Name: המהונדס מכרסמים Assay עבור תדר Mutant תאי ניבט זכר כימות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T15:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: למדו כיצד למדוד תדירות מוטציות בתאי זרע של עכברים טרנסגניים לאחר חשיפה למוטגן כימי או פיזי. שיטה זו משפרת רגישות ומפחיתה משאבים בהשוואה לשיטות מסורתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי יוזמות המערכת הרגולטורית הקנדית לביוטכנולוגיה (CRSB) ותוכנית ניהול כימיקלים (CMP).

<ol><li>Ahmadi, A., Ng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilizing+ability+of+DNA-damaged+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa.</a> J. Exp. Zool. 284 (6), 696-704 (1999).</li>
<li>Crow, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins%2C+patterns+and+implications+of+human+spontaneous+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation.</a> Nat. Rev. Genet. 1 (1), 40-47 (2000).</li>
<li>Nelson, K., Holmes, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malformations+due+to+presumed+spontaneous+mutations+in+newborn+infants%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Malformations due to presumed spontaneous mutations in newborn infants.</a> N. Engl. J. Med. 320 (1), 19-23 (1989).</li>
<li>Kong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+de+novo+mutations+and+the+importance+of+father%27s+age+to+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rate of de novo mutations and the importance of father's age to disease risk.</a> Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).</li>
<li>Michaelson, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequencing+in+autism+identifies+hot+spots+for+de+novo+germline+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequencing in autism identifies hot spots for de novo germline mutation.</a> Cell. 151 (7), 1431-1442 (2012).</li>
<li>Marchetti, F., Wyrobek, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+decline+during+mouse+spermiogenesis+results+in+the+accumulation+of+heritable+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">DNA repair decline during mouse spermiogenesis results in the accumulation of heritable DNA damage.</a> DNA Repair (Amst). 7 (4), 572-581 (2008).</li>
<li>Marchetti, F., Wyrobek, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+consequences+of+paternally-transmitted+chromosomal+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+C.+Embryo.+Today%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and consequences of paternally-transmitted chromosomal abnormalities.</a> Birth Defects Res. C. Embryo. Today. 75 (2), 112-129 (2005).</li>
<li>Demarini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Declaring+the+existence+of+human+germ-cell+mutagens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Declaring the existence of human germ-cell mutagens.</a> Environ. Mol. Mutagen. 53 (3), 166-172 (2012).</li>
<li>Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+dominant-lethal+test+to+detect+genetic+activity+of+environmental+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health.+Perspect%22%5BJournal%5D)">Use of the dominant-lethal test to detect genetic activity of environmental chemicals.</a> Environ. Health. Perspect. 6, 23-26 (1973).</li>
<li>Russell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray-induced+mutations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">X-ray-induced mutations in mice.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 16, 327-336 (1951).</li>
<li>Singer, T. M., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+mutagens%3A+Risk+assessment+challenges+in+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Germ cell mutagens: Risk assessment challenges in the 21st century.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51 (8-9), 919-928 (2010).</li>
<li>Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, P., Eriksson, S., Tornqvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide%3A+A+cooking+carcinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Acrylamide: A cooking carcinogen.</a> Chem. Res. Toxicol. 13 (6), 517-522 (2000).</li>
<li>Witt, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow+micronucleus+test+results+do+not+predict+the+germ+cell+mutagenicity+of+N-hydroxymethylacrylamide+in+the+mouse+dominant+lethal+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow micronucleus test results do not predict the germ cell mutagenicity of N-hydroxymethylacrylamide in the mouse dominant lethal assay.</a> Environ. Mol. Mutagen. 41 (2), 111-120 (2003).</li>
<li>Marchetti, F., Rowan-Carroll, A., Williams, A., Polyzos, A., Berndt-Weis, M. L., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sidestream+tobacco+smoke+is+a+male+germ+cell+mutagen%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Sidestream tobacco smoke is a male germ cell mutagen.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), 12811-12814 (2011).</li>
<li>Yauk, C. L., Dubrova, Y. E., Grant, G. R., Jeffreys, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single+molecule+analysis+of+spontaneous+and+radiation-induced+mutation+at+a+mouse+tandem+repeat+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus.</a> Mutat. Res. 500 (1-2), 147-156 (2002).</li>
<li>Niwa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+mechanisms+of+genomic+instability+and+the+biological+significance+of+mutations+at+tandem+repeat+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Indirect mechanisms of genomic instability and the biological significance of mutations at tandem repeat loci.</a> Mutat. Res. 598 (1-2), 61-72 (2006).</li>
<li>Campbell, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+human+mutation+rate+using+autozygosity+in+a+founder+population%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Estimating the human mutation rate using autozygosity in a founder population.</a> Nat. Genet. 44 (11), 1277-1281 (2012).</li>
<li>Beal, M. A., Glenn, T. C., Somers, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+sequencing+for+quantifying+germline+mutation+frequency+in+humans+and+model+species%3A+Cautious+optimism%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Whole genome sequencing for quantifying germline mutation frequency in humans and model species: Cautious optimism.</a> Mutat. Res. 750 (2), 96-106 (2012).</li>
<li>Shwed, P. S., Crosthwait, J., Douglas, G. R., Seligy, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+MutaMouse+lambdagt10-lacZ+transgene%3A+Evidence+for+in+vivo+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Characterisation of MutaMouse lambdagt10-lacZ transgene: Evidence for in vivo rearrangements.</a> Mutagenesis. 25 (6), 609-616 (2010).</li>
<li>Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+review+of+transgenic+rodent+mutation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Detailed review of transgenic rodent mutation assays.</a> Mutat. Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guideline+for+the+testing+of+chemicals%3A+Transgenic+rodent+somatic+and+germ+cell+gene+mutation+assays%22">OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays</a>. , (2011).</li>
<li>Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testes+weight+reflect+ethylnitrosourea+induced+histopathology+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice.</a> Toxicol. Lett. 17 (1-2), 77-80 (1983).</li>
<li>Russell, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+male+germ-cell+stage+on+the+frequency%2C+nature%2C+and+spectrum+of+induced+specific-locus+mutations+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse.</a> Genetica. 122 (1), 25-36 (2004).</li>
<li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+sperm+and+artificial+insemination+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting sperm and artificial insemination of mice.</a> J. Vis. Exp. (3), 184(2007).</li>
<li>Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+galactose-sensitive+E.+coli+strains+as+selective+hosts+for+LacZ-+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids.</a> Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254(1992).</li>
<li>Lemieux, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+benzo%5Ba%5Dpyrene-induced+pig-a+and+lacZ+mutations%2C+micronuclei+and+DNA+adducts+in+muta+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse.</a> Environ. Mol. Mutagen. 52 (9), 756-765 (2011).</li>
<li>Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+molecular+characteristics+of+mutations+induced+by+ethylnitrosourea+in+germ+cells+isolated+from+seminiferous+tubules+and+in+spermatozoa+of+lacZ+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (16), 7485-7489 (1995).</li>
<li>Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose--response+curve+for+ethylnitrosourea-induced+specific-locus+mutations+in+mouse+spermatogonia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dose--response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (11), 3589-3591 (1982).</li>
<li>Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cII+locus+in+the+MutaMouse+system%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">The cII locus in the MutaMouse system.</a> Environ. Mol. Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).</li>
<li>Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+induced+male+germline+mutation%3A+Correlations+and+comparisons+between+traditional+germline+mutation+assays%2C+transgenic+rodent+assays+and+expanded+simple+tandem+repeat+instability+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays.</a> Mutat. Res. 598 (1-2), 164-193 (2006).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

בהשוואה לשיטות מסורתיות, assay המוטציה של תא הנבט TGR מספק אמצעי מהיר יותר, חסכוני יותר, ורגיש יותר לכימות מושרה במוטציות תאי נבט vivo. על ידי הערכת transgene MF ישירות בזרע, בניגוד לצאצאים, מספר בעלי החיים, זמן ומשאבים הדרושים להערכת המוטגניות בתאי המין של כל תרכובת אחת מצטמצמים באופן משמעותי. במונחים של רגישות, שהיינו מסוגלים לזהות גידול משמעותי 2.6 לקפל בתאי גזע spermatogonia MF בעקבות חשיפה לENU / קילוגרם 25 מ&quot;ג רק באמצעות 5 חיות לכל קבוצת מינון. בניגוד לכך, assay המוקד הספציפי לא היה מסוגל לזהות כל שינוי משמעותי בMF באותו מינון זה באמצעות&gt; 3,000 עכברים בקבוצה החשופה ו&gt; 500,000 עכברי שליטה 28. בנוסף להתאמתה לשתי חקירות מכניסטית ורגולציה, שיטה זו מספקת הזדמנות למחקרים השוואתיים בין גופני וmutati שורת הנבטעל שיעורים. הראיות אחרונות עולה כי לכמה סוכני מוטציות תאי נבט יכולות להיגרם בריכוז נמוך מהנדרש למוטציה סומטיים. לדוגמא, חשיפה ממושכת לN-hydroxymethylacrylamide, מטבוליט של acrylamide קרצינוגן מזון 12, מגבירה את תדירות מוטציות תאי נבט קטלניות דומיננטיות בעכברים מבלי להשפיע על תדירות הגרעינון בתאי דם אדומים, מידה מסורתית של תא סומטי נזק ציטוגנטית 13. בנוסף, חשיפה של עכברים לשני תדרי המוטציה גורם עשן טבק הזרם המרכזי והעקיף גבוהים בלוקוסי DNA חוזרים טנדם בזרע במינונים שלא להגדיל את תדירות הגרעינון דם 14. ממצאים אלה קוראים תיגר על ההנחה שבדיקות genotoxicity סומטי היא תמיד הגנה של תאי המין, ולחזק את הביקוש לאמצעים יותר יעיל וחסכוניים לכמת תדירות מוטציה של תא נבט. עם זאת, הראיות לגורמי מוטציות תאי נבט מועדפים היא עדיין חלשות, בעיקר בשל המחסור בנתונים זמינים להשוואת שיעורי מוטציה ברקמות תא סומטי וניבטו. Assay המוטציה TGR מאפשר בדיקה והשוואה של שיעורי מוטציה מושרה ברקמות מרובות משתמשים באותו transgene מקבילים. לפיכך, מוטציה השוואתית בדיקה באמצעות assay TGR יעזור למלא פערי נתונים המקיפים את האפשרות של תופעות תא חיידק מועדפים. הערכה בו זמנית של מוטציה תא סומטי וניבט לבדיקת רגולציה תהיה גם לשפר את היעילות על ידי הקטנת מספר בעלי החיים הדרושים. הקו המנחה OECD למוטציה סומטיים ממליץ זמן ממשל 28 יום, ואחריו זמן של שלושה ימים דגימה (28 + 3). ניתוח של זרע cauda עשוי להציע רגישות עניים בנקודה זו בזמן, שכן הוא מתמקד בתאים שנחשפו בעיקר בשלבי spermatocyte וspermatid יצירת תאי הזרע (איור 3). תאים בשלבים אלה אינם לסנתז DNA ובהדרגה לאבד את היכולת שלהם לתיקון DNA 6 &lt;/ Sup&gt;. יתר על כן, זרע cauda הדגימה בנקודה זו בזמן לא יצליח לזהות מוטציות המתרחשות בתאי spermatogonia וגזע. לפיכך, להשתלבות בעיצוב 28 + 3, הקו המנחה OECD ממליץ איסוף תאי נבט מאבוביות הזרע. אוכלוסייה מעורבת זה מכילה תאים שמקורם בסינתזה של DNA וסוגי תאי תיקון מיומן, הכוללים תאי גזע, ונחשפות על פני רוב שלבי זרע ראשוניים. עם זאת, בשל האופי המעורב של תאים אלה, ניתוח תא אבוביות זרע אינו מספק מידע שלב ספציפי. יתר על כן, קיים חשש שנוכחותם של תאים שאינם יעד יכולה להשפיע על MF נצפה (למשל שיחות mutagen תא חיידק חיוביות כוזבות עקב זיהום של תאים סומטיים שעברו מוטציה, או דילול של אות תא חיידק שעבר מוטציה מתאי נבט DNA תיקון לקוי) . כרגע יש מספיק נתונים ללהסיק האם תוצאות מתאי אבוביות זרע ב28 + 3 הצעה אותה רגישות וסגוליותזרע cauda של בנקודות זמן מאוחר יותר. המעבדה שלנו היא משווה כיום MFS המושרה בתאי seminiferous tubules וזרע cauda נאספו לאחר פעמים דגימה שונות כדי לטפל בנקודה זו. נציין כי הקו המנחה OECD מצביע על זמן דגימה חלופי של 28 ימים לרקמות החלוקה לאט כגון הכבד, שעשויה גם להיות מתאים לניתוח תא חיידק. עם זאת, הנתונים זמינים הוא עדיין לא מספיק ואין באפשרותנו כיום להמליץ ​​תכנון ניסוי אחד ואחד לניתוח סימולטני של תאים סומטיים ותאי נבט באמצעות assay המוטציה TGR לבדיקת רגולציה. אחד מאפיינים של assay זה שיש לציין הוא שאירועי מוטאציות מוערכים על transgene שאינו עכברי. עם זאת, יש עדויות רבות לכך שtransgene מגיב לחומרי גורמי מוטציות סביבתיות באופן דומה לגנים אנדוגני 20. בנוסף, מכיוון שמקורותיה המדויקים של אירועי מוטאציות עצמאיים קשיםלפתור, תוצאות הן בדרך כלל כפי שדווחו בתדירות מוטציה (בניגוד לתדירות מוטציה). תדירות המוטציה בפועל יכולה להיפתר אם תוצאות מתוקנות להרחבה משובט (כלומר. החלוקה והכפלה של תא מוטציה יחיד שיכול לתרום לתדירות הנצפית של מוטציות transgene) על ידי רצפי DNA. רצף של transgenes המוטציה ניתן לבצע כדי לאפיין את מוטציות lacZ, ולזהות מוטציות שעשויות לנבוע מאירועי הרחבה משובטים, למרות שזה מוסיף באופן משמעותי לזמן והעלות של הניתוח. בנוסף לגן lacZ, theλgt10 וקטור מהונדס מטפח גן חלופי טמפרטורה תלויה מוטציה-כתב: גרסה של הגן כת&quot;ש λ, שהוא (294 נ&quot;ב לעומת 3021 נ&quot;ב lacZ, איור 1) קצר יותר וקלים יותר לרצף 29. רצף גם מאפשר הניתוח של ספקטרום המוטציה המושרה, מתן תובנה mutatioמנגנון סופי של המתחם בשאלה. דוגמא קיצונית להרחבה משובט היא ההתרחשות של מוטציה &quot;קופה&quot; (כלומר., מוטציות transgene בשלב מאוד מוקדם של הפיתוח של איבר שתורמות לMF באופן דרמטי גבוה, לעתים מאות עד אלפי פעמים יותר מאשר ברקע). בעלי חיים או רקמות עם מוטציה &quot;קופה&quot; יש להסיר מהניתוח. Assay שתארנו הוא רחב החלים על מודלים TGR אחרים כגון עכבר BigBlue וחולדה, ועכבר פלסמיד lacZ, אשר כולם נמל וקטורים דומים כתב מוטציה (שנסקרו ב20). רובם המכריע של מחקרי תאי נבט שנערכו עד כה, כי שימוש בשיטות דומות התמקדו גורמי מוטציות מאופיינות כמעט באופן בלעדי על גם כמו ENU וקרינה (שנסקרה ב30). צפוי כי עם שחרורו האחרון של הקו המנחה מבחן OECD לassay TGR, assay זה יהיהפופולרי יותר ויותר להקרנה כימית והערכת רגולציה. התאגדות של assay המוטציה של התא הנבט TGR לסוללת בדיקת רגולציה תהיה למלא את הפער הקיים על ידי התרת הערכה יעילה של אינדוקציה מוטציה בתאי נבט 11. יתר על כן, assay זה יכול לשמש כדי למדוד MF כמעט בכל רקמות, מתן אמצעים מתאימים להשוואת הרגישויות היחסית של תאים סומטיים ותאי נבט לאינדוקציה של מוטציות על ידי סוכנים סביבתיים בנקודתי קצה גנטיות זהות.

מוטציות בדנ&quot;א סדירות בתאי המין יכולים להוביל להצלחה ברבייה מופחתת, ואם ירשו, עלול לגרום למחלה גנטית או נטייה מוגברת לסרטן אצל צאצאיהם 1-3. ראיות משמעותיות מוכיחות כי חלק גדול ממוטציות דה נובו בירושה מתאי המין מצד אבי 4, וכי מספר המוטציות בצאצאים מתואם חיובי עם גיל אב בעת ההפריה 5. השיעור גבוה יותר של מוטציות זכר הוא האמין להיות תוצאה של ההבדל בגיל בgametogenesis בין המינים, בהגדלת מספר חלוקות תא זרע ראשוניות בהשוואה למספר חלוקות תא oogenic בנקבה בתאי המין 2, וירידה הדרגתית בדנ&quot;א לתקן יעילות עם גיל אצל גברים. כל הגורמים הללו תורמים להסתברות מוגברת של טעויות שכפול בתאי המין הזכריים 6. עם זאת, ההשפעה של חשיפה אבהית לEnviroגורמי nmental בתדירות של מוטציות דה נובו נשאר לא ברורים. עם זאת, מספר גדול של גורמים סביבתיים ידוע כדי לגרום למוטציות תאי נבט במכרסמים 7, ויש ראיות גוברים שחלק מהסוכנים אלה יכול להשפיע גם על תאי המין האנושיים 8. למרות חששות אלה, כימיקלים נבדקים באופן שיגרתי ביכולתם לגרום למוטציות בתאים סומטיים למטרות תקינות והמקובל להניח שבדיקות סומטי יש בם כדי להגן על תאי המין. לכן, כימיקלים רק לעתים רחוקות העריכו ביכולתם לגרום למוטציות תאי נבט. בדיקות המוטגניות תאי נבט אחת סיבות הושמטו במידה רבה מתהליך קבלת החלטות רגולטוריות הוא חוסר מתודולוגיות מעשיות. שיטות מסורתיות המבוסס על מכרסמים, כגון קטלני 9 וספציפיות לוקוס 10 בדיקות הדומיננטיות, להעריך שיעורי מוטציה תא חיידק על ידי הבקיע פנוטיפים מוטציה בעוברים או צאצאים שלהורים נחשפו. מבחני אלו דורשים שימוש במספר גדול מאוד של בעלי חיים, זמן ומשאבים כדי לרכוש תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית. למרות מספר שיטות המודרניות לכימות מוטציה תא החיידק צמחו לאחרונה, רבים סובלים חסרונות במונחים של פרקטיות שלהם, יעילות, ואת הרלוונטיות ביולוגיות. לדוגמא, לחזור על מוטציות אורך בחוזרים בד בבד פשוט לוקוסים מורחבים (Estr) ניתן לכמת בתאי נבט גבריים תוך שימוש בגישה PCR מולקולה בודדת 15. עם זאת, ביצוע של שיטה זו יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית ומייגע, ושלא כמו מוטציות נקודה, המשמעות הביולוגית ובריאותם של שינויים באורך חוזר של לוקוסי Estr מאוד לא יציבים תישאר 16 לא ברורים. טכנולוגיות רצף הגנום כולו מודרניות יכולות לספק שפע של נתונים משמעותיים מבחינה ביולוגית כאשר חלים על הבעיה של מוטציות תורשתיות 4,17, אבל העלות הגבוהה, שיעורי שגיאה גבוהים, האימות הקשורים נדרשותכדי לאשר את המוטציות, ואתגרים ביואינפורמטיקה עדיין להגביל את היישום השגרתי של אפשרות זו ביכולת בדיקת רגולציה 18. בזאת, אנו מתארים שיטה מעשית לכימות מוטציות הנגרמות באופן ישיר בתאי הנבט של עכברי זכרים מהונדסים. פרוטוקול זה מתואר למודל MutaMouse המהונדס, שבו יש עותקים בשרשור מרובים של וקטור הפאג λgt10 רקומביננטי המכיל גן כתב Escherichia coli lacZ שולב שני העותקים של כרומוזום 3 19 (איור 1). פרוטוקול זה הוא רלוונטי גם למכרסמים מהונדסים דגמים אחרים (TGR) המבוססים על אותם העקרונות (BigBlue עכבר וחולדה, או עכבר פלסמיד lacZ, וכו &#39;.) או גני כתב מעט שונים (עכבר דלתא GPT ועכברוש, מודלים TGR נסקרו בet למברט אל. 20). שיטה זו מבוססת על assay המוטציה TGR המתואר שבפורסם לאחרונהומתוקן קו מנחה מבחן OECD 21 ואנו לפרט על השיקולים המיוחדים הנדרשים כדי להתאים הערכה של מוטציות בתאי המין הגבריים בגלל המאפיינים הייחודיים של יצירת תאי זרע. בקצרה, assay כרוך בחשיפת עכברים הטרנסגניים זכר לחומר mutagenic, ואחריו זמן דגימה שבו נגעים טרום מוטאציות קבועות למוטציות יציבים. בזמן הדגימה נבחר, עכברים מורדמים ותאי נבט נאספים משתי יותרת האשך cauda או אבוביות זרע. כפי שנראה להלן, השפעות mutagenic בשלבים שונים של יצירת תאי זרע ניתן לקבוע על ידי בחירת הזמן בין החשיפה ואיסוף דגימה. מוסיף מהונדס, הכוללים מספר עותקים של הגנום הפאג λ לכל תא, מבודדים מהדנ&quot;א הגנומי תא חיידק וארוז לתוך capsids הריק λ הפאג יצירת חלקיקי הפאג λ זיהומיות המשמשים לאחר מכן להדביק E. מארח coli. החיידקים הנגועים גדלים על אין תמיכה בבחירהתקשורת מופרזת שיכול להבחין בין תאים המכילים וקטור עם העתק שעבר מוטציה של lacZ מתאי מחסה lacZ wild-type. השפעת mutagenic של חשיפה בתאי המין הזכרי נקבעת על ידי השוואת התדירות של transgenes מוטציה בין שליטה ועכברים שטופלו (איור 2, שנסקר בלמברט et al. 20). מספר גדול של תאי נבט יכול להיות assayed מעכבר אחת, נותן רגישות מעולה assay זה על פני שיטות מסורתיות, תוך צמצום מספר בעלי החיים הדרושים. ובגלל שאין ציוד או הכשרה מיוחד נדרש, assay זה מספק אפשרות מעשית ויעילה לבדיקת המוטציה של תא הנבט ברוב מעבדות ביולוגיה המודרניות טוקסיקולוגיה / מולקולריות. דרישה הכרחית אחת ליישום האפקטיבי של assay המוטציה של תא הנבט TGR היא הבנה של מחזור הזרע הראשוני (איור 3). הזמן לתאי נבט עכבר כדי להתקדם מstתאים אותם באבוביות הזרע לspermatogonia, spermatocytes, spermatids, ולבסוף להתבגר זרע ביותרת האשך (כלומר. יצירת תאי זרע) היא כ 49 ימים. מוטציה יכולה להתרחש בשלבים שונים של המחזור הזה והוא לעתים קרובות ספציפי מתחם. שתי תכונות עיקריות שהם רלוונטיים במיוחד לmutagenesis בתאי נבט גבריים הן הפסקת סינתזת DNA במהלך מיוזה המוקדמת, והאובדן ההדרגתי של יכולת תיקון DNA 6 בהודעה מיוזה-המאוחרת, שני תהליכים הנדרשים לאינדוקציה והקיבוע של רוב המוטציות. בגלל המאפיינים הייחודיים אלה של יצירת תאי זרע, יש שלושה משתנים ניסיוניים קריטיים להתנהלות של assay המוטציה של תא הנבט TGR: (1) זמן ממשל מתחם בדיקה; זמן הדגימה (2); ו (3) הבחירה של אוכלוסיית תאי נבט לאסוף לניתוח (איור 3 ולוח 1). זמן מנהל הוא experimeמשתנה פתיחות opening סגירות closures שקובעת כמה תאי יעד ארוכים נחשפים לתרכובות הבדיקה. גם אורכו של זמן הממשל יכול לשמש יעד חשיפות לסוגי תאים ספציפיים או שלבים של יצירת תאי זרע. לדוגמא, ממשל יום אחד יכול לשמש כדי לקבוע את ההשפעות של חשיפה אקוטית לסוג תא מסוים אחד. בדומה לכך, חשיפה יכולה להיות ממוקדת לשלב זרע ראשוני כל, למשל על ידי פגיעת spermatocytes רק חלוקת meiotically, או mitotically חלוקת spermatogonia באמצעות זמן ממשל 2 בשבוע וזמן דגימה מתאים. פעמים כרוניות ותת כרוניות ממשל משמשות כדי להעריך את ההשפעות של חשיפה לטווח ארוכה, על מנת להבטיח הפצה הפרמקוקינטי מספקת של מתחם הבדיקה, או לאפשר להצטברות מספקת של מוטציות מחומרי גורמי מוטציות חלשות (לדוגמא זמן ממשל 28 יום מומלץ במבחן OECD קו מנחה). זמן דגימה הוא משתנה הקריטי לקביעה שבשלב של יצירת תאי זרע תאי המטרה היו בעת החשיפה. זמן הדגימה מכתיב כמה זמן, ולכן איך התקדם הרבה יותר במחזור הזרע הראשוני, תאים עוברים דרך לאחר החשיפה. לדוגמא, כדי לחקור תופעות בspermatogonia תאי גזע, זמן דגימה&gt; 49 ימים נדרשים אם איסוף זרע הבשיל באופן מלא, או&gt; 42 ימים אם איסוף תאי נבט לא בוגרים מאבוביות הזרע, על מנת להבטיח כי יש לו את כל התאים שנאספו מספיק זמן כדי לפתח מנחשף נובע תאים. חשוב לציין כי זמן דגימה של לפחות 70 ימים יהיה עדיף להפגין השפעת תאי גזע אמיתית כדי לספק מספיק זמן להפצה הפרמקוקינטי של toxicant, לחיסול התאים שנחשפו בשלבים מאוחר יותר של יצירת תאי זרע, ולתת דין וחשבון ל תקופה של עקרות זמניות שעלולים להתרחש ~ 6 שבועות לאחר חשיפה לתרכובות mutagenic מאוד 22. באופן דומה, זמן דגימה של 21 ימים יבטיח כי Colle הזרעcted מיותרת אשך cauda היה רק ​​השלים מיוזה ביום האחרון של חשיפה. ניתן לאסוף תאי נבט כזרע בוגר מיותרת אשך cauda, ​​או כתערובת של סוגי תאי זרע ראשוניים שונים מאבוביות הזרע. זרע למבוגרים להישאר בcauda ל~ 3 ימים, כך שניתן לקבוע ברמת דיוק יחסי סוג התא או שלב של יצירת תאי זרע שממנו הזרע מקורו לכל עיצוב ניסיוני נתון. לפיכך, ניתוח של היתרי זרע cauda ממוקד חקירות של השפעות מוטציה בשלב מסוים. מצד השני, השעיות תא שנאספו מאבוביות הזרע מכילות תערובת של סוגי תאי נבט שונים בשלבים שונים של פיתוח, ובכך להציע רזולוציה עניות יותר של שלב הזרע הראשוני שבמוטציות מקורו. בנוסף, השעיות תא התאוששו מאבוביות הזרע נוטות להכיל ייצוג יתר של spermatids, ואחריו spermatocytes, וverכמה spermatogonia y ותאי גזע (פרופורציות אלה מיוצגות על ידי פסים לבנים סיימו באיור 3). יתר על כן, השעיות הוכנו מאבוביות הזרע עשויות להכיל גם תאים סומטיים שונים. כך, משום שסוגי תאים רבים כל כך נמצאים, יכולות להיות מושפעות השפעות מוטאציות על ידי מגוון רחב של תאים שאינם יעד. עם זאת, איסוף דגימות מאבוביות זרע מציע אפשרות חסכונית לבו זמנית הקרנת סוגים שונים של תא הנבט, ושילוב קל של ניתוח תא חיידק לפרוטוקול בדיקת OECD הסטנדרטי למוטציה סומטיים. לחזור ולהדגיש, בהתאם לצרכים של החוקר, זמן ממשל, זמן דגימה ואוכלוסיית תאים שנאספו יכול להיות מותאם לחקור את ההשפעות של חשיפה בסוגי תאים שונים ובשלבים שונים של תהליך יצור תאי זרע. על ידי הבחירה בזהירות משתנה אלה, יכולים להיות מתוכננים ניסויים למחקרים מכניסטית ממוקדים, או לבדיקת רגולציה כללית יותרing מטרות. כדי להשיג בקיאות בassay, אנו ממליצים על השימוש בנטילה דרך פה חריף של 100 מ&quot;ג / קילוגרם N-אתיל-N-nitrosourea (ENU), ואחריו 70 יום זמן דגימת בקרה חיובית כ. ניתוח של זרע cauda כך מטרות תאי גזע spermatogonial (איור 3), אשר בדרך כלל מציגים עלייה של פי 4-5 בתדירות מוטציה (MF) על הפקדים הבאים מינון mutagenic הזה מאוד של ENU. יש לציין כי מינון זה ידוע לגרום 6 שבועות עקרות לפרסם חשיפה, ובכך זה לא יכול להיות מנת שליטה מתאימה לזמני דגימה קצרים יותר. מינון זה יהיה גם לייצר גידול לזיהוי בMF ברוב הרקמות סומטיות 20. תוצאות הנציג המובאות להלן נוצרו בעקבות משטר חשיפה אקוטי +70 באמצעות שלוש מנות של ENU עד וכולל 100 מ&quot;ג / קילוגרם.

<table><tbody><tr><td>MutaMouse</td><td>Covance</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (lacZ-/galE-)</td><td>Covance-ראה</td><td></td> <td>הפניה 25 בכתב היד</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Caledon</td><td>3001-2-40</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate-buffered salt (D-PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), 0.5 מ', pH 8</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>03690 FLUKA</td><td></td></tr><tr><td>איזואמיל אלכוהול</td><td>קלדון</td><td>2/10/7900</td><td></td></tr><tr><td>בסיס מרק לנון LB</td><td>Invitrogen</td><td>12780-029</td><td></td></tr><tr><td>מסנן רשת נירוסטה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3770</td><td></td></tr><tr><td>תמצית אריזה Transpack</td><td>Agilent Technologies</td><td>200220</td><td></td></tr><tr><td>&בטא;-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול אתילי, נטול מים (EtOH)</td><td>אלכוהול מסחרי-אמפיצילין</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ג'יבקו</td><td>11593-027</td><td>הכינו 20 מ"ג/מ"ל ב-dH2O</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Gibco</td><td>11815-024</td><td>הכינו 5 מ"ג/מ"ל ב-dH2O</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Invitrogen</td><td>15509-097</td><td>רווי ב-0.1 M Tris-HCl לפי הוראות היצרן</td></tr><tr><td>Phenyl-&beta;-D-galactopyranoside (P-Gal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6501</td><td>ממיסים 3 גרם לכל 10 מ"ל של דימתילפורממיד</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>25530-031</td><td>מכינים תמיסה של 60 מ"ג/מ"ל dH2O ממש לפני השימוש, 20 ומיקרו; l לכל דגימה</td></tr><tr><td>נתרן אצטט (NaAc)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP333-500</td><td>מכינים 3 M תמיסה, pH 5.2</td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td>מכינים תמיסה של 10% ב-dH2O</td></tr><tr><td>1 M MgSO4</td><td></td><td></td><td>24.6 גרם MgSO4&middot; 7H2O לכל 100 מ"ל dH2O, חיטוי, יש לאחסן בטמפרטורת החדר עד שנה</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td></td><td></td><td>5.0 גרם LB בסיס, 6.4 גרם NaCl לכל 1 ליטר dH2O. חיטוי</td></tr><tr><td>וקריר נתרן ציטראט מלוח (SSC)</td><td></td><td></td><td>150 מ"מ NaCl, 15 מ"מ טריסודיום ציטראט, pH 7.0&nbsp;</td></tr><tr><td>SM Buffer</td><td></td><td></td><td>5.8 גרם NaCl, 2.0 גרם MgSO4&middot; 7H2O, 50 מ"ל 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 מ"ל ג'לטין (2% w/v), לכל 1 ליטר dH2O, חיטוי, יש לאחסן בטמפרטורת החדר עד שנה</td></tr><tr><td>מאגר</td><td></td><td></td> TE <td>10 מ"מ Tris, 1 מ"מ EDTA, pH 8</td></tr></tbody></table>

המהונדס מכרסמים assay עבור תדר mutant תאי ניבט זכר כימות

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

מוטציות דה נובו מתעוררות בעיקר בקו הנבט הזכרי ועלולות לתרום לתוצאות בריאותיות שליליות בדורות הבאים. שיטות מסורתיות להערכת השראת מוטציות בתאי נבט דורשות שימוש במספר רב של בעלי חיים, מה שהופך אותן לבלתי מעשיות. ככזה, מוטגניות של תאי נבט מוערכת לעתים רחוקות במהלך בדיקות כימיות והערכת סיכונים. כאן, אנו מתארים בדיקת מוטציה של תאי נבט זכריים in vivo באמצעות מודל מכרסמים טרנסגני המבוסס על הנחיות בדיקה של הארגון לשיתוף פעולה ופיתוח כלכלי (OECD) שאושרו לאחרונה. שיטה זו משתמשת במבחן ברירה חיובית במבחנה כדי למדוד מוטציות in vivo המושרות בווקטור λgt10 טרנסגני הנושא גן מדווח ישירות בתאי הנבט של זכרים שנחשפו. עוד מתארים כיצד ניתן להשתמש באיתור מוטציות בטרנסגן המוחזר מתאי נבט כדי לאפיין את הרגישות הספציפית לשלב של סוגי התאים הזרעונים השונים לחשיפה למוטגן על ידי בקרה על שלושה פרמטרים ניסיוניים: משך החשיפה (זמן מתן הטיפול), הזמן בין החשיפה לאיסוף הדגימה (זמן הדגימה) ואוכלוסיית התאים שנאספה לניתוח. מכיוון שניתן לבחון מספר רב של תאי נבט מזכר בודד, לשיטה זו יש רגישות גבוהה יותר בהשוואה לשיטות מסורתיות, דורשת פחות בעלי חיים ולכן הרבה פחות זמן ומשאבים.

עם ספירת פלאק ממוצעת של 200,000 לוחות לכל בעל חיים, אנו בדרך כלל לצפות MF רקע ממוצע של כ 2.8 x 10 -5 בתאי נבט גבריים עם סטיית תקן של 1.7 x 10 -5 בקבוצות הביקורת שלנו (המבוסס על נתונים משמונה עצמאיים ניסויים). עם ספירה זו פלאק, רמת רקע ושונות, קבוצות מינון עם n = 5 חיות כל יש בם כדי לזהות עלייה של 2 קיפול בMF עם כוח&gt; 0.8. תוצאות מדווחות בדרך כלל בפורמטים טבלאיים או גרפיים. לוח 2 ואיור 6 מראים תוצאות נציג מזרע cauda של זכרים MutaMouse (n = 5 לכל קבוצה) שנחשף למנה אחת חריפה אוראלית של 0, 25, 50, ו100 מ&quot;ג / קילוגרם N-אתיל-N-nitrosourea (ENU) ואחריו זמן דגימה 70 יום. תקופת 70 יום זה מאפשרת המדידה של אירועי מוטאציות שהתרחשו בזרע שהיו בתאי גזע spermatogonial בעת החשיפה (איור 3). צפיפויות לוחית טיפוסיות על צלחות מוטציה וכיילו מוצגות באיור 7. כפי שמתוארות בטבלה 2 ואיור 6, חשיפת ENU חריפה הנגרמת עלייה תלוית מינון משמעותית בMF של תאי גזע spermatogonial. המינון הנמוך מושרה עלייה משמעותית 2.6 לקפל מעל פקדים, שהייתה לי MF בסיסי של 2.6 x 10 -5. אינדוקציה המרבית התרחשה במינון הגבוה, שהושר על גידול של פי 4.4 על פקדים. ניתן למצוא דוגמא של assay זה מבוצע על תאי נבט אבובית seminiferous בדאגלס et al. 27, שבו MF נקבע בתאי נבט אבובית במרווחי זמן שונים הבאים זריקת intraperitoneal חוזרת 5 יום 50 מ&quot;ג / קילוגרם ENU. במחקר ש, תדרי מוטציה בתאי seminiferous גדלו עד 15 ימים לאחר טיפול ונשארו קבוע לאחר מכן. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr tr=""><td> אקספומשטר בטוח </td><td> רקמה שנאספה </td><td> סוג תא שנאסף (תא מטרה) </td><td> שלב של תא המטרה בתחילת החשיפה </td><td> שלבים עברו במהלך חשיפה </td></tr><tr><td> חריף + 70 </td><td> Cauda </td><td> זרע למבוגרים </td><td> תאי גזע </td><td> תאי גזע </td></tr><tr><td> 14 + 21 </td><td> Cauda </td><td> זרע למבוגרים </td><td> Spermatogonia </td><td> Spermatid </td></tr><tr><td> 14 + 35 </td><td> Cauda </td><td> זרע למבוגרים </td><td> תאי גזע </td><td> Spermatocyte </td></tr><tr><td> 28 + 3 </td><td> Cauda </td><td> זרע למבוגרים </td><td> Spermatocyte </td><td> Spermatocyte Spermatid זרע למבוגרים </td></tr><tr><td></td><td> קשיות </td><td> תאי גזע </td><td> תאי גזע </td><td> תאי גזע </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatogonia </td><td> Spermatogonia </td><td> Spermatogonia </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatocyte </td><td></td><td> Spermatocyte </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatid </td><td></td><td> Spermatid </td></tr><tr><td> 28 + 49 </td><td> Cauda </td><td> זרע למבוגרים </td><td> cel גזע </td><td> תאי גזע </td></tr><tr><td></td><td> קשיות </td><td> תאי גזע Spermatogonia Spermatocyte Spermatid </td><td> תאי גזע </td><td> תאי גזע </td></tr></tbody></table> טבלת 1 סוגים סלולריים ושלבים של יצירת תאי זרע שממוקדים על ידי assay המוטציה מכרסם המהונדס על ידי עיצובים ניסיוניים שונים. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> קבוצת המינון </td><td> # בעלי חיים </td><td> המוטציה PFU </td><td> סה&quot;כ PFU </td><td> MF (x10 -5) </td><td> ממוצע MF (x 10 -5) </td><td> שינוי של פי </td><td> p-value </td></tr><tr><td> בקרה </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 180,245 </td><td> 2.8 </td><td> 2.6 </td><td> 1.0 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 137,835 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3 </td><td> 11 </td><td> 385,672 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> 431,396 </td><td> 0.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 152,413 </td><td> 3.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 25 מ&quot;ג / קילוגרם </td><td> 6 </td><td> 17 </td><td> 162,353 </td><td> 10.5 </td><td> 6.9 </td><td> 2.6 </td><td> 0.0002 </td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td> 14 </td><td> 150,094 </td><td> 9.3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 154,401 </td><td> 2.6 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 9 </td><td> 9 </td><td> 154,401 </td><td> 5.8 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 </td><td> 12 </td><td> 196,978 </td><td> 6.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ג / קילוגרם </td><td> 11 </td><td> 17 </td><td> 155,727 </td><td> 10.9 </td><td> 9.3 </td><td> 3.6 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td></td><td> 12 </td><td> 11 </td><td> 135,847 </td><td> 8.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 13 </td><td> 25 </td><td> 193,499 </td><td> 12.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 14 </td><td> 12 </td><td> 133,859 &lt;/ Td&gt; <td> 9.0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 15 </td><td> 14 </td><td> 252,807 </td><td> 5.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100 מ&quot;ג / קילוגרם </td><td> 16 </td><td> 26 </td><td> 170,968 </td><td> 15.2 </td><td> 11.5 </td><td> 4.4 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td></td><td> 17 </td><td> 28 </td><td> 234,584 </td><td> 11.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 18 </td><td> 10 </td><td> 145,289 </td><td> 6.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 19 </td><td> 35 </td><td> 292,236 </td><td> 12.0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20 </td><td> 22 </td><td> 190,848 </td><td> 11.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> לוח 2: תדירות המוטציה lacZ בזרע cauda של מ &#39;גברים מהונדסיםקרח נחשף בחריפות לENU כשהיו תאי spermatogonial גזע (זמן = יום 1 ממשל, זמן דגימה = 70 ימים). PFU = יחידת יצירת פלאק, MF = תדירות מוטציה. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig1highres.jpg" /> איור 1 ייצוג סכמטי של מבנה הפאג λgt10. <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig2highres.jpg" /> איור 2 מתאר של assay המוטציה תא החיידק מכרסם המהונדס. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" /> איור 3 תרשים סכמטי של תהליך יצור תאי זרע בעכבר וסוגי התאים וPHAs<html> es שממוקדים על ידי assay המוטציה מכרסם המהונדס על ידי עיצובים ניסיוניים שונים הערה:. ברים הלבנים סיימו מייצגים את חלקם היחסי של סוגי תאים קיימים בהשעיות תא שהוכנו מאבוביות הזרע (כלומר spermatids&gt; spermatocytes&gt;&gt; תאי גזע spermatogonia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig4highres.jpg" /> איור 4 אוסף של יותרת האשך cauda העכבר. ) עושה חתך בבטן לכיוון שק אשכים. B) זהה את epididymal שומן כרית. C) משוך בעדינות את כרית השומן כדי להוציא את האשכים ויותרת האשך. D) אתר, ולהסיר את יותרת האשך cauda. ss = &quot;jove_content&quot; FO: לשמור-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 5" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig5highres.jpg" /> איור 5 הכנת ההשעיה של תאי נבט מאבוביות הזרע. ) מבצעת חתך בכמוסת האפיתל של האשך, חושף אבוביות הזרע. B) אבוביות הזרע הם סחט של הקפסולה. C) רולר רקמות עובר בעדינות על הצינוריות בזווית של 5-10 מעלות ל לשחרר את תאי נבט הכלול בתוך. D) ההשעיה תא החיידק נאסף לעיבוד נוסף. <img alt="איור 6" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig6highres.jpg" /> איור 6 ייצוג גרפי של תדירות המוטציה lacZ בזרע MutaMouse נחשף בחריפות כתאי גזע לENU (n = 5). כלמשולש מייצג את MF של חיה אחת. * p &lt;0.05 כפי שנקבע על ידי רגרסיה פואסון. <img alt="איור 7" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig7highres.jpg" /> איור 7 צלחות אגר נציג מassay המוטציה המכרסם המהונדס עם שלטים נוצרו על דשא של א &#39; חיידקי מארח coli. ) הצלחות &quot;המוטציה&quot; תהיה לי מעט מאוד לוחות (מסומנים בחיצים), במיוחד בקבוצות מינון שליטה, אשר יהיו מעת לעת אפס שלטים על כמה צלחות. B) הצלחות &quot;כייל&quot; יכולות להיות מאות שלטים.

מוטציות De novo בקו הנבט הזכרי עשויות לתרום לתוצאות בריאותיות שליליות בדורות הבאים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לשימוש במודל מכרסמים טרנסגני לכימות מוטציות בתאי נבט זכריים המושרות על ידי גורמים סביבתיים.

המהונדס מכרסמים Assay עבור תדר Mutant תאי ניבט זכר כימות

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד את שכיחות המוטציות המושרות בגן דגל (reporter gene) שחולץ מתאי הנבט של עכברים זכרים טרנסגניים, לאחר חשיפה למוטגן כימי או פיזי. דבר זה מושג תחילה על ידי חשיפת עכברים זכרים לחומר החשוד כגורם למוטציות בתאי הנבט. השלב השני הוא איסוף תאי הנבט לאחר שהתקדמו דרך השלבים הרצויים של הספרמטוגנזה.בשלב הבא, ה-DNA המכיל את הטרנסגן המדווח על המוטציה מופק מתאי הרבייה. השלב הסופי הוא אריזה של הגנים המדווחים שהופקו לתוך חלקיקי פאג' למבדה. לבסוף, נעשה שימוש במבחן ברירה חיובית in vitro כדי למדוד את הפרופורציה של הגנים המדווחים שהופקו מתאי הרבייה שעברו מוטציה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מבחן הלוקוס הספציפי או מבחן ה-domino little, הוא שהמוטציות נמדדות ישירות בתאי הנבט, בניגוד להערכה של צאצאים מוטנטיים. ניתן לבחון מספר רב של תאי נבט מזכר בודד, מה שמשפר את רגישות הבדיקה בהשוואה לשיטות מסורתיות, ובמקביל מפחית באופן דרמטי את כמות משאבי בעלי החיים ואת הזמן הנדרש. שיטה זו יכולה לתת מענה לסוגיות מרכזיות בתחומי הרעילות הגנטית והמוטגנזה, כגון זיהוי חומרים המעוררים מוטציות בתאי נבט והבנת מנגנוני הפעולה שלהם.אף על פי שאנו מתארים את השיטה עבור מודל העכבר Muta, ניתן להחילה אותה בקלות על מערכות מכרסמים טרנסגניות אחרות הנושאות וקטורים לדיווח על מוטציות של בקטריופאג'. יתרה מכך, בעוד שהשיטה מתארת את התהליך עבור תאי נבט זכריים, יש לה יישומיות כללית לרקמות סומטיות, ובאופן משמעותי, היא מכוסה על ידי הנחיית בדיקה מהרמונית בינלאומית שפורסמה על ידי ה-OECD. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקלו בקושי בניהול התזמון של החלק ה-in vitro של הבדיקה, מכיוון שמספר מהשלבים כוללים תקופות המתנה ממושכות.יש לתכנן ולתאם את השלבים בקפידה כדי להשלים שיטה זו בלוחות הזמנים הרלוונטיים. את הפרוצדורה ידגימו הביולוגים ג'ון גינגריך ולינדה סופר מהמעבדה שלי לפני תחילת הניסוי. יש לבחור שלושה משתנים ניסויים קריטיים: זמן המתן, זמן הדגימה ואוכלוסיית תאי הנבט שנאספה.ניתן להתאים משתנים אלו כדי לבחון את השפעות החשיפה בסוגים שונים של תאי נבט ובשלבים שונים של הספירמטוגנזה. כדי להתחיל בהליך זה, חלק באופן אקראי עכברים זכרים טרנסגניים בני שמונה עד 12 שבועות לקבוצת ביקורת ולקבוצות טיפול, עם מינימום של חמישה עכברים לכל קבוצה. לאחר מכן, טפל בעכברים בתרכובת הבדיקה ובביקורת רלוונטית באמצעות נתיב חשיפה מתאים למשך זמן המתן שנבחר.בשלב הבא, בחרו את זמן הדגימה המתאים בהתאם לסוג תאי המטאגנום של הפרספרמה שבו אתם מעוניינים. לאחר הגעת זמן הדגימה, בצעו המתה לעכברים באמצעות פריקה של חוטרי הצוואר תחת הרדמה של isof fluorine. כדי להוציא את האשכים, בצעו חתך בבטן ואתרו את כרית השומן האפידרמלית.משכו בזהירות את רקמת השומן כדי להוציא את האשכים ואתB epididymis משק השכים. לאחר מכן, הסִירו את ה-cauda epididymis. הקפיאו את ה-cauda epididymis בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.כאשר תהיה מוכן לעבד את זרע ה-Cota, הפשר את ה-epididymus של ה-Cota על קרח ולאחר מכן העבר את ה-cota שהופשרה לצלוחית פטרי. לאחר מכן, השתמש בסקאלפל או בסכין גילוח כדי לקצוץ ביסודיות את ה-Epididymus של ה-coda. פפטא 700 µL של DPBS בטמפרטורת החדר אל צלוחית הפטרי. לאחר מכן, השתמש בקצה פפטה של 1000 µL בעל פתח רחב כדי לשחרר את הזרע מה-coda על ידי שאיבה ושחרור של התוךה כ-10 פעמים, או עד שה-DPBS יהפוך עכור מהזרע. סנן את תרחיף הזרע דרך מסנן רשת מפלדת אל-חלד אל תוך מבחנה נקייה של 1.5 mL, ולאחר מכן סבב את המבחנה בצנטריפוגה ב-11,000 ×g למשך שלוש דקות.שפכו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מהמבחנה מבלי להשפיע על המשקע. לאחר מכן, הוסיפו 1 mL של תמיסת נתרב citrate עם מלח (saline sodium citrate) בריכוז 1x קרה, וערבבו במכשיר vortex עד להסעה מלאה של המשקע. לאחר מכן, הוסיפו למבחנה 15 µL של 10% SDS ונערה את המבחנה בעוצמה במשך 30 שניות כדי להפר את התאים שאינם תאי זרע.לאחר מכן, סבבו את המבחנה בצנטריפוגה ב-11,000 ×g למשך שתי דקות. לאחר הסבוב, שפכו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) מהמבחנה, הוסיפו 940 µL של 0.2 x cold saline sodium citrate, וערבבו שוב במכשיר vortex עד להסעה מחדש (resuspension) של המשקע. הוסיפו 120 µL A beta mer capto ethanol, 100 µL של 10% SDS, 20 µL של 0.5 M EDTA pH 8 ו-20 µL של 60 mg/mL.הוסיפו Proteinase K לזרע שהושעה. ערבבו היטב את התמיסה ולאחר מכן הניחו את המבחנה על רוטטור למשך לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius לעיכול. לאחר העיכול למשך לילה, חלצו את ה-DNA מהזרע באמצעות ביצוע השלבים המתוארים בפרוטוקול הטקסט לביצוע מיצוי פנול-כלורופורם.המס את משקע ה-DNA ב-40 עד 100 µL של תמיסת tris EDTA buffer pH 8 ואחסן בטמפרטורה של 4 °C. המתן מספר ימים עד להמסה מלאה של ה-DNA לפני המעבר לשלב הבא ביום העבודה. לפני ביצוע בדיקת מוטציות LAX Z, הכן ועקר באוטוקלאב כמות מספיקה של bottom auger עבור מספר הדגימות המעובדות.לאחר מכן, מזגו באופן אספטי את האגר לצלחות פטרי בני 90 מילימטר ואפשרו לאגר להתמצק במבחנה של 50 מיליליטר. הוסיפו 10 מיליליטר של מצע LB, 100 מיקרוליטר של תמיסת מלטוז 20%, 25 מיקרוליטר של אמפיצילין בריכוז 20 milligrams per milliliter, ו-20 מיקרוליטר של קנמיצין בריכוז five milligrams per milliliter. לאחר מכן, זרעו במבחנה את חיידקי e coli מסוג LAX Z negative GAL e negative, וגדלו בן לילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius תוךما ניעור ב-240 RPM. ביום הראשון של הבדיקה, בצעו תת-תרבית לתאים על ידי הכנת דילול של 1:100 של תרבית הלילה במצע LB טרי ללא אנטיביוטיקה.דגרו את התרבית בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור ב-240 RPM למשך כשלוש שעות או עד שערך ה-OD 600 יהיה שווה לאחד. ברגע שערך ה-OD 600 מגיע לאחד, חלקו את תרחיף התאים באופן שווה למבחנות של 50 ml וסבבו במערך צנטריפוגה ב-1,300 ×g בטמפרטורה של 15 °C למשך 10 דקות. לאחר מכן, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) והשביו את התאים בחצי מהנפח המקורי של LB המכיל 10 mM מגנזיום סולפט.הניחי את התאים בצד בזמן שהריאגנטים האחרים מוכנים. אריזה של ה-DNA בחלקיקי פאג' Lambda תתבצע תחילה על ידי העברה בפיפט של 4 µL מה-DNA שחולץ מזרה של coda, באמצעות פיפט בעל קוטר רחב, אל תוך מבחנה של 1.5 mL.הפשיר את המבחנה הראשונה מערכה של תמצית אריזת פאגים בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן העבר בפיפט 4.8 µL של תמצית האריזה אל המבחנה המכילה את ה-DNA. לאחר מכן, ערבב בעדינות את התמיסה בעזרת קצה הפיפט והדגר את המבחנה במקלחון במעלה של 30 °C למשך 1.5 שעות. לאחר מכן, הפשיר את המבחנה השנייה של תמצית האריזה ושוב, העבר בפיפט 4.8 µL אל המבחנה המכילה את ה-DNA.ערבבו בעדינות את התמיסה באמצעות קצה הפפטה ולאחר מכן הדגירו את המבחנה במקלח מים בטמפרטורה של 30 °C למשך 1.5 שעות. השעיקו שוב את חלקיקי הפאג' הארוזים ב-500 µL של בופר מגנזיום מלוחי, והניחו את המבחנות על רוטטור למשך 30 דקות במהירות של 20 RPM. לאחר הסיבוב, בצעו וורטקס קצר לדגימות ולאחר מכן סובבו במצנטריפוגה ב-11,000 ×g למשך 30 שניות כדי לרכז את הדגימות בתחתית המבחנה.חלקיקי הפאג מוכנים כעת להדבקה. לאחר מכן, הכינו שמונה מיליליטרים של top auger עבור כל titer ולוח מוטציות. שמרו את ה-top augers בטמפרטורה של 50 °C לפני הוספת magnesium sulfate לריכוז של 10 millimolar, והוסיפו שלושה גרמים לליטר של חומר הברירה PGAL לבחירת המוטציות.השתמשו במקדח עליון בלבד לפני הדבקת התאים. סמנו שני מבחנות של 50 מיליליטר לכל דגימה, אחת עבור מוטנט ואחת עבור טיטר. לאחר מכן, סמנו שמונה פלטות מקדח לכל דגימה, ארבע עבור מוטנט וארבע עבור טיטר.בשלב הבא, העבירו באמצעות פיפטה שני מיליליטר של תאים שהושעו מחדש לתוך כל מבחנה בנפח 50 מיליליטר. הוסיפו 500 מיקרוליטר של חלקיקי פאג' ארוזים למבחנה בנפח 50 מיליליטר המסומנת כ-"mutant". ערבבו בעדינות את המבחנה והמתינו 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי שחלקיקי הפאג' ידביקו את התאים.לאחר דגירה של 30 דקות, ערבבו קצרות במערבל Vortex את התאים המודבקים ולאחר מכן העבירו 15 µL מהתאים המודבקים למסורת הטיטרation של 50 mL המתאימה. הוסיפו 30 mL של titer top auger בטמפרטורה של 50 °C למסורת הטיטרation של 50 mL. חלקו באופן מיידי את תערובת ה-auger והתאים בין ארבעת פלטות הטיטרation.יש לוודא כי הוספו 3 g/L של P gal למסבב בחירת המוטציות בטמפרטורה של 50 °C. לאחר מכן, יש להוסיף 30 mL של מסבב בחירת המוטציות המכיל PGAL לשפרו של המוטציה בנפח 50 mL. מיד לאחר מכן, יש לחלק את כמות תערובת המסבב והתאים לארבע צלחות מוטציות.המתינו עד שהמונחים יתמצקו, ולאחר מכן הפכו את המוןחים והדגירו אותם בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה. לאחר ההדגירה של הלילה, ספרו את מספר הפלאקים (plaques) במונחי המוטנטים ובמונחי הטיטר. לאחר מכן, העריכו את תדירות המוטנטים על ידי חלוקת המספר הכולל של פלאקי מוטנטים שנספרו בארבעת מונחי המוטנטים במספר המוערך של יחידות יוצרות פלאק (plaque forming units) בנפח הכולל של התאים המอดูהים, כפי שנקבע ממונחי הטיטר.בדיקה טיפוסית של מוטציות בתאי רבייה של מכרסים טרנסגניים מביאה למספר קטן מאוד של פלאקים (plaques) בצלחות המוטנטים, במיוחד בקבוצות מינוני הביקורת. מנגד, מאות פלאקים מזוהים בצלחות התיתר (titer plates). חשיפת זכרים של עכברי mutt למינון אוראלי חד-פעמי של 0, 25, 50 ו-100 מיליגרם לקילוגרם של ENU, ולאחריו פרק זמן דגימה של 70 יום, אפשרה את מדידת אירועי המוטציה בתאי גזע של ספרמטוגוניה.מינון נמוך של ENU הוביל לעלייה של פי 2.6 בתדירות המוטציות לעומת הביקרים, והמינון המקסימלי גרם לעלייה של פי 4.4. בעת תכנון ניסויים המשתמשים בפרוצדורה זו, חשוב להביא תמיד בחשבון את העיתוי שלה. יש לבחור בקפידה את מחזור המטגנזה של תאי הזרע, מועד המתן, מועד הדגימה וסוג התאים שנאספו, וזאת כדי להבחין בהשפעות שמקורן בסוג תאי המטגנזה הרצוי של הזרע.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע ריצוף DNA של הפlaques המוטנטיים כדי לאפיין את המוטציות ולזהות מוטנטים שעשויים לנבוע מאירועי התרחבות קלוניאלית. טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הרעילות הגנטית לזהות מוטגנים שעשויים להשפיע על תאי הנבט. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה בידיכם הבנה טובה של האופן שבו קובעים את שכיחות המוטנטים המושרה בתאי הנבט או בעכברים זכרים טרנסגניים שנחשפו למוטגן.לבדיקה זו יש יישומים פוטנציאליים בבדיקות רגולטוריות למוטגנים של תאי נבט, ובחקירות מכניסטיות ממוקדות יותר.

transgenic-rodent-assay-for-quantifying-male-germ-cell-mutant

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הפרוטוקולים של תא החיידק השתלת רקמות xenografting testis מתוארים. תא הנבט השתלת תוצאות spermatogenesis, התורם המופק האשכים הנמען ומהווה assay הכינון מחדש תפקודית לזיהוי בתאי גזע spermatogonial (SSCs). רקמת אשך xenografting מתרבה פיתוח testis ו spermatogenesis של מינים שונים התורמות בעכברים הנמענים.

נבט השתלת ורקמות testis Xenografting ב עכברים

כאן אנו מתארים in vivo assay mutagenesis למספר קטן של תאי hematopoietic מטוהרים באמצעות מודל עכבר המהונדס לאצי. גן האצים יכול להיות מבודד כדי לקבוע את התדירות, מיקום והסוג של מוטציות DNA באופן ספונטני קם או לאחר החשיפה לgenotoxins.

זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic

אנו מתארים את השלבים המפורטים של בדיקה כימית בעלת תפוקה גבוהה בנמטודה Caenorhabditis elegans המשמשת להערכת רעילות קו הנבט. בבדיקה זו, הפרעה בתפקוד קו הנבט בעקבות חשיפה לכימיקלים מנוטרת באמצעות מדווח פלואורסצנטי ספציפי לעוברים אנופלואידים.

הערכה מקיפה של תאי מין כימי רעילות שימוש נמטודות<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

התנגדות מתח היא אחד מסימני ההיכר לאריכות ימים, והוא ידוע להיות נשלטת גנטי. כאן, פיתחנו שיטת תפוקה גבוהה משוחדת למסך למוטציות המעניקות התנגדות מתח בתאי גזע עובריים שבה לפתח מודלים של עכברים ללימודי אריכות ימים.

גישה גנטית קדימה ללחשוף גני התנגדות מתח בעכברים - מסך תפוקה גבוהה בתאי גזע עובריים

עבודה זו מתארת ​​את סטנדרטיזציה של שיטה להשיג אוכלוסיות תאים נבט מטופלים מרקמת האשכים של מינים שונים של יונקים. זהו פרוטוקול פשוט המשלב דיסוציאציה פשוטה מכנית, מכתים עם Hoechst-33342 ו propidium iodide, ו FACS מיון, עם יישומים רחב במחקרים השוואתיים של ביולוגיה הרבייה הגברית.

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

טיפולים רבים, מוטציות גנטיות להשפיע על התזמון של בגרות מינית ופוריות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית כדי להעריך את התפתחות המתבגר ב עכברים וחולדות לפני הגדרת מחקר פוריות בחיות בגרו.

קביעת כשירות הרבייה על-ידי המאשר תחילת המתבגר וביצוע וזמינותו של פוריות ב עכברים וחולדות

מאמר זה מתאר כיצד לבצע בדיקות התנהגות מינית בעכברים זכרים.

הערכה של התנהגות מינית של עכברים זכרים

מאמר זה שואפת לספק את המתודולוגיה עבור הטרנסגנזה לעדשה של עוברי החולדה באמצעות זריקות מרובות של השעיית וירוס לתוך החלל perivitelline הזיטה. חולדות נשים הזדווג עם זן גברי פורה עם צבע פרווה דומיננטי שונה משמש להפקת אמהות pseudopregnant אומנה.

הדור של חולדות הטרנסגניים באמצעות גישה וקטורית לנטינגיי

כאן, אנו מתארים את immunoprecipitation של ריבוזומים ו-RNA הקשורים מאוכלוסיות לבחור של בוגרים זכר תאים הנבט באמצעות מערכת ריבוtag. הרבייה אסטרטגי ולimmunoprecipitation התוצאה הנקייה, התוצאות להתרבות להודיע על תא הנבט translatome ולספק תובנה לתוך מנגנונים של פנוטיפים מוטנטים.

ריבותג Immunoprecipitation בתאי הנבט של העכבר הגברי

כאן, אנו מציגים שיטה לביצוע הזרקת זרע עגולה (ROSI) בעכברים, טכניקה עם יישומים קליניים מבטיחים ותועלת לחקר המנגנונים העומדים בבסיס התפתחות עוברית.

הזרקת זרע עגולה לעכבר

למדו כיצד למדוד תדירות מוטציות בתאי זרע של עכברים טרנסגניים לאחר חשיפה למוטגן כימי או פיזי. שיטה זו משפרת רגישות ומפחיתה משאבים בהשוואה לשיטות מסורתיות.

המהונדס מכרסמים Assay עבור תדר Mutant תאי ניבט זכר כימות

גלה סרטונים נוספים