בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם
21 באוגוסט 2014
כלי דם בתוך אוכלוסיות אנושיות נמל שריר שלד כמה רבת שושלת המבשרת כי הם אידיאליים עבור יישומי משובי. שיטת בידוד זה מאפשרת טיהור בו זמני של שלוש אוכלוסיות תאי מבשר multipotent בהתאמה משלוש שכבות מבניות של כלי דם: תאי myogenic אנדותל מאינטימה, pericytes מתקשורת, ותאי adventitial מadventitia.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולטהר תתי-אוכלוסיות של תאי קדם רב-עוצמה המופקים מכלי דם אנושיים מתוך ביופסיה בודדת של שריר שלד; ראשית, יש לפרק את ביופסיית השריר ולעכל אותה באמצעות שילוב של collagenase מסוגים one, two ו-four. לאחר מכן, יש לסמן את תרחיף התאים הבודדים באמצעות נוגדנים מצומדים לפלואורסצנציה המזהים שילוב של סממני שטח תא נבחרים. לבסוף, יש לבצע מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) באמצעות ציטומטריה של זרימה.
צפו והרחיבו את תתי-סוגי התאים הממוינים בתנאי תרבית ספציפיים בצפיפויות אופטימליות. בסופו של דבר, ניתוח לאחר מיון של תאים מטוהרים, כמו גם ניתוחי flow cytometry ו-R-T-P-C-R עוקבים של תתי-אוכלוסיות תאים שהתרביו, משמשים להדגמת הטוהר של תתי-אוכלוסיות BVSE הומוגניות אלו. כן, שיטה זו יכולה לענות על השאלה מהו מקורן של תאי גזע מזנכימליים של גמלים אלו?
כידוע, אנשים רבים מצאו סוגים שונים של תאי גזע ברקמות שונות. לכן אני סבור כי הדבר יכול להשיב על השאלה בנוגע למקורם של תאי גזע אלו, וכן על התפקיד שתאי פרי-וסקולריים ותאים אחרים המגזרים מכלי דם ממלאים ברגנרציה ובתיקון של רקמות. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, בדומה לביופסיה של השריר.
שלבי הדיסוציאציה עשויים להיות קשים ללמידה. פרטים טכניים ואופטימיזציה של עיכול בקולגנאז' הם קריטיים ביותר לתשואה ולטיהור של תאי המטרה. העבירו את הביופסיה של השריר השלדי האנושי על קרח.
בתוך DM M מועשר ב-5% FBS וב-1% penicillin streptomycin תחת תנאים סטריליים. שטפו את הדגימה פעמיים ב-PBS המכיל 2% antibiotic antifungal ולאחר מכן ב-dms, מועשר ב-2% aa. הסירו את רקמת השומן ורקמת החיבור הצמודות.
הסר בנוסף את כלי הדם הגדולים תחת מיקרוסקופ דיסקציה. כעת חתוך את דגימת השריר לחתיכות קטנות. העבר את הדגימות ל-20 milliliters של תוכה לשימור לאחסון בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך עד חמישה ימים.
ביום בידוד התאים, הוצא את נתחי השריר ושטוף אותם פעמיים ב-PBS המכיל 2% pen strip. להכנת תמיסת העיכול, הוסף 100 mg/mL מכל אחד מהסוגים collagenase type one, type two ו-type four לתוך pm.
לבסוף, קצצו וטחנו באופן מכני את חתיכות השריר עם כמות קטנה של pm. העבירו את התמיסה דרך פיפטה סרולוגית של 10 milliliter תוך מעקב אחר היעדר קרישה. הסירו את השאריות של הרקמה השומנית והרקמה החיבורית במהלך תהליך זה.
לאחר מכן, העבירו מחצית מדגימת המבוגר ל-20 milliliters או את כל דגימת העובר ל-10 milliliters של תמיסת העיכול. בשלו את הדגימה למשך 50 עד 60 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius על שייקר אורביטלי במהירות של 70 עד 80 RPM. עקבו אחר מצב העיכול מדי 15 עד 20 דקות.
יש למקסם את תנובת התאים ואת שימור האנטיגנים על פני השטח על ידי התאמה של זמן העיכול ו/או מהירות הערבוב בהתאם לכמות הרקמה; כאשר העכירות כמעט נעלמת, יש לבצע פיפטאז (pipette) נמרץ של הרקמה המעובדת שלוש עד חמש פעמים. הוסף כמות שווה של PM כדי לעצור את התגובה, ולאחר מכן סבב בצנטריפוגה במהירות של 400 Gs למשך ארבע דקות. הסר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) כדי לשטוף את המשקע, ותלה אותו מחדש ב-10 milliliters של pm. סנן דרך מסננת תאים של 100 micron, סבב בצנטריפוגה במהירות של 400 Gs למשך ארבע דקות, והסר בזהירות את הנוזל העליון.
בשלב הבא, השהו את המשקעים בבופר לליזת תאי דם אדומים וסננו דרך מסנן תאים של 70 מיקרון כדי לקבל תרחיף של תאים בודדים. לאחר דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, סננו את התרחיף דרך מסנן תאים של 70 מיקרומטר. אם נצפה משקע כלשהו, השקיפו את התאים באמצעות סבב צנטריפוגה.
השעה ב-0.5 milliliters של PBS וספור את מספר התאים לצורך צביעה. דלל את תגלהי התאים הבודדים לריכוז של פחות מ-5 million תאים ל-milliliter באמצעות PBS, קח aliquot של 50 עד מאה microliters מתגלהי התאים וחלק ל-11 מבחנות עבור ביקורת ללא צביעה, הביקרות השליליות והביקרות החיוביות בצבע בודד. במידת הצורך, בצע חסימה (block) לתגלהי התאים הבודדים למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius בסרום של עכבר.
הוסיפו את תמיסות הנוגדנים בהתאם לתכנון הניסוי והדגירו למשך 20 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. השקיעו את התאים באמצעות סבוב (centrifugation) ושטפו כל משקע דגימה פעם אחת ב-PM מהול בריכוז סופי של 5 מיליון תאים למילילטר לצורך הדרת תאים מתים בדילול של 1 ל-100 של שבעה a a d, והדגירו למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עבור ביקורת השלילה ובקרות הצבע הבודדות החיוביות. השהו שוב את משקעי התאים ב-0.5 מיליליטר של pm מהול.
העבירו את כל תרחיפי התאים למבחנות פוליסטירן בעלות תחתית עגולה המיועדות לציטומטריית זרימה. כעת, הכינו מבחנות לאיסוף תאים המכילות 500 µL של מצע הגידול המתאים. השניעו את תרחיפי התאים על קרח אל התא.
בצעו מיון של תרחיפי התאים במיון התאים לפי הסדר הבא: ביקורת שלילית לא צבועה, ביקורות חיוביות של צבע בודד ותרחיף התאים הראשי, תוך כיוון קפדני של עוצמת הלייזר, פיצוי הערוצים (compensation) והגדרת השערים (gating) של אוכלוסיות התאים כדי למקסם את טוהר התאים. אספו את אוכלוסיות התאים הרצויות למבחנות האיסוף המתאימות. שמרו את התאים שנאספו בטמפרטורה של 4°C.
אם לא זורעים באופן מיידי, יש לזרוע תאי אנדותל מיוגניים שמומנו לאחרונה ב-MPM על פלטות שעברו קידוד מוקדם עם Collagen Type one לצורך אריזה עוקבת של ECS seed.
3,500 עד 4,000 תאים לסמ"ק ב-MPM על צלחות או בקבוקים המצופים מראש בקוﻻגן מסוג one seed. טפילים שמומנו טריים ב-e gm two על צלחות המצופות טריים ב-0.2% gelatin עבור המעברים הראשון והשני. פצלו את התאים ביחס של 1:3 בתווך PC על תרבית פוליסטירן רגילה.
פלטות החל ממעבר שלישי (P3). זריעת תאים בריכוז של 6,500 עד 7,000 תאים לסמ"ר במצע PC על פלטות תרבית רגילות מפוליסטירן. לבקבוקים, זריעת תאי רקמה אדוונטית שמומנו לאחרונה במצע AC על פלטות תרבית רגילות מפוליסטירן לצורך אריזה עוקבת של תאי זרע ACS בריכוז של 6,000 עד 7,000 תאים לסמ"ר במצע AC על פלטות תרבית רגילות מפוליסטירן.
פרמטרי העובדות של הבקבוקים מתוקנים תחילה על בסיס הנתונים שהתקבלו מהביקורת ללא צביעה, מהביקרות השליליות ומהביקרות החיוביות בצבע בודד לאחר החרגת תאים מתים; תרחיף התאים המסומנים פלואורסצנטית עובר סדרה של בחירות של סממני פני שטח חיוביים ושליליים. תחילה מבוצע גייט-אאוט (gated out) לתאים חיוביים ל-CD 45. לאחר מכן, תאים חיוביים ל-CD 56 ותאים שליליים ל-CD 56 מופרדים מהfrakציה השלילית ל-CD 45.
הפракציה החיובית ל-CD 56 עוברת מיון נוסף ל-CD 34 ו-CD 1 44, כאשר רק תאים חיוביים לשניהם מסומנים כתאי אנדותל מיוגניים ונאספים לאחר מכן. באופן דומה, הפракציה השלילית ל-CD 56 עוברת מיון נוסף ל-CD 34 ו-CD 1 46, כאשר רק תאים שליליים ל-CD 34 וחיוביים ל-CD 1 46 מסומנים כטפילים ונאספים; הפракציה החיובית ל-CD 34 והשלילית ל-CD 1 46 עוברת מיון שלילי נוסף ל-CD 31 כדי להוציא תאי אנדותל, ורק תת-האוכלוסייה החיובית ל-CD 34 והשלילית ל-CD 31 מסומנת כתאי adv לאיסוף. במקרה זה, ניתן להשתמש ב-CD 1 44 כתחליף ל-CD 31 לצורך הדחת תאי EC.
תת-אוכלוסיות של H-P-V-S-C אלו הופקו מביופסיות של שריר מתורם יחיד. בניגוד לתאי גזע של שריר שהם לרוב הטרוגניים, תרביות של תתי-אוכלוסיות של תאי גזע המופקים מכלי דם אנושיים נותרות הומוגניות גם לאחר הרחבה לטווח ארוך. כפי שאתם יודעים, אני סבור שזה חשוב מאוד עבור חוקרי עור להשתמש באותה טכניקה כדי לבודד את תאי הגזע המופקים מכלי דם שתיארנו במעבדות שלנו.
לכן אנו מאמינים ששיטה זו, המוצגת באופן השוואתי, תאפשר לאנשים לשחזר את התוצאות שלנו ולהשוות באופן ממשי את התוצאות בין צוותים שונים. זכרו כי עבודה עם רקמה אנושית טרייה עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות ניטריל והגנה על העיניים, בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לבידוד וטיהור של תאי מקור מולטיפוטנטיים מכלי דם אנושיים בשריר השלד. ההליך מאפשר טיהור סימולטני של תאים אנדותליאליים מיוגניים, פריציטים ותאי אדוונטיטיה משכבות מבניות שונות של כלי הדם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- רפואה רגנרטיבית
- ביולוגיה של התא
- מחקר תאי גזע
רקע
- שריר השלד האנושי מכיל אוכלוסיות של תאי קדם רב-קוים.
- לתאי קדם אלו פוטנציאל ליישומים בטיפולים רגנרטיביים.
- בידוד של תאים אלו יכול לשפר את ההבנה של תכונותיהם.
- כלי דם משמשים כמקור לתאים מולטיפוטנטיים אלו.
מטרת המחקר
- לבידוד תתי-אוכלוסיות ספציפיות של תאי מוצא שמקורם בכלי דם.
- לניקוי תאים אנדותליאליים מיוגניים, פריציטים ותאי אדוונטיציה.
- לניתוח רמת הטוהר והמאפיינים של אוכלוסיות תאים אלו.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיסוציאציה של ביופסיה של שריר שלד באמצעות עיכול בקולגנאז.
- סימון של תרחיף תאים בודדים באמצעות נוגדנים המשוייכים לפלואורסצנציה.
- מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) באמצעות ציטומטריה של זרימה.
- ניתוח לאחר מיון הכולל ציטומטריה של זרימה ו-RT-PCR.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של שלוש אוכלוסיות נפרדות של תאי מקור רב-פוטנציאליים.
- טוהר גבוה של תתי-סוגי תאים ממוינים שאושר באמצעות אנליזה.
- השיטה מדגימה פוטנציאל לחקר מקורם של תאי גזע מזנכימליים.
- מספקת תשתית ליישומים רגנרטיביים עתידיים.
מסקנות
- השיטה המתוארת מבודדת ביעילות תאי מוצא משריר שלד אנושי.
- ניתן להשתמש בתאים אלו למחקרים נוספים ברפואה רגנרטיבית.
- הבנת אוכלוסיות אלו עשויה להוביל להתקדמות באסטרטגיות טיפוליות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת בידוד סימולטני של שלוש תתי-אוכלוסיות נפרדות של תאי קדם רב-פוטנציאליים ממקור כלי דם, מביופסיה בודדת של שריר שלד אנושי, ובכך מייעלת את השגת חומרי המקור עבור תוכניות של רפואה רגנרטיבית. באמצעות שמירה על הומוגניות פנוטיפית במהלך הרחבה ארוכת טווח, היא תומכת בהערכה פרה-קלינית הדירה של תרומת תאים פרי-וסקולריים למנגנוני תיקון רקמה. הגישה נותנת מענה לאתגר מרכזי בשלב הגילוי: הגדרת המקור התאי והספציפיות התפקודית של אוכלוסיות דמויות תאי סטרומה מזנכימליים ברקמה אנושית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הנוגעות לתפקידם של תאים פרי-וסקולריים (perivascular) ברגנרציה של שריר ובפיברוזיס.
- ערך תפעולי: מספק מקור סטנדרטי של תאי אנדותל מיוגניים, פריציטים ותאי אדוונטיציה הומוגניים לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
- ערך ניבוי: תומך בתיקוף יעדים (target validation) על ידי קישור אוכלוסיות ספציפיות של נישות וסקולריות לפוטנציאלי דיפרנציאציה מזודרמליים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות לבדיקה: מייצר תתי-אוכלוסיות של תאים מופקים המתאימים להקמה של בדיקות in vitro כמותיות וניתנות לשחזור של נדידה, שגשוג ודיפרנציאציה.
- יכולת הרחבה: פרוטוקול הבידוד המבוסס על FACS מאפשר ייצור עקבי של אוכלוסיות תאים מוגדרות על פני מספר דגימות מתורמים שונים.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: מאפשר לצוותים רב-תחומיים להשוות את השפעות של תרכובות על שושלות תאים פריווסקולריות שונות באמצעות מסגרת בידוד משותפת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מקל על חקר של תאי קדם שמקורם בכלי דם במודלים של פגיעה בשריר, איסכמיה ופיברוזיס.
- המשכיות תרגומית: שומר על יציבות פנוטיפית של תתי-אוכלוסיות מבודדות במהלך התרחבות, ובכך תומך בניתוח תגובה למינון ובפרופיל בטיחות.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר הערכה תפקודית ספציפית לשושלת תאים, כדי לספק בסיס להחלטות go/no-go בפיתוח פרה-קליני.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי אספקת קלט תאי מוגדר לצורך תיקוף מטרות, פיתוח בדיקות ומחקרים מכניסטיים של תרומות הנישה הווסקולרית ל재גנרציה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי המקור והתפקוד של תאים דמויי MSC בשריר השלד האנושי.
- סריקה: מספקת אוכלוסיות תאים מטוהרות וסטנדרטיות המאפשרות סריקת תרכובות מהימנה על פני שושלות פריווסקולריות.
- אנליטיקה: מייצרת תוצאים כמותיים באמצעות flow cytometry ו-RT-PCR להערכת טוהר, זהות וסמנים תפקודיים לאחר הבידוד.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין הבידוד לוולידציה פרה-קלינית על ידי שמירה על תרביות הומוגניות המתאימות למחקרי יעילות ומנגנון.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת זרימת עבודה להבידוד שניתן להשתמש בה שוב עבור תוכניות רב-פרויקט החוקרות טיפולים בתאי סטרומה וסקולריים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי מתן אפשרות להשוואה זה לצד זה של אוכלוסיות שונות של תאי קדם פריווסקולריים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של בידוד באמצעות FACS, ובכך משפר את השחזור ומפחית את השונות בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי פורטפוליו על ידי הבהרת הפוטנציאל הרגנרטיבי של תאים ספציפיים המופקים מנישות וסקולריות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של טיפולים מבוססי תאים המותאם לסיכון, בהתבסס על מנגנוני פעולה תאיים מוגדרים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ברקמות ראשוניות, עיכול אנזימטי וציטומטריית זרימה.
- תלוי בגישה למכשור FACS ובפאנלים מאושרים של נוגדנים עבור CD34, CD144, CD146, CD31, CD45 ו-CD56.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לאופטימיזציה של עיכול באמצעות קולגןאז כדי לאזן בין התניב לבין שימור אנטיגנים על פני השטח.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום אסטרטגיית הבידוד למקורות רקמה אחרים או למצבים מחלה שונים.
- מוגבל על ידי הצורך בביופסיות טריות או משומרות כראוי של שריר שלד אנושי כדי להבטיח תרחיפים חיוניים של תאים בודדים.
