טיהור ללא chromatographic של פוליפפטידים דמויי אלסטין רקומביננטי וFusions עם פפטידים וחלבונים מן חיידקי Escherichia
9 ביוני 2014
פוליפפטידים דמויי אלסטין הם biopolymers גירוי מגיב עם יישומים החל טיהור חלבון רקומביננטי לאספקת סמים. פרוטוקול זה מתאר את הטיהור ואפיון של פוליפפטידים כמו אלסטין והתכת פפטיד או חלבון שלהם מחיידקי Escherichia באמצעות שלב טמפרטורת פתרון מעבר ההתנהגות הקריטית נמוך יותר שלהם כאלטרנטיבה פשוטה לכרומטוגרפיה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לטהר אלסטין רקומביננטי כמו פוליפפטידים מאי קולי על ידי מחזור מעבר הפוך. זה מושג תחילה על ידי איסוף הליזאט מתאי אי קולי שביטאו אלסטין רקומביננטי כמו פוליפפטיד, והסרת פסולת תאית בלתי מסיס על ידי צנטריפוגה. השלב השני הוא הסרת מזהמים מסיסים על ידי השראת מעבר אלסטין כמו פוליפפטיד בתוספת מלח או חום.
לאחר מכן איסוף האלסטין כמו ציפוי פוליפפטיד על ידי צנטריפוגה והשלכת הסופרנטנט. שלב זה נקרא ספין חם. לאחר מכן, תמיסת הפוליפפטיד המושהית כמו אלסטין היא צנטריפוגה להסרת המזהמים הבלתי מסיסים.
האלסטין המסיס כמו פוליפפטיד בסופרנטנט נשמר והגלולה מושלכת. שלב זה נקרא ספין קר, חוזר על מחזורים של ספינים חמים וקרים עד להשגת טוהר משביע רצון של האלסטין כמו פוליפפטיד. בסופו של דבר, מחזור מעבר הפוך מניב אלסטין טהור כמו מוצרי פוליפפטיד שניתן לאפיין לשימוש במגוון יישומים ביו-רפואיים.
לאלסטין כמו פוליפפטידים המטוהרים בטכניקה זו יש מספר יישומים שימושיים, כולל חישה ביולוגית, הנדסת רקמות ואספקת תרופות, כאשר ניתן לכוונן במיוחד את טמפרטורת המעבר וארכיטקטורת הביופולימר של האלסטין כמו פוליפפטיד לכל יישום. כדי להתחיל, בטא את הפלסמיד המקודד ELP הרצוי באי קולי באמצעות התנאים המתוארים בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר ניעור תרבית ליטר אחד באינקובטור במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, העבירו את התרבית לבקבוק צנטריפוגה של ליטר אחד, ולאחר מכן צנטריפוגה את הבקבוק ב-2000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט והחייאו. השעו את הגלולה במי PBS או במאגר רצוי אחר לנפח כולל של 45 מיליליטר. לאחר מכן העביר את תרחיף התא לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.
הנח את מתלה התא על קרח ולאחר קירור סוניקט למשך תשע דקות בסך הכל במחזורים של 10 שניות הפעלה ו-20 שניות כיבוי. עם הספק פלט של 85 וואט. אפשר לדגימה להתקרר על קרח במשך כ-10 דקות לאחר סבב הסוניקציה הראשון, ולאחר מכן חזור על מחזור הסוניקציה של תשע הדקות.
העבירו את הליזאט לצינור צנטריפוגה תחתון עגול של 50 מיליליטר. לאחר מכן הוסף שני מיליליטר של 10% משקל לנפח פוליאתילן לכל ליטר תרבית, ונער את הצינור כדי לערבב לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור ב-16,000 GS למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור צנטריפוגה תחתון עגול ונקי של 50 מיליליטר והשליכו את הגלולה.
הוסף נתרן כלורי גבישי לדגימה כדי לגרום למעבר ELP. לאחר שהמלח נמס, התמיסה תהפוך לעכורה, מה שמעיד על הפרדת הפאזה של ה-ELP מהתמיסה. לאחר מכן גלולה את ה-ELP על ידי צנטריפוגה של הדגימה ב-16,000 GS למשך 10 דקות.
בטמפרטורת החדר, כדור ה-ELP עשוי להיראות בהתחלה אטום, להשליך את הסופרנטנט ואז להוסיף מיליליטר אחד עד חמישה מיליליטר מהמאגר הרצוי לאחר הקירור. כדור ה-ELP עשוי להיראות שקוף ובצבע חום. Resus השעו את הגלולה על ידי פיפטינג או סיבוב הצינור בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, פיפטה אחת של מיליליטר מתמיסת ה-ELP המושעה לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה נקיים של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה של הצינורות ב-16,000 GS למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינור נקי והשליכו את הכדורים.
לגרום למעבר ELP בתוספת נתרן כלורי. אם ל-ELP יש טמפרטורת מעבר גבוהה שלא ניתן לגרום עם מלח בלבד, דגרו את הדגימה על בלוק חום למשך 15 דקות בטמפרטורה מעל טמפרטורת המעבר של ELP. לאחר מכן צנטריפוגה של הדגימה ב-16,000 GS למשך 10 דקות בטמפרטורה מעל הטמפרטורה המשמשת לשלב המעבר ELP.
השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת ה-ELP ב-500 עד 750 מיקרוליטר של מאגר רצוי על ידי פיפטינג או סיבוב הצינור בארבע מעלות צלזיוס עד שהגלולה מסיסה. לאחר מכן, צנטריפוגה של הדגימה ב-16,000 GS למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול כל מזהם בלתי מסיס. לאחר מכן העבירו את החטף לצינור נקי והשליכו את הגלולה חזור על מחזור מעבר הפוך עד שלא נצפתה גלולה מזהמת.
זה בדרך כלל דורש שניים עד חמישה מחזורים. הכינו סדרת דילול של פתרונות ELP ב-PBS או במאגר רצוי אחר. לאחר מכן השתמש בספקטרופוטומטר UV v מבוקר טמפרטורה כדי למדוד את הצפיפות האופטית ב-350 ננומטר בטווח טמפרטורות תוך חימום הדגימה בקצב של מעלה צלזיוס אחת לדקה.
אם לא נראית עלייה בצפיפות האופטית, טמפרטורת המעבר עשויה לחרוג ממגבלת הטמפרטורה העליונה. לאחר מכן, מדוד את הירידה בצפיפות האופטית באותו טווח טמפרטורות בקצב קירור של מעלה צלזיוס אחת לדקה. כדי לאמת את ההפיכות של עלילת המעבר ELP, הצפיפות האופטית לעומת הטמפרטורה, ואז קבע את טמפרטורת המעבר של הפולימר ההומו ELP.
על ידי זיהוי נקודת המפנה בפרופיל עכירות זה, הטיהור המוצלח של LPs מאושר על ידי דף SDS כפי שניתן לראות כאן. מספר המזהמים גדול בהרבה בליזאט הראשוני של אי קולי בהשוואה לדגימה לאחר סבב אחד של מחזור מעבר הפוך. טמפרטורת המעבר ELP מאופיינת בעכירות מתוכנתת טמפרטורה עבור פולימר הומו ELP.
פרופיל העכירות מציג עלייה חדה אחת בצפיפות האופטית, המגדירה את טמפרטורת המעבר בריכוז נתון. האופי ההפיך של מעבר ELP מאושר באמצעות סריקת עכירות קירור. קופולימרים של בלוק ELP מציגים פרופיל עכירות מורכב יותר מאשר LPs הומו פולימרים.
לאחר מכן ניתן לבצע מדידות פיזור אור דינמיות כדי לאשר את ההתנהגות של LPs אלה הנגזרת מקובץ פרופיל העכירות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטהר אלסטין רקומביננטי כמו פוליפפטידים מאי קולי באמצעות מחזור מעבר הפוך. לא, לא, לא, לא, לא.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את תהליכי הטיהור והאפיון של פוליפפטידים דמויי אלסטין (ELPs) מ-Escherichia coli באמצעות מחזורי מעבר הפוכים. ELPs הם ביו-פולימרים בעלי יישומים מגוונים, הכוללים הובלת תרופות והנדסת רקמות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביופולימרים
- טיהור חלבונים
- יישומים ביו-רפואיים
רקע
- פוליפפטידים דמויי-אלסטין הם ביופולימרים המגיבים לגירויים.
- ניתן להשתמש בהם במגוון יישומים ביו-רפואיים.
- טכניקות טיהור הן חיוניות לצורך שימוש יעיל בהן.
- מחזורי מעבר הפוכים (Inverse transition cycling) הם שיטה חדשנית לטיהור.
מטרת המחקר
- לניקוי ELPs רקומביננטיים מ-E. coli.
- לאפיון ה-ELPs המנוקים עבור יישומים ביו-רפואיים.
- להדגמת היעילות של מחזורי מעבר הפוך (inverse transition cycling).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף ליזאט של E. coli והסרת שיירי חומרים בלתי ממיסים.
- השראה של מעבר פאזה של ELP באמצעות מלח או חום.
- ביצוע סבבי ספינטרפוזציה חמים וקרים חוזרים לצורך טיהור.
- אפיון של ELPs באמצעות מדידות צפיפות אופטית.
תוצאות עיקריות
- טיהור מוצלח של ELPs באמצעות מחזורי מעבר הפוכים.
- אפיון של טמפרטורות המעבר של ELP.
- הדגמה של ההפיכות של מעברי ELP.
- אישור של יישומים פוטנציאליים בביו-סנסינג ובהולכת תרופות.
מסקנות
- סבבי מעבר הפוכים הם שיטה יעילה לטיהור של ELPs.
- ניתן להתאים ELPs מטהרים ליישומים ביו-רפואיים ספציפיים.
- הפרוטוקול משפר את ההבנה של התנהגות ELP בתמיסה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מחזורי מעבר הפוכים (Inverse transition cycling) מאפשרים ניקוי של פוליפפטידים דמויי אלסטין (ELPs) רקומביננטיים ושל חלבונים המחוברים אליהם ללא שימוש בכרומטוגרפיה, ובכך מפחיתים את המורכבות והעלות של שלבי העיבוד הבאים (downstream processing). שיטה זו תומכת בייצור מהיר של תרופות וחומרים ביומטריים מבוססי ELP על ידי ניצול התגובתיות התרמית הפנימית להסרת מזהמים. היא מגבירה את הוודאות לגבי היעד בשלבי הגילוי המוקדמים באמצעות אספקת ביו-פולימרים מנוקים ורלוונטיים מבחינה תפקודית לפיתוח בדיקות ולסינון.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של מבני היתוך ELP על ידי אספקת חומר טהור לצורך תיקוף תפקודי של פעילות פפטידים או חלבונים.
- ערך תפעולי: מסיר מזהמים מסיסים ובלתי מסיסים מליזטים של E. coli ללא שימוש בכרומטוגרפיה, ובכך מאיץ את לוחות הזמנים של ייצור חלבונים בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: ייצור תוצרי ELP בעלי טמפרטורות מעבר מוגדרות, המאפשר תכנון אמין של חיישנים ביולוגיים שבהם מעבר הפאזה משמש כאות שניתן לזיהוי.
- ערך תפעולי: יצירת מנות ELP הניתנות לשחזור ובקנה מידה רחב, המתאימות לסטנדרטיזציה בפלטפורמות של סריקה בתופעת גבוהה הדורשות התנהגות עקבית של הביופולימר.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך בהערכה פרה-קלינית של מערכות להולכת תרופות מבוססות ELP על ידי אספקת נשאי הולכה מטוהרים בעלי ארכיטקטורה וקינטיקת שחרור ניתנות לכיוונון.
- ערך תפעולי: מאפשר המשכיות משלב הגילוי לעבודה פרה-קלינית על ידי הפקת חלבוני ELP מותחים המתאימים למחקרי יעילות וביזור ביולוגי in vivo.
אינטגרציית תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מחזורי מעבר הפוכים (Inverse transition cycling) משתלבים ברצף הגילוי, מהביטוי רקומביננטי ב-E. coli ועד לזיהוי מובילים, ומספקים חלומי ELP מנוקים להערכה בהמשך התהליך ללא צווארי בקבוק כרומטוגרפיים.
- ביולוגיה של תגליות: מאפשרת בדיקת השערות עבור חלבוני ELP-peptide או חלבוני ELP-protein מאוחדים (fusions) על ידי אספקת חומר נקי מזיהומים לבדיקות קישור ופעילות.
- סריקה: מספקת מוצרי ELP מוכנים לבדיקה עם קריאות כמותיות המבוססות על עכירות לניטור יעילות הטיהור ועקביות המנות.
- אנליטיקה: מספקת מדידות צפיפות אופטית מתוכננות לפי טמפרטורה המגדירות את טמפרטורת המעבר, מאפיין איכות קריטי עבור מוצרים מבוססי ELP.
- מחקר תרגומי: מקשר ליישומים פרה-קליניים באמצעות חלבוני ELP מטוהרים המתאימים לניסוח במערכות להולכת תרופות או בפיגומים להנדסת רקמות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת שיטת טיהור הניתנת לשימוש חוזר ותואמת פלטפורמה, הישימה על פני רצפי ELP ושותפי איחוד מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתפקוד של היתוכי ELP על ידי הסרת שונות כרומטוגרפית ושימור התנהגות ביו-פולימרית דמוית טבעית.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות מעברי פאזה המושרים על ידי מלח או חום, המתאימים לצנטריפוגות מעבדה סטנדרטיות.
- ערך אסטרטגי: מפחית את אובדן החומר הקשור לטיהור ואת ההוצאות ההוניות על ידי ביטול הצורך בשרפים כרומטוגרפיים ובנטל התיקוף הנלווה אליהם.
- השפעה על פורטפוליו המוצרים: מאפשר תעדוף מותאם-סיכון של מועמדים מבוססי ELP על ידי הבטחת חומר עקבי בדרגת טהרה גבוהה לצורך קבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביטוי חלבונים רקומביננטיים ובביופיזיקה של מעברי פאזה.
- תלוי בגישה לצנטריפוגות המסוגלות להגיע ל-16,000 × g ולמודולים עם בקרת טמפרטורה לסבבי סבב חמים/קרים.
- מחייב סטנדרטיזציה של ריכוזי מלח ופרופילי טמפרטורה בין צוותים שונים כדי להבטיח התנהגות מעבר ELP הניתנת לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה עבור ELPs עם טמפרטורות מעבר גבוהות הדורשות השראת חום מעבר למגבלות המסיסות של המלח.
- כולל מגבלות מעשיות, ביניהן זמן העיבוד עבור מחזורים מרובים ואובדן תפוקה פוטנציאלי במהלך שלבי צנטריפוגה חוזרים.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:37
Expression of Elastin-like Polypeptides (ELPs)
2:22
Purification of ELPs by Inverse Transition Cycling
4:17
Removal of Contaminants from ELP through Subsequent Rounds of ITC
5:22
Characterization of ELP Tt by Temperature-programmed Turbidimetry
7:13
Conclusion
6:16
Results: Characterization of ELPs Purified from E. coli through ITC
