ניתוח תפוקה גבוהה תמונה של spheroids גידול: יישום תוכנה ידידותי למשתמש כדי למדוד את גודל של spheroids באופן אוטומטי ומדויק
8 ביולי 2014
אנו מציגים יישום תוכנת ניתוח תמונת תפוקה גבוהה כדי למדוד את גודלו של הספרואידים גידול תלת ממדים צילמו עם מיקרוסקופ שדה בהיר. יישום זה מספק דרך מהירה ויעילה כדי לבחון את ההשפעות של תרופות טיפוליות בהספרואידים, אשר מועיל לחוקרים המעוניינים להשתמש הספרואידים במסכים בסמים.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשתמש בתוכנה לניתוח תמונות בתפוקה גבוהה כדי למדוד את הגודל של גידולי סרטן תלת-ממדיים שצולמו במיקרוסקופיית שדה בהיר. דבר זה מושג תחילה על ידי סידור כל התמונות של הספרואידים הגידוליים התלת-ממדיים במבנה הספריות ובשמות הקבצים הנכונים עבור תוכנת מדידת הספרואידים זו. כשלב שני, תוכנת מדידת הספרואידים מחשבת באופן אוטומטי את הגבול של הספרואיד על בסיס אלגוריתם קונטור פעיל ומודדת את גודלו של הספרואיד.
בשלב הבא, מבוצע סריקת בקרת איכות מתוכננת היטב כדי להבטיח תוצאות אופטימליות עבור כל תמונה. לאחר ניתוח התוצאות בנתונים, ניתן להסיק את קצב הצמיחה של הסטרואיד התלת-ממדי תחת הטיפול הניסויי. היתרון המרכזי של תוכנת מחשב זו הוא שהיא משלבת אלגוריתם עוצמתי לניתוח תמונות אוטומטי ותהליך עבודה של בקרת איכות כדי לתמוך בניתוח תמונות בתפוקה גבוהה.
התוכנה סובלנית לרקע תמונה לא אחיד או רועש. היא מפחיתה את עומס העבודה באופן ניכר ומאיצה את תהליך הניתוח. יישום התוכנה מסייע להפיכת ספרואידים של גידולים בתלת-ממד למודל in vitro שגרתי לסריקות תרופות הן בתעשייה והן באקדמיה.
תוכנת Sphe sizer דורשת MATLAB עם ארגזי הכלים (toolboxes) לעיבוד אותות ועיבוד תמונה. ארגז כלים אופציונלי לשימוש הוא parallel processing. הורד את OID sizer מהשרת של Rutgers וחלץ אותו לספריית התקנה, שתידרש בשלבים הבאים. כעת הכן את התמונות שלך.
ראשית, קבע את רזולוציית התמונה של מערכת ההדמיה ואת קנה המידה המוחלט של התמונה במיקרונים לפי פיקסל. בסופו של דבר, קנה המידה של כל תמונה בניסוי חייב להיות זהה. ודא שכל פורמט קובץ תמונה קנייני הומר לפורמט קובץ מקובל, כגון TIFF או jpeg.
כעת, שמרו את הקבצים תוך שימוש בשמות קבצים ובמבנה ספריות ספציפיים הנדרשים על ידי התוכנה; את הקבצים יש לשם לפי פלטה, שורה ועמודה, ואת ספריות הקבצים יש לארגן כך שכל ספריה תכיל ניסוי אחד, עם תת-ספריה בודדת לכל נקודת זמן בניסוי. כל תמונה מכל פלטה בנקודת זמן מסוימת צריכה לשתף תת-ספריה אחת. התחילו בפתיחת MATLAB ובחלון הפקודות (command window) עברו לספריית ההתקנה של sphe sizer.
כעת הקלידו Sphe sizer 10 ולחצו על Enter כדי להפעיל את תוכנת ה-OID sizer. לחצו על כפתור ה-Browse בחלון החדש ובחרו את הספריה המוכנה עם כל התמונות מהניסוי. לאחר מכן, תחת שדה הטקסט של התיקייה, סמנו את תיבת הבחירה include sub folders לצורך בקרת איכות.
בחרו באפשרות התצוגה בזמן אמת (on the fly). השלב הבא הוא הגדרת הרזולוציה של התמונות, פעולה הכרחית כדי שהתוכנה תמיר פיקסלים למילימטרים באופן נכון. בשלב זה, המשתמש יכול להיכנס לתפריט המתקדם כדי לגשת להגדרות נוספות בתיבת הצבעים המיוחדת זו.
השאירו את ההגדרה על none עבור תמונות של 8 ביט או 16 ביט. אם התמונות צולמו ב-12 ביט, בחרו ב-12 bid.
לאחר שכל ההגדרות הוגדרו כראוי, התחל את החישוב על ידי לחיצה על compute, כאשר החישוב מבוצע עבור כל קובץ התמונות. תוצאות סגמנטציה פרטניות מוצגות בתוכנה בזמן אמת; עם השלמת החישוב, טבלת התוצאות תציג את נפח הקובץ בתיקייה, אורך, רוחב ומתג valid עבור כל הספירות שנותחו. מתג ה-valid משמש לבקרת איכות.
כאשר המשתמש לוחץ על תא כלשהו בטבלת התוצאות, התמונות המקוריות ותמונות בקרת האיכות יוצגו בצד ימין לצורך סקירה; יש לבחון את כל התמונות ברצף באמצעות מקש החץ למטה במקלדת. כאשר נתקלים בגבול ספרואיד חשוד, יש לדייק אותו על ידי לחיצה על manual initialize בתמונה המקורית. גררו את כלי האליפסה כדי לכסות את הספרואיד באופן מדויק יותר.
טבלת התוצאות תעדכן את המדידות בהתאם. אם האתחול הידני נכשל במציאת הגבול האופטימלי של הסטרואיד המבוקש, השתמש בכפתור השרטוט הידני כדי להציג את התמונה המקורית ולשרטט את גבול הסטרואיד. אם התמונה אינה מכילה סטרואיד תקין, פשוט בטל את סימון תיבת הבחירה עבור תמונה זו.
עם השלמת בקרת האיכות, לחצו על תיבת עיצוב התוצאות (format results) כדי לשמור את התוצאות. ניתן להגדיר את שמות הקבצים המיוצאים בחלון אפשרויות מתקדמות (advanced to option). קובץ הפלט של הרשימה הוא טבלה עם מפרידי טאב (tab delineated) שיכולה להכיל את כל המדידות.
קובץ הפלט בפורמט של טבלה המופרדת בטאבים, המארגנת את ערכי הנפח לפי פורמט הפלטה המקורי לצורך ניתוח נתונים ויזואלי ונוח בהמשך התהליך. Sphe sizer יכול לזהות את גבולות הכדורים בתמונות בצורה חסונה, גם בתנאי צילום שונים שאינם אופטימליים. לעיתים רחוקות מתרחשת זיהוי שגוי של OID זה; במקרה כזה, הכלי המופעל ידנית מאפשר למשתמש להגדיר באופן ידני את המיקום והגודל של סטרואיד זה.
במקרים קיצוניים, ייתכן שהסטרואיד לא יסומן (segmented) בצורה נכונה מהרקע המסיח והרועש באופן אוטומטי או באמצעות הכלי בעל האתחול הידני. במקרים כאלה, התוכנה מאפשרת למשתמש לשרטט ידנית את גבולות הסטרואיד כדי להפיק מדידות אורך ונפח מדויקות. יעילות התוכנה תוקפה על ידי ניתוח של אותה קבוצה של 288 תמונות באמצעות ניתוח ידני לעומת מחשבים בעלי ליבה אחת ומספר ליבות.
ניתוח תמונות באמצעות steroid sizer מהיר פי 18 ומעלה לכל תמונה בהשוואה למדידות ידניות, דבר המדגים את החזרתיות של התוכנה. קבוצה של 24 סטרואידים נותחה שלוש פעמים בכל אחת מהשיטות. steroid sizer, המסומן בירוק, הראה סטיית תקן קטנה יותר במדידות מאשר הניתוח הידני.
בניסוי שהתאפשר בעזרת מדידת גודל סטרואידים, נבחן גדילה של גידולים שנתפסו כסטרואידים עם טיפולים במעכב HSP 90 ובקלדריבין. התוצאות הראו כי לטיפול משולב עשוי להיות אפקט אנטי-גידולי in vivo. מחקר זה מציג תוכנית מהירה, גמישה ויעילה לקביעה מדויקת של גודלם של סטרואידים גידוליים בתלת-ממד.
תוכנית ה-ster size היא קלה לשימוש ודורשת קלט מינימלי מהמשתמש. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי הסטרואידים מצולמים במרכז השדה ללא מגע עם דופן הקיר. יש ללכוד את כל התמונות תחת אותה עדשה, ולוודא שכל הקבצים נקראים נכון ומסודרים כפי שמצוין בפרוטוקול.
סקירה כללית
מחקר זה מציג יישום תוכנה לניתוח תמונות בעוצמה גבוהה, שנועד למדוד את גודלן של ספרואידים גידוליים תלת-ממדיים באמצעות מיקרוסקופיה בשדה בהיר. התוכנה מייעלת את בחינת ההשפעות של תרופות טיפוליות על ספרואידים, ובכך מהווה כלי בעל ערך לחוקרים העוסקים בסריקת תרופות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אונקולוגיה
- ניתוח תמונות
רקע
- ספרואידים של גידולים בתלת-ממד הם מודלים חשובים לסריקת תרופות.
- שיטות מסורתיות למדידת גודל הספרואידים עשויות להיות תובעניות במאמצן וגוזלות זמן.
- ניתוח תמונה אוטומטי יכול לשפר את היעילות והדיוק במחקר.
- התוכנה משלבת מדדי בקרת איכות כדי להבטיח תוצאות מהימנות.
מטרת המחקר
- פיתוח כלי תוכנה המאפשר אוטומציה של מדידת גדלי ספרואידים של גידולים.
- הקלה על ביצוע אנליזות בסביבת תפוקה גבוהה (high-throughput) עבור יישומי סריקת תרופות.
- שיפור הדיוק והמהירות של קביעת גודל הספרואידים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תמונות של ספרואידים של גידולים בתלת-ממד אורגנו ועובדו באמצעות התוכנה.
- התוכנה משתמשת באלגוריתם קו מתאר פעיל (active contour) לזיהוי גבולות.
- יושמו מדדי בקרת איכות כדי לתקף את התוצאות.
- התוצאות נותחו והוצגו בפורמט ידידותי למשתמש לצורך הערכה נוספת.
תוצאות עיקריות
- התוכנה צמצמה משמעותית את זמן האנליזה בהשוואה לשיטות ידניות.
- היא הפגינה ביצועים חסונים גם עם רקעים רועשים.
- התוצאות הצביעו על השפעות אנטי-גידוליות פוטנציאליות של טיפולים משולבים.
- המדידות הראו סטיות תקן קטנות יותר בהשוואה לאנליזה ידנית.
מסקנות
- התוכנה שפותחה מהווה כלי יעיל למדידת ספרואידים של גידולים בתלת-ממד.
- היא משפרת את ההיתכנות של שימוש בספרואידים לסריקת תרופות.
- התוכנית דורשת קלט מינימלי מהמשתמש והיא קלה ליישום.
שאלות נשאלות השכיחות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח תמונות אוטומטי בעוצמה גבוהה של ספרואידים של גידולים תלת-ממדיים פותר צוואר בקבוק קריטי בגילוי תרופות על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית ומהירה של השפעות תרכובים בקנה מידה רחב. SpheroidSizer מפחית את העבודה הידנית ומאיץ את יצירת הנתונים, ובכך תומך בתהליכי סריקה ניתנים להרחבה באישור מטרות אונקולוגיות ובזיהוי מועמדים לתרופות. השילוב שלו של סגמנטציית קווי מתאר פעילים (active contour segmentation) עם בקרת איכות משפר את השחזוריות ואת הביטחון החזוי בהסרת סיכונים בשלב הפרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה כמותית של השערות טיפוליות על ידי מדידת שינויים בגודל הספרואידים בתגובה לטיפולים ניסיוניים.
- ערך תפעולי: מבצע אוטומציה של זיהוי הגבולות וחישוב הנפח, ובכך מפחית את זמן המדידה הידנית ביותר מ-18 מningar לתמונה.
- ערך ניבוי: מספק מדידות עקביות עם שונות נמוכה, המשפרות את הביטחון בהערכות של מעורבות המטרה (target engagement) ושינוי מסלולים (pathway modulation).
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר פלטיים סטנדרטיים המוכנים לגיליון אלקטרוני (אורך, רוחב, נפח) לצורך ניתוחי תגובה למינון ויעילות בהמשך התהליך.
- ערך תפעולי: מעבד 1,000 תמונות ב-~15 דקות במחשב נייד או ב-~1 דקה בתחנת עבודה רב-ליבבית, מה שמאפשר תאימות לסריקה בספיקות גבוהה.
- מוכנות הבדיקה: כולל כלי עקיפה ידניים (Manual Initialize, Hand Draw) לשמירה על דיוק למרות איכות תמונה משתנה ומורפולוגיה של ספרואידים.
מחקרe תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תומך במעקב אורכי של צמיחת הספרואידים תחת טיפול, ומקשר בין תגובות in vitro להשפעות אנטי-גידוליות פוטנציאליות in vivo.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מקל על הערכה של שילובים של תרכובות (למשל, מעכב HSP 90 וקלדריבין) באמצעות אספקת מדדי גודל ונפח מהימנים לאורך זמן.
- הלימה פרה-קלינית: מייצר נתונים כמותיים המתאימים להחלטות go/no-go במסלולי אופטימיזציה של מולקולות מובילות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
SpheroidSizer משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם, דרך זיהוי מובילים (lead identification) ועד להערכת יעילות פרה-קלינית, ובמיוחד עבור תוכניות אונקולוגיות המשתמשות במודלים של ספרואידים בתלת-ממד.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות באמצעות קריאות אוטומטיות של גודל ונפח המשקפות התרבות של ספרואידים, מוות או שינויים מורפולוגיים.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה באמצעות סגמנטציה אלגוריתמית ותהליכי בקרת איכות (QC), ובכך מפחיתה את השונות בין המפעילים.
- אנליטיקה: מפיקה קבצי נתונים מופרדים בטאבים המכילים ממדי ספרואידים ודגלי תקינות, מה שמקל על השוואה סטטיסטית בין תנאים ונקודות זמן.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין תגובות של ספרואידים in vitro לתוצאות in vivo על ידי אפשור ניתוח אורך של ויסות גדילת גידולים.
- שימוש חוזר ארגוני: תוכננה ככלי הניתן לשימוש חוזר וללא תלות בפלטפורמה עבור בדיקות מבוססות ספרואידים בפרויקטים מרובים ובתחומי טיפול שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון בתיקוף המטרה באמצעות מורפומטריה מדויקת וניתנת לשחזור של ספרואידים.
- ערך תפעולי: מפחית את עצימות העבודה ומגדיל את התפוקה, ובכך מאיץ את לוחות הזמנים של הסריקה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשור קבלת החלטות מהירה יותר של go/no-go בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי הפקת נתונים פנוטיפיים כמותיים בעלי רמת ביטחון גבוהה.
שיקולי יישום
- דורש MATLAB עם ארגזי כלים לעיבוד תמונה (Image Processing) ועיבוד אותות (Signal Processing) עבור הפונקציונליות הבסיסית.
- ארגז כלים לעיבוד מקבילי (Parallel processing toolbox) הוא רשות להאצת האנליזה במערכות רב-ליבתיות.
- דורש רכישת תמונות סטנדרטית (רזולוציה, קנה מידה, שמות קבצים ומבנה ספריות עקביים).
- תלוי בהדרכת המשתמש לשימוש יעיל בכלי בקרת האיכות ובכלי עקיפה ידניים (manual override).
- מתאים ביותר לתמונות בשדה בהיר (brightfield) של ספרואידים לא-נצמדים בתוך שדה הראייה, שאינם נוגעים בקצוות.
