שיטת Quantitation רגישה וספציפית לקביעת חלבון-C שרירן לב סרום הכבילה ידי Immunoassay Electrochemiluminescence

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת בו זמנית את חלבון קושר המיוזין הלבבי C וטרופונין לב I בדגימות סרום. זה מושג על ידי ציפוי ראשון של צלחת 96 בארות בנוגדנים C קושרים חלבון מיוזין לבבי לבדיקת פלקס, או על ידי שימוש בבדיקת תלת-פלקס מקודדת מראש. בשלב השני, הלוחות המצופים מודגרים עם כיולים ודגימות סרום.

בשלב הסופי מתווספים נוגדנים לזיהוי מסומנים, מיוצר אות כימילומינסנציה שמזוהה על ידי קורא הצלחות. בסופו של דבר, ניתן לקבוע את רמות חלבוני הלב המעניינים הקיימים בדגימות סרום על ידי בדיקות אימונולוגיות בודדות או מרובות. יום לפני הניסוי, פיפטה 30 מיקרוליטר של נוגדן חד-שבטי נגד מיוזין לבבי של עכבר נטול ג'לטין לפינה התחתונה של כל באר של גילוי בקנה מידה של 96 בארות.

לאחר מכן הקש על דפנות הצלחת כדי לפזר את תמיסת הנוגדנים על תחתית כל באר. לאחר האיטום יש לדגור את הצלחת למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס מבלי לרעוד. למחרת בבוקר, הקישו את התמיסה מעל הכיור ולאחר מכן על ערימת מגבות נייר.

לאחר מכן הוסף 150 מיקרוליטר של חוסם A 1% ב-PBS לכל באר כדי לחסום כריכה לא ספציפית. דגרו את הצלחת האטומה למשך שעה בטמפרטורת החדר תוך ניעור ב-700 סל"ד במהלך שלב החסימה, דללו את שבר החלבון C קושר המיוזין הלבבי הרקומביננטי לריכוז התחלתי של 2000 ננוגרם למיליליטר בחוסם A של 1% ב-PBS. לאחר מכן יש לדלל את התמיסה הזו באופן סדרתי בפקטור של חמישה, ובסך הכל שבעה תקנים.

כעת הסר את תמיסת החסימה כפי שהודגם זה עתה, ולאחר מכן שטוף את הצלחת שלוש פעמים עם 150 מיקרוליטר של 0.05% בין 20 ב-PBS. לאחר הכביסה השלישית, צעד במרץ העיף את הצלחת מעל כיור ואז טפח בחוזקה על הצלחת על שכבת מגבות נייר עד שהיא יבשה לחלוטין. לאחר מכן, פיפטה 25 מיקרוליטר מכל תקן ודגימה לבארות המתאימות.

לאחר מכן, בזמן שהצלחת האטומה דוגרת על השייקר למשך שעה בטמפרטורת החדר, יש לדלל נוגדן לזיהוי חלבון קושר מיוזין לב בהתאמה אישית המסומן בסול אוג למיקרוגרם אחד למיליליטר בחוסם 1% A ב-PBS. לאחר שטיפת הצלחת בזהירות כפי שהודגם זה עתה, הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים לזיהוי לכל באר ולאחר מכן דגר את הצלחת האטומה למשך שעה בטמפרטורת החדר תוך כדי טלטול במהלך תקופת הדגירה, הפעל את צלחת ההדגמה עם נורות LED כדי להבטיח את התפקוד התקין של הדמיית המגזר והתוכנה לדלל את מאגר ריד גם בשלב זה. לאחר שטיפת הצלחת בזהירות כפי שהודגם קודם לכן, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 150 מיקרוליטר של Reid Buffer לכל באר תוך הקפדה על מניעת בועות אוויר, ולאחר מכן סרוק מיד את הצלחת בתמונת המגזר לפני תחילת בדיקת השלושה.

אפשר לצלחת התלת-פלקס של 96 בארות ולתמיסות המדללות להתאזן לטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסיפו לצלחת 25 מיקרוליטר של חוסם 1% A ב-PBS, וודאו שכל הבאר מכוסה בתמיסה ודגרו את הצלחת האטומה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות תוך כדי ניעור. בינתיים, יש לדלל חלבון קושר מיוזין לבבי רקומביננטי C-C-K-M-B וטרופונין לב I יחד בחוסם A של 1% ב-PBS כדי ליצור תקן המכיל 2000 ננוגרם למיליליטר של חלבון קושר מיוזין לבבי C, 100 ננוגרם למיליליטר של CKMB ו-25 ננוגרם למיליליטר של טרופונין לבבי.

לאחר מכן אני מדלל את התערובת הזו בפקטור של חמש עד לנפח סופי של לפחות 100 מיקרוליטר עבור כל דגימות דילול סטנדרטיות פעמיים עם חוסם A של 1% ב-PBS. לאחר מכן, הוסף 2 שכפולים טכניים של 25 מיקרוליטר של התקנים כמו גם את הדגימות ל-25 מיקרוליטר של מאגר חסימה שכבר קיים בבארות של שלושת לוחות ה-plex, כלול ריק של מדלל רק לאחר דגירה של הצלחת האטומה תוך כדי טלטול, דלל את שלושת הנוגדנים לזיהוי SUL oag יחד לריכוז סופי של מיקרוגרם אחד למיליליטר כל אחד בחוסם תמיסה של 1% A ו-PBS לאחר שעתיים. שטפו את הצלחת כפי שהודגם זה עתה, ולאחר מכן השתמשו בפיפטה רב-ערוצית כדי להוסיף 25 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים לזיהוי לכל אחד.

דגרו היטב את הצלחת האטומה למשך שעה תוך כדי ניעור במהירות של 700 סל"ד בתקופת הדגירה. הפעל את לוחית ההדגמה ודלל את מאגר ריד כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, לאחר שטיפת הצלחת עם 0.05% בין 20 ב-PBS, השתמש בפיפטה הרב-ערוצית כדי להוסיף 150 מיקרוליטר של מאגר ריד לכל באר תוך הימנעות מבועות אוויר וסרוק מיד את הצלחת בתמונת המגזר.

באיור זה, העקומה הסטנדרטית של חלבון קושר מיוזין לב C במבחן ה-plex מושווה לזו של חלבון קושר מיוזין לב C בבדיקת שלושת ה-plex. שתי הבדיקות מראות רגישות גבוהה מאוד וטווח דינמי גבוה. אזור הזיהוי של הבדיקה מוצג באפור, גם plex וגם שלושה plex.

עקומות סטנדרטיות של חלבון קושר מיוזין לב C דומות. הגבול התחתון של הזיהוי, הגבול התחתון של הכימות והגבול העליון של רמות הכימות ניתנים להשוואה הן במבחני ה-plex והן במבחני ה-threeplex. גרפים אלה מראים עקומות סטנדרטיות של טרופונין לב I ו-CKMB של צלחת התלת-פלקס.

שני הכיולים הראו רגישות גבוהה וטווח דינמי גדול. אזור הזיהוי של הבדיקה מוצג באפור. התגובתיות ההדדית של נוגדני הזיהוי עם שני המכיילים האחרים נחקרה על ידי דגירה של העקומות הסטנדרטיות הבודדות של כל שלושת הכיולים עם נוגדנים לזיהוי יחיד, רק כמות נמוכה של תגובתיות צולבת נצפתה בין כיול CKMB לבין נוגדנים לזיהוי טרופונין I לבבי וחלבון קושר מיוזין לבבי C.

בעוד שלא נצפתה תגובתיות צולבת בין הכיולים האחרים ונוגדני זיהוי כהוכחה לתחולת הבדיקה לזיהוי פגיעה לבבית, רמות הסרום של 16 נבדקים עם אוטם שריר הלב הושוו לקבוצת ביקורת באמצעות שלוש רמות סרום צלחת פלקס של חלבון קושר מיוזין לב C-C-K-M-B וטרופונין לבבי. נקבע לי שכל שלושת הסמנים הביולוגיים היו מוגברים בחולים עם אוטם שריר הלב בהשוואה לקבוצת הביקורת.