה להורדת התאים, השעיו את המשקעים בחמישה מיליליטר של מצע תרבית, ולאחר מכן העבירו באיטיות את תליית התאים כמעטפת מעל מצע בידוד שהוכן טרי. לאחר סבב צנטריפוגה נוסף של התאים, אספו את ה-dcs מהשכבה שבין מצע התרבית למצע הבידוד.

לאחר ספירת התאים, התאימו את הנפח לריכוז של 1×10⁶ תאים למיליליטר בתוך תווך תרבית, המועשר ב-GM-CSF וב-IL-4. כעת, הכינו את ליזאטי הגידול על ידי חשיפת התאים הממוינים למחזורי הקפאה והפשרה מהירים ארבע פעמים, ולאחר מכן ביצוע סנטריפוגציה כדי לאסוף את רכיב הממברנה של הליזאטים. לאחר מכן, בצעו פולס ל-DCs באמצעות הליזאט מהתאים האוטולוגיים הממוינים בעלי ביטוי גבוה של ALDH, כדי להכין את ה-CSC-TPCs.

להכנת דופק ה-H-T-P-D-C, ה-dcs עם ליזאט של תאי גידול הטרוגניים לא ממוינים לחיסון בעלי הנבדקים הניסיוניים, הזרקו תת-עורית 1×10⁶ תאים פולסים, תלוים ב-100 µL של PBS, לצד השמאלי של כל עכבר. לאחר החיסון, ניתן תוך-ורידית 1×10⁵ תאי גידול D5 הטרוגניים ב-100 µL של PBS כדי לאתגר את עכברי הנבדקים מסוג C57BL/6. עבור מודל SCC7, אתגרו תת-עורית את עכברי הנבדקים מסוג C3H עם 1×10⁶ תאי גידול SCC7 לא ממוינים ב-100 µL של PBS בצד הנגדי לחיסון ה-DC.

הכינו תרחיף תאים בודדים מטחוליהם של עכברי C3 H המקבלים. לאחר מכן, הפעילו את תאי t ותאי B מהטחול באמצעות נוגדנים מונוקלונליים immobilized anti CD three ו-anti CD 28 במצע תרבית המועשר בגירוי המתאים. לאחר ארבעה ימים, אספו את העל-נוזלים (supernatants) ולאחר מכן צפו פלטות ELISA בנוגדנים נגד interferon gamma, G-M-C-S-F או IgG בטמפרטורה של 4°C למשך לילה. למחרת, חסמו את הפלטה למניעת קישור לא ספציפי, והעבירו לפלטה את התקנים ואת העל-נוזלים שנאספו, ולאחר מכן דגרו את הפלטות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפה, הוסיפו נוגדן גילוי HRP למשך שעה ואז הוסיפו את תסבך ה-TMB.

לבסוף, מדדו את הבליעה באמצעות קורא לוחות ELISA באורך גל של 450 ננומטר בתוך 30 דקות מסיום התגובה. Alor שימש כסמן לבידוד תאי גזע במספר סוגי גידולים ממאירים, כולל שתי האוכלוסיות המועשרות בתאי גזע סרטניים D five ו-SCC seven; כפי שמוצג בגרפי הניקוד (dot plots) אלו, תאים חיוביים ל-alor מהווים כ-0.5% ו-5.2% מקווי התאים המטופחים של גידולי D five ו-SCC seven, בהתאמה. נמצא כי תאי גידול שנקצרו טריים מכילים 2.5% ו-4.2% תאים חיוביים ל-alor מגידולי D five ו-SCC seven שהוקמו in vivo, בהתאמה.

תאי גידול שטופלו במעכב LDH ספציפי D-E-A-B-A שימשו כביקורת שלילית. האימונוגניות של תאי גזע סרטניים הוערכה על ידי בחינת החסינות האנטי-גידולית המגנה שהושרית על ידי TPCs של CSC באמצעות מודל החיסון שהודגם acabado. כפי שמוצג בטבלה זו, עכברים שטופלו ב-H TPCs פיתחו פחות גרורות ריאה מאשר עכברים שטופלו ב-PBS בלבד.

חשוב לציין כי לעכברים שטופלו ב-CSCT PCs היו פחות גרורות בריאות מאשר לבעלי חיים שטופלו ב-H-T-P-D-C או ב-PBS בלבד. במודל SCC שבע, בעלי חיים תקינים מסוג C3 H חולטנו כפי שהודגם לעתה, בהשוואה לקבוצת הביקורת. H TPCs השילו חסינות אנטי-גידולית מתונה, בעוד ש-CSC TPCs השילו עיכוב משמעותי בצמיחת הגידול. תוצאות אלו מעידות על כך שניתן להשתמש ב-CSCs כמקור אנטיגנים יעיל יותר לטעינת dcs מאשר תאי גידול לא ממוינים מסורתיים להשראת חסינות מגנה מפני אתגר של תאי גידול.

כדי להבין טוב יותר את המנגנונים העומדים בבסיס החסינות האנטי-גידולי המגנה המושרה על ידי CSC שנצפתה, הופעלו תאים מבעלי חיים שחוסנו ב-DC ונמדדה ייצור הסייטוקינים שלהם באמצעות EISA; כפי שהודגם זה עתה, הייתה ייצור סייטוקינים גבוהה באופן משמעותי בתאים שנאספו מבעלי חיים שחוסנו ב-D five CSC TPCs, או S CCC seven CSC PCs, בהשוואה לאלה שנאספו מבעלי חיים שחוסנו ב-D five H TPCs או SCC seven HTCs. כעת ראיתם כיצד להשתמש בבדיקת Alor כדי לבודד תאי גזע סרטניים.

ניתן להשתמש בתאי גזע סרטניים אלו כדי לפתח אימונותרפיות המשתמשות בתאים דנדריטיים. תקוותנו היא שטיפולים אימונותרפיים אלו, שיינתנו לבדם או בשילוב עם טיפולים קיימים, ישפרו את התחזית עבור חולים עם סוגים רבים של סרטן.