גרימת Myointimal היפרפלזיה נגד טרשת עורקים בעכברים: מבוא של שני מודלים חוקיים
14 במאי 2014
וידאו זה מראה שני מודלים של פיתוח פלאק בעורקי intimal עכבריים ומדגיש את ההבדלים בהיפרפלזיה myointimal וטרשת עורקת.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להציג שני מודלים חייתיים תקפים המובילים להיצרות של אבי העורקים (aorta) באמצעות מנגנונים שונים. המודל הראשון הוא צנתור בבלון של אבי העורקים כדי ליצור התפתחות של היפרפלזיה מיואינטימלית (myo intimal hyperplasia). ראשית, חושפת ונסגרת באמצעות תפסנית אבי העורקים הבטנית התת-כלייתית (infrarenal abdominal aorta).
לאחר מכן פותחים את האורטה באמצעות חתך רוחבי ומכניסים את קטטר הבלון. לאחר מכן מקלפים את האנדותל של האורטה באמצעות הקטטר מנופח ומסיימים את הניתוח. המודל השני הוא מניפולציה תזונתית של עכברים טרנסגניים מסוג APOE null ליצירת פלאקים אתרוסקלרוטיים.
עכברים אלו מחזיקים בתנאים סטנדרטיים ומוזנים בתזונה מערבית עשירה בשומנים במשך ארבעה עד שישה חודשים. בסופו של דבר, ניתוח היסטולוגי של היפרפלזיה מיו-אינטימלית שהושרה בניתוח ושל מודל הגבלת תזונה מראה שהם מובילים להיצרות לומנלית שונה. היום נציג בפניכם שני מודלים שונים להשראת היצרות לומנלית: מודל עכברים המשתמש בקטטר בלון להשראת פגיעה בכלי דם, ומודל של טרשת עורקים.
שימוש בעכברים טרנסגניים בתזונה מערבית, מודל קטטר הבלון יכול לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הסטנוזיס. מודל עכברים טרנסגניים הומוזיגוטים של מוטציית upper E משמש לחקר הפתופיזיולוגיה של טרשת עורקים. עבור מודל ההיפרפלזיה האינטימלית, השג עכברים מסוג C 57 black six J השוקלים כ-25 גרם.
יש לתחזק אותם בתנאים רגילים עם תזונה רגילה. לאחר הרדמת העכבר באמצעות 2% isof fluorine, יש לגזום את שיער הבטן ולהחדיר carprofen בזריקה תת-עורית לצורך אלגזיה. לאחר מכן, יש לחטא את העור לסירוגין עם Provo iodine ו-80% ethanol בשני מחזורים.
כעת בדקו את היעדרו של רפלקסים באמצעות צביטה בבוהן. התחילו את הניתוח על ידי הפרדת העור והשריר לאורך ה-linea alba. לאחר מכן, עטפו את המעיים בכפפה שהורטבה בסלין, ואז בזהירות, הסירו את רקמת השומן כדי לחשוף את האורטה הבטנית.
כעת חשפו את האורטה התת-כלייתית (infrarenal aorta) עד להסתעפותה. יש להיזהר לא לפגוע בכלי דם מסתעפים. כעת סגרו את האורטה באמצעות תפסן (clamp).
ראשית, הנח תפס מיקרו-כירורגי על העורק האורטה האינפרא-רנלי הפרוקסימלי כדי לחסום את זרימת הדם. שנית, הנח תפס דיסטלי שני בסמוך למתשעפות האורטה. כאשר זרימת הדם נפסקת, בצע חתך קטן באורטה קרוב לתפס הפרוקסימלי.
הכנס את הקטטר לכיוון התסמיך הדיסטלי של האורטה כדי ליצור פגיעה אנדותללית. בצע דנודציה של האורטה על ידי ניפוח בלון הקטטר ומשיכה זהירה ואיטית של הקטטר לכיוון התסמיך הפרוקסימלי. חזור על תמרון זה פעמיים, לסך הכל שלושה ניפוחים של האורטה.
כעת הוצא את הקטטר וסגור את החתך באביון באמצעות תפרים רציפים של 10 au proline. כאשר התפרים במקומם, פתח בזהירות את התפס הדיסטלי; אם יש דימום באתר האוטוטומיה של ה-AOR, סגור שוב את התפס, אתר את מקור הדימום ועצור אותו באמצעות תפרים נפרדים נוספים.
כאשר אין דימום, פתח לאט את התסמיך הפרוקסימלי. דופק אאורטלי אמור להיות נראה כדיסטאלית לחתך. כעת סדר את המעיים ב-C two.
בשלב הבא, סגרו את דופן הבטן החל משכבת השריר באמצעות שש תפרי רצף מסוג OTT proline. לאחר מכן, סגרו את העור באמצעות חמישה תפרי OTT והעבירו את העכבר בחזרה לכלובו. במהלך שלושת הימים הראשונים לאחר הניתוח, הוסיפו metrazole למי השתייה לצורך שיכוך כאבים.
יש לעקוב אחר בעל החיים לאורך תקופת ההחלמה, הנמשכת כ-28 ימים. עבור מודל טרשת העורקים, השג עכברים בני ארבעה שבועות עם חסר ב-POE. השכן עכברים אלו בתנאים סטנדרטיים עם תזונה מערבית עשירה בליפידים למשך ארבעה עד שישה חודשים.
יש להקפיד על תזונה זו לאורך כל הניסוי. שש שעות לפני קצירת האורטה, יש להפסיק את הגישה למזון. לאחר מכן, הכין את העכבר לניתוח כפי שמתואר בסעיף הקודם.
התחילו את הניתוח בפתיחת בית החזה. לאחר מכן, חתכו את שיאו (apex) של הלב ובצעו פרפוזיה תחת לחץ עדין של 3 mL של 4% Paraformaldehyde דרך שורש האאורטה כדי לקבע אותה. לאחר מכן, שחררו את האאורטה מהשורש ועד למפגש הפיצול (bifurcation) שלה.
נסו להסיר כמה שיותר מהרקמה השומנית. לאחר מכן, חתכו את קשת האבהרי (aortic arch) ושמרו אותה ב-4% paraformaldehyde. כעת העבירו את הלב ואת עץ האבהרי לצלוחית מצופה סיליקון המכילה PBS.
חתכו קצה אחד של עץ האביונים (aortic tree) וקבעו אותו לשכבת הסיליקון בעזרת סיכות עדינות. פתחו את האביון לאורכו ואפשרו לרקמת האביון להשקיע ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך מספר דקות. לאחר מכן, שטפו את הרקמה פעם אחת ב-50% ethanol והטבילו אותה באמבט של Sudan.
שלוש, תמיסת צביעה למשך כ-15 דקות. לאחר הצביעה, שטפו במהירות את הרקמה ב-50% ethanol למשך מספר שניות כדי להסיר רק את עודפי ה-Sudan. שטיפה יתרה תסיר יותר מדי צבע; שטפו מיד את הרקמה במים מזוקקים והמשיכו להדמיה. עבור מודל ההיפרפלזיה של האינטימה והמדיה (myo intimal hyperplasia), נגזרו אאורטות של עכברים לאחר הסרה של שכבת האינטימה (denuded), נטמנו בפרפין ונצבעו ב-chrome. יחסי ה-Im חושבו מנתחי צביעת ה-tri chrome על ידי מדידת עובי האינטימה והמדיה.
באמצעות ניתוח ממוחשב ולאחריו חישוב היחס, נמדד עובי הפלאק המקסימלי כעובי האינטימה המקסימלי בחלל הלומן באמצעות morpho tree ממוחשב. אחוז החסימה של הלומן חושב כיחס בין הלומן הפנימי החדש ללומן הקודם. שטח הפלאק חושב על ידי חיסור הלומן הפנימי החדש מהלומן הקודם.
אותם ניתוחים בוצעו על חתכים רוחביים צבועים ב-tri chrome של מודל האתרולרוזיס במסתם האאורטלי, בקשת האאורטה ובאאורטה היורדת עבור מודל האתרולרוזיס בלבד. האאורטה היורדת נפתחה לאורכה ונצבעה ב-Sudan red. שטח הפלאק והשטח הכולל של האאורטה נמדדו בעזרת מחשב לצורך ניתוח של שני המודלים.
ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון היסטופתולוגיה ומיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית קונפוקאלית, כדי לענות על שאלות הנוגעות לאובלציה לומנלית, מורפולוגיה ותאיות. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מציג שני מודלים של התפתחות פלאק אינטימלי בעורקים של עכברים, תוך התמקדות במכניזמים של היפרפלזיה מיו-אינטימלית ואתרוסקלרוזיס.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה קרדיווסקולרית
- פתולוגיה וסקולרית
- מודלים של בעלי חיים
רקע
- התפתחות פלאק אינטימלי היא קריטית להבנת מחלות קרדיווסקולריות.
- היפרפלזיה מיואינטימלית ואתרוסקלרוזיס הם שני תהליכים נפרדים המובילים להיצרות עורקים.
- מודלים של בעלי חיים חיוניים לחקר מנגנונים אלו.
- מחקר זה משתמש במודלים של עכברים כדי לחקור מצבים אלו.
מטרת המחקר
- להציג שני מודלים חייתיים תקפים למחקר של היצרות אבי העורקים.
- להשוות בין המנגנונים של היפרפלזיה מיואינטיםלית (myointimal hyperplasia) לבין טרשה (atherosclerosis).
- להעמיק את ההבנה של התפתחות פלאקים בעורקים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- צנתור בלון של האאורטה להשראת היפרפלזיה מיואינטימלית.
- מניפולציה תזונתית של עכברים טרנסגניים APOE null ליצירת פלאקים אתרוסקלרוטיים.
- חשיפה והדקתו של האאורטה הבטנית התת-כלייתית לצורך התערבות כירורגית.
- הסרה של האנדותל באמצעות צנתר מנופח במהלך הפרוצדורה.
תוצאות עיקריות
- השראה מוצלחת של היפרפלזיה מיואינטימלית באמצעות קטטר בלון.
- היווצרות פלאקים אתרוסקלרוטיים בעכברים טרנסגניים מסוג APOE null באמצעות שינויים תזונתיים.
- הדגמה של מנגנונים שונים המובילים להיצרות עורקים.
- ייצוג חזותי של התפתחות פלאקים בעורקי עכברים.
מסקנות
- שני המודלים מדגימים ביעילות מסלולים שונים של התפתחות פלאק אינטימלי.
- הבנת מנגנונים אלו עשויה לסייע בגיבוש אסטרטגיות טיפוליות למחלות קרדיווסקולריות.
- מחקרים עתידיים עשויים להתבסס על מודלים אלו כדי לבחון השלכות נוספות על בריאות כלי הדם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת מנגנונים מובחנים של היצרות עורקים היא קריטית לתיקוף מטרה בתהליך גילוי תרופות למערכת קרדיו-וסקולרית. מודלי עכברים משלימים אלו מאפשרים הפחתת סיכונים מנגנונית על ידי הבחנה בין נתיבים של היפרפלזיה מיואינתימלית לבין נתיבים של אתרוסקלרוזיס. בחירת המודל המתאים משפרת את רמת הביטחון החיזויה בהערכה פרה-קלינית של התערבויות טיפוליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הספציפיות לשגשוג שריר חלק לעומת היווצרות פלאק המונעת משומנים.
- ערך תפעולי: מספק מודלים הניתנים לשחזור לצורך תיקוף של מעורבות המטרה (target engagement) בהקשרים פתולוגיים שונים.
- ערך אסטרטגי: תומך בהבהרת מסלולים ביולוגיים ובצמצום סיכונים ביולוגיים לצורך קבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח הספציפיים לאינדיקציה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: יצירת מערכות רלוונטיות למחלה להערכת השפעות של תרכובות על עיבוי האינטימה לעומת התפתחות נגעים אתרוסקלרוטיים.
- ערך תפעולי: אספקת תוצאות מבוססות היסטולוגיה סטנדרטיות וכמותיות, המוכנות לסריקה בתופעת של סריקה רב-מסילית (high-throughput).
- ערך אסטרטגי: מקל על הגדלת קנה המידה של הבדיקה ושימוש חוזר במגוון פלטפורמות במסגרת קמפיינים לזיהוי מובילים (leads) קרדיווסקולריים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק תובנה מכניסטית לתהליכי חסימת הלומן כדי להנחות את התאמת הביומארקרים וההמשכיות התרגומית.
- ערך תפעולי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות ניתוח מורפומטרי כמותי של שטח הפלאק וחסימת הלומן.
- ערך אסטרטגי: משפר את תקפות המודל הפרה-קליני להערכת טיפולים המשנים את מהלך המחלה בהשראות של טרשת עורקים או היצרות חוזרת (restenosis).
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
המודלים משולבים לאורך רצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לבדיקות יעילות פרה-קליניות, ובכך מאפשרים קבלת תוצאות המתאימות לשלב הרלוונטי לצורך קבלת החלטות של go/no-go.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של מנגנונים ספציפיים למסלולים בפגיעה כלי דם ובמטבוליזם של ליפידים.
- סריקה: מספק פלטי רקמה מוכנים לבדיקה עם מורפומטריה כמותית להשוואת השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מדידות מורפומטריות בעזרת מחשב של עובי האינטימה/מדיה ושטח הפלאק להשוואה אובייקטיבית של מצבים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאי הגילוי לתיקוף פרה-קליני באמצעות היסטולוגיה וצביעה אימונוהיסטוכימית להערכת תאיות ומורפולוגיה.
- שימוש חוזר בארגון: מבסס זרימות עבודה כירורגיות ואנליטיות הניתנות לשימוש חוזר עבור מודלים של פתולוגיה קרדיו-וסקולרית בפרויקטים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באמצעות בידול מכניסטי של אתילוגיות של stenosis והפחתת עמימות ביולוגית.
- ערך תפעולי: הליכים כירורגיים ופרוטוקולי היסטולוגיה סטנדרטיים מבטיחים הדירות ויכולת הרחבה בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות go/no-go טובות יותר על ידי התאמת מודלים ספציפיים למנגנון עם המודאליות הטיפולית וההתוויה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון המבוסס על פתופיזיולוגיה רלוונטית למחלה וביטחון בתיקוף המטרה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בניתוחים וסקולריים בעכברים ובטיפול פרי-אופרטיבי לצורך קתטריזציה מוצלחת של האאורטה וקצירת רקמות.
- תלוי בציוד עבור סגירה מיקרוכירורגית, מניפולציה של קתטרים ועיבוד היסטולוגי, כולל הטמעה בפרפין וצביעה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין צוותי הניתוח, ההיסטולוגיה והדימיון לצורך ניתוח מורפומטרי עקבי.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום מודלים על זני עכברים שונים או משטרי תזונה מעבר לפרוטוקולים של ApoE-/-, C57BL/6J ותזונה מערבית.
- מגבלות מעשיות כוללות ניטור התאוששות לאחר ניתוח (28 ימים) ומשך תזונה ממושך (4–6 חודשים) עבור מודל טרשה, דבר המשפיע על לוחות הזמנים של המחקר.
