Name: במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 8 s
Description: למדו מעקב אחר תאי גזע hematopoietic מסומנים בחמישה חלבונים פלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופיית confocal ו-multiphoton. שיטה זו מאפשרת מיפוי קלונלי וניתוח התנהגות תאים ברקמות חיות לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר התוך-כיתתית של מכון הלב, הריאות והדם הלאומי של המכונים הלאומיים לבריאות. אנו מודים לבוריס פהסה (המרכז הרפואי האוניברסיטאי המבורג-אפנדורף, המבורג, גרמניה) על אספקת חמשת הפלסמידים הווקטוריים של LeGO; כריסטיאן א. קומבס וניל ס. יאנג (NHLBI, NIH) על דיונים, תמיכה ועידוד לאורך מחקר זה, ואנדרה לה-רושל (NHLBI, NIH) על סיוע בהזרקות לווריד הזנב.

<ol><li>Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).</li>
<li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li>
<li>Takaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis+in+3+dimensions+human+and+murine+bone+marrow+architecture+visualized+by+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy.</a> Blood. 116, e41-e55 (2010).</li>
<li>Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clonal+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+marked+by+5+fluorescent+proteins+using+confocal+and+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy.</a> Blood. 120, e105-e116 (2012).</li>
<li>Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+ontology+%28LeGO%29+vectors+equipped+with+novel+drug-selectable+fluorescent+proteins+new+building+blocks+for+cell+marking+and+multi-gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis.</a> Gene Ther. 17, 511-520 (2010).</li>
<li>Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolor+panel+of+novel+lentiviral+%27gene+ontology%27+%28LeGO%29+vectors+for+functional+gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis.</a> Mol Ther. 16, 698-706 (2008).</li>
<li>Weber, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGB+marking+facilitates+multicolor+clonal+cell+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking.</a> Nat Med. 17, 504-509 (2011).</li>
<li>Lo Celso,, Lin, C. P., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transplanted+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+mouse+calvarium+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow.</a> Nature protocols. 6, 1-14 (2011).</li>
<li>Kohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cellular+dynamics+and+endosteal+location+of+aged+early+hematopoietic+progenitor+cells+revealed+by+time-lapse+intravital+imaging+in+long+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones.</a> Blood. 114, 290-298 (2009).</li>
<li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophys J. 82, 493-508 (2002).</li>
<li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+MYH9-related+disease+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119, 238-250 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

אנו מתארים כאן את הפרטים של מתודולוגיה חזקה המציאה לאחרונה למעקב תא משובט, המשלבים את המגוון הגדול שנוצר על ידי קומבינטורית סימון עם וקטורי קידוד-5FP לגו והדמיה עם confocal טנדם ומיקרוסקופיה 2 פוטונים כדי להשיג נפח והדמיה דינמית ברקמות חיות. זו הרחיבה את השימוש בצבע המבוסס על FP סימון על ידי הקלטת זהות רפאים confocal ב5 ערוצים 8 סיביות &quot;ברורים&quot;. כך היחס היחסי של Cerulean, EGFP, ונוס, tdTomato, mCherry בתוך כל תא יוצר &quot;colorprint&quot; ייחודי לזיהוי צאצאים משובטים. ת...

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

ייצור תאי דם, hematopoiesis מכונה, מתוחזק על ידי אוכלוסייה קטנה של תאי גזע hematopoietic ואב (HSPCs). תאים אלה נמצאים בתוך מח העצם (BM) בנישה microenvironmental מורכבת הכוללת אוסטאובלסטים, תאי סטרומה, רקמת שומן, ומבנים של כלי דם, כל מעורבים בשליטה של התחדשות עצמית ובידול 1,2. כBM שלם באופן מסורתי נגיש לתצפיות ישירות, יחסי הגומלין בין HSPC וmicroenvironment שלהם נשארים uncharacterized במידה רבה in vivo. בעבר, הקמנו מתודולוגיה לדמיין את ארכיטקטורת 3D של BM שלם באמצעות הקרינה confocal והשתקפות מיקרוסקופיה 3. אנו מתאפיינים הרחבת HSPCs המסומן EGFP בBM, אבל השימוש רק FP יחיד מנע ניתוח של התחדשות ברמה משובט. מאוד לאחרונה אנו ניצלנו את lentiviral ג&#39;ין אונטולוגיה (לגו) וקטורים constitutively להביע flחלבוני uorescent (FPS) כדי לסמן ביעילות תאים 4,5. Co-התמרה של HSPC עם 3 או 5 וקטורים יוצרת צבעים מגוונים של צבעים קומבינטורית, המאפשר מעקב של שיבוטים HSPC בודדים מרובים. שילוב HSPC המסומן בטכנולוגיית הדמיה חדשה רשאית להתחקות ביות HSPC פרט וקליטתם בBM של עכברים המוקרנים. וקטורים לגו שמשו כדי לסמן HSPC עם 3 או 5 fps שונה (מCerulean, eGFP, ונוס, tdTomato, וmCherry) ובצעו את קליטתם שלהם לאורך הזמן בBM על ידי מיקרוסקופ confocal ו2 פוטונים, המאפשרים הדמיה ברורה של עצם ואחר מבני מטריצה, ואת הקשר של שיבוטים HSPC לרכיבים של microenvironment. HSPC היו מטוהר כתאי שושלת שליליים מC57Bl / 6 עכברים BM, transduced עם וקטורים לגו, וreinfused על ידי הזרקה לוריד זנב לעכברי congenic-מלוטש myelo. על ידי מעקב אחר כמויות גדולות של רקמת עצם החזה BM אנו דמיינו engraftment endosteal מתרחש בתחילתהתחדשות BM. צבירי תאים עם ספקטרום צבעים מגוון הופיעו בתחילה בסמוך לעצם והתקדם באופן מרכזי על פני זמן. מעניין, אחרי יותר מ 3 שבועות מח מורכב מאשכולות משובטים מאקרוסקופי, המצביע על התפשטות hematopoiesis נגזר מHSPCs הבודד בסמיכות במוח, ולא הפצה נרחבת של HSPCs באמצעות זרם הדם. היה גיוון צבע פחות בנקודות זמן מאוחרות, המצביע על הקושי בtransducing לטווח ארוך אכלוס מחדש תאים עם וקטורים מרובים. בנוסף, HSPCs נוצר אשכולות בטחול, איבר אחראי גם על hematopoiesis בעכברים. תאים בודדים המופק HPSC יכולים להיפתר בבלוטת התימוס, בלוטות לימפה, טחול, כבד, ריאות, לב, עור, שרירי שלד, רקמת שומן, וכליות, כמו גם. ניתן להעריך תמונות 3D איכותית וכמותית להעריך את חלוקת תאים עם הפרעות מינימליות של הרקמות. לבסוף, אנו מדגימיםד ההיתכנות של מחקרים דינמיים חיים ב4D על ידי שילוב של multiphoton סריקת תהודה וזמן לשגות הדמיה confocal. מתודולוגיה זו מאפשרת רזולוציה גבוהה שאינו פולשנית, רב ממדית מעקב תא גורלם של אוכלוסיות תאים מסומנות ספקטרלי באדריכלות 3D שלמה שלהם, מתן כלי רב עוצמה במחקר של התחדשות ופתולוגיה רקמה.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><ייצור חזק>של וירוסים</חזק></td></tr><tr><td>LeGO-Cer2</td><td>Addgene</td><td>27338</td><td>ביטוי של Cerulean</td></tr><tr><td>LeGO-G2</td><td>Addgene</td><td>25917</td><td>ביטוי של eGFP</td></tr><tr><td>LeGO-V2</td><td>Addgene</td><td>27340</td><td>ביטוי של Venus</td></tr><tr><td>LeGO-T2</td><td>Addgene</td><td>27342</td><td>ביטוי של tdTomato</td></tr><tr><td>LeGO-C2</td><td>Addgene</td><td>27339</td><td>ביטוי של mCherry</td></tr><tr><td>Calciumm Phosphate Transfection Kit</td><td>Sigma</td><td>CAPHOS-1KT</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco, Life Technology</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי מושבת בחום</td><td>Sigma</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>עט סטרפטוקוקוס גלוטמין</td><td>Gibco, חיים טכנולוגיה</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>SW28 אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>L60</td><td></td></tr><tr><td>Millex מסנן מונע מזרק Unite (0.22 & micro; m)</td> <td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td colspan="4" ><חזק>איסוף תאי עכבר, טיהור, התמרה והשתלה</חזק></td></tr><tr><td>ACK מאגר ליסינג</td><td>איכות ביולוגית בע"מ.</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>ערכת דלדול תאי שושלת (עכבר)</td> <td>Miltenyi Biotec Inc. ארה"ב</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>עמודות LS + צינורות</td><td>Miltenyi Biotec Inc. ארה"ב</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>מסנני הפרדה מראש (30 ומיקרו; m)</td> <td>Miltenyi Biotec Inc. ארה"ב</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>מדיום נטול סרום StemSpan SFEM לתרבית והרחבה של תאים המטופויאטיים (500 מ"ל)</td><td>StemCell Technologies Inc&nbsp;</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>עכברים IL-11 CF</td><td>מו"פ & די סיסטמס בע"מ</td><td>418-ML-025/CF</td><td>100 ומיקרו; גרם/מ"ל הוא פי 1,000</td></tr><tr><td>עכברים רקומביננטיים SCF</td><td>RDI חטיבת פיצג'רלד תעשיות בינלאומיות&nbsp;</td><td>RDI-2503</td><td>100 ומיקרו; גרם/מ"ל הוא 2,000x</td></tr><tr><td>עכברים רקומביננטיים IL-3</td><td>מו"פ & די סיסטמס בע"מ</td><td>403-ML-050</td><td>20 ומיקרו; גרם/מ"ל הוא 2,000x</td></tr><tr><td>FLT-3 Ligand</td><td>Miltenyi Biotec Inc. ארה"ב</td><td>130-096-480</td><td>100 ומיקרו; גרם/מ"ל הוא צלחות 1,000x</td></tr><tr><td>12 בארות, Costar</td><td>Corning Inc.</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara Bio Inc</td><td>T100A/B</td><td>השעיה ב-50 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>פרוטמין סולפט</td><td>סיגמא</td><td>P-4020</td><td>4 ומיקרו; g/ml הוא 1,000x</td></tr><tr><td colspan="4"> Confocal and Two-photon Microscopy</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro, Mediatech Inc.</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תחתונה מזכוכית P35G-0-20-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבות תחתונה מזכוכית P35G-0-14-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate Coverglass; 4 בארות</td><td>Thermo Scientific</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 22 מ"מ מס' 2</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>6662-Q55</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 AOBS מיקרוסקופ קונפוקלי ורב-פוטוני חמישה ערוצים</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision II -TiSaph טווח לייזר 680-1,080 ננומטר</td><td>קוהרנטי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>זיקית קומפקטית טווח לייזר OPO 1,030-1,350 ננומטר</td><td>קוהרנטי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA מטרת טבילה במים (WD=2.5 מ"מ)</td> <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA אובייקט יבש (WD=0.6 מ"מ)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA מטרת טבילה במים (WD=0.6 מ"מ)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Imaris גרסה 7.6</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

פיתחנו ומאומתים ניאון סימון המתודולוגיה למעקב משובט של תאי גזע hematopoietic ואב (HSPCs) עם רזולוציה מרחב ובזמן גבוהה ללמוד בhematopoiesis vivo תוך שימוש במודל ניסיוני להשתלת מח העצם עכברי. קומבינטורית גנטי סימון באמצעות וקטורי lentiviral קידוד חלבוני ניאון (fps) אפשר מיפוי גורל תא באמצעות הדמיה מיקרוסקופית מתקדמת. וקטורי קידוד חמישה FPS שונה: Cerulean, EGFP, ונוס, tdTomato, וmCherry שמשו לtransduce מקביל HSPCs, יצירת צבעים מגוונים של תאי צבע מסומן. הדמיה באמצעות מיקרוסקופ ההיברידי confocal / שני פוטונים מאפשרת הערכה בו זמנית ברזולוציה גבוהה של תאים מסומנים באופן ייחודי וצאצאיהם בשיתוף עם רכיבים מבניים של הרקמות. נפח ניתוחים על פני שטחים גדולים מגלה כי ניתן לאתר תאים נגזרים HSPC מקודדים ספקטרלי הלא פולשני ברקמות שלמות שונות, כוללים מח העצם (BM), לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה. מחקרים חיים שילוב multiphoton וידאו שער והזמן לשגות הדמיה confocal ב4D להדגים את האפשרות של מעקב סלולארי ומשובט דינמי באופן כמותי.

ההר-כל confocal 3D שחזורי מיקרוסקופיה / 2 פוטונים של קורס זמן מח עצם sternal חשף את הקליטה ולהרחבה של שיתוף 5fps המושתל בתבנית עם מאפיינים ראויים לציון: שיבוטים הופיעו מסומנים בצורה ברורה, מסומן homogenously עם פלטה רחבה של צבעים בתחילה והתקדמות לאורך זמן כדי להכיל באופן מועדף תאים של בעיקר בצבע אחד. התקנת מיקרוסקופיה confocal ודוגמאות מייצגות של HSPC המסומן 5fps הדמיה במוח עצם sternal הן באיור 2 וסרטים 1 ו -2. <p class="jove_content" style=";...

5 חלבוני ניאון קומבינטורית סימון של תאי גזע ואבות היווצרות הדם מאפשר במעקב משובט vivo באמצעות confocal ושני פוטונים במיקרוסקופ, מתן תובנות ארכיטקטורת hematopoietic מח העצם במהלך רגנרציה. שיטה זו מאפשרת מיפוי גורל לא פולשנית של תאים נגזרים HSPCs ספקטרלי מקודדים ברקמות שלמות לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעקוב אחר שיבטורים המטופואטיים המסומנים פלואורסצנטית ברקמות חיות, כולל במח העצם, באמצעות אסטרטגיה חדשנית של מיקרוסקופיה קונפוקלית ודו-פוטונית. לשם כך, מבודלים תאי אב ותאי גזע המטופואטיים של עכברים ומבצעים להם טרנסדוקציה משותפת עם וקטורים לנטיביריים של גנטיקה של גנים (gene ontology) או וקטורי Lego המקודדים לחמישה חלבונים פלואורסצנטיים: Ian, EGFP, Venus, TD tomato ו-m cherry. התאים שעברו טרנסדוקציה מושתלים לאחר מכן בעכברי מקבל שעברו דה-מיאלינציה (myelo ablated), ולאחר פרקי זמן של עד 120 ימים, נאספים מח העצם ואיברים מעכברי המקבל ומתבצעת מיקרוסקופיה משולבת קונפוקלית ודו-פוטונית.התמונות שהתקבלו משוחזרות בתלת-ממד כדי לעקוב אחר מיקומם של שיבוטים ותאים מושתלים המסומנים פלואורסצנטית לאורך זמן. דבר זה מקל על חקר האבולוציה הקלונלית במהלך ההמטופויזה וגורלם של תאים המופקים ממח העצם באיברים אחרים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני חיתוך פיזי של רקמות הוא שהיא משלבת את היתרונות של דימוי ברזולוציה גבוהה עם חיתוך אופטי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וויזואליזציה של רכיבים מבניים באמצעות מיקרוסקופיית twofold on.שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ההמטולוגיה, כגון אנליזה קלונאלית מרחבית וזמנית של ההמטופואזה במהלך התחדשות מח העצם החל משלבי ההשתבצות המוקדמים, עם שמירה גיאוגרפית של קלונים מתרחבים לאורך זמן. ניתן לבחון נפחים גדולים מאוד של רקמה דחוסה ושלמה. לדוגמה, כ-3000 תמונות שוחזרו באופן חישובי כדי להמחיש קלונים מסומנים בצבע בעצם החזה (sternal fau). אף על פי ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הארכיטקטורה הקלונאלית בהמטופואזה תקינה או משובשת, ניתן ליישמה גם בחקר התחדשות איברים, תגובות חיסוניות או דפוסי גרורות של גידולים.בנוהל זה, וקטורים לביטוי גנים לנטיביריים (lentiviral gene ontology) או וקטורי Lego מקודדים לחמישה חלבונים פלואורסצנטיים: EGFP, Venus, Tdtomato ו-mCherry. כל חלבון פלואורסצנטי מבוטא באמצעות מקדם חזק וקונסטיטוטי של נגיף הגורם להתמקד בטחול (spleen focus forming virus) או SFFV. לאחר ייצור וקטורי Lego המקודדים לחלבונים הפלואורסצנטיים וטיטרציה של החלקיקים הנגיפיים, יש לאסוף את מחית העצם מהגפיים הקדמיות והאחוריות של עכברי תורם שהוקרבו, על ידי נשף של ההומרוס, הפמורוס והטיביה.השתמש בסקאלפל כדי להסיר ביסודיות את כל רצועות השרירים והרקמות העודפות מהעצמות. לאחר מכן, חתוך לרוחב קצהו של כל עצם קרוב ככל האפשר למפרק. באמצעות מחט בכילייב 27 במזרק המכיל I 10 medium, שטוף את מחית העצם לתוך מבחנה קונית לצנטריפוגה בנפח 50 milliliter; צנטריפוגה ב-500 G ובטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius כדי להשקיע את התאים.לאחר השליפה של הנוזל העליון (supernatant) כדי לבצע ליזה של תאי הדם האדומים, יש להוסיף 50 milliliters של CK buffer ולסובב בצנטריפוגה כפי שבוצע קודם לכן, לאחר מכן יש לשלוף את הנוזל העליון ולחזור על הפעולה לאחר השליפה של הנוזל העליון השני. יש להשעות מחדש את התאים ב-10 milliliters של מצע I 10. לאחר מכן, יש להשתמש בערכת max lineage depletion כדי לטהר תאי פרוגניטור lineage-negative, בהתאם לפרוטוקול הערכה המעודכן המפורט במסמך המצורף.לאחר טיהור התאים השליליים לסמני השושלת (lineage negative), זרע אותם בבקבוק T 75 בצפיפות של 5×10⁵ תאים למליליטר במצע stem span המועשר ב-murine IL-3, murine IL-11, human FL3 ligand ו-murine stem cell factor. דגור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 למשך 48 שעות. לאחר יומיים, השתמש במגרדת תאים (cell scraper) כדי להחזיר את התאים לתליה והעבר 1-4×10⁵ תאים לכל באר בלוחית 12 בארות. הוסף לתאים וקטורים ב-MOI של 6-7 לכל אחד, במצע stem span עם ציטוקינים ו-4 µg/mL של protamine sulfate.כדי להביא את הנפח הכולל בכל באר לאחד מיליליטר, הקפידו להכין בקרת צבע בודדת עבור כל חלבון פלואורסצנטי. לאחר 24 שעות, השביהו מחדש את התאים באמצעות גורד (scraper) והעבירו אותם לשפופרת צנטריפוגה של חמישה מיליליטר. לאחר מכן, בצעו צנטריפוגה והשביהו אותם מחדש במדיום stem span ללא ציטוקינים; בצעו צנטריפוגה שנית והשביהו את התאים ב-100 microliters של מדיום stem span ללא ציטוקינים לכל הזרקה, או לצורך מיקרוסקופיה קונפוקלית או ציטומטריית זרימה.העבירו אותם לפלטות של 12 בארות המכילות מצע טרי עם ציטוקינים והדגירו למשך 96 שעות נוספות. כהכנה להשתלת מחית העצם, הניחו עכברי מקבלים שהוקרנו בכלוב תחת מנורת חימום בזמן שהעכברים מתחממים. הכינו מזרקים להזרקה עם 1 עד 4 פעמים 10⁵ תאים lineage negative ב-100 µL של stem span לכל עכבר.הכינו מזרק אחד עבור כל עכבר. כאשר ורידי הזנב מורחבים, העכברים מוכנים להזרקה. הניחו את העכבר המיועד להזרקה במכשיר קיבוע לעכברים וחטאו את הזנב בעזרת פד ספוג ב-70% ethanol.שלב זה מאפשר גם ויזואליזציה טובה יותר של וריד הזנב. לאחר מכן, הזרק את התאים לתוך וריד הזנב. בצע השתלה לקוהורט שלם של בעלי חיים עם אותה אוכלוסייה של תאי מח עצם תורמים שעברו טרנסדוקציה בנקודות זמן שונות עד ל-120 ימים לאחר ההשתלה.הוצא את הרקמות והאיברים לצורך הדמיה שלמים ללא חיתוך. הנח איברים בודדים בצלחות תרבית עם כיסוי זכוכית מספר 0 בגודל 35 מילימטר, ב-50 עד 100 µL של PBS קר לצורך הדמיית time-lapse.הנח את האיברים ב-DMEM 10%FBS המכיל 20 millimolar heaps בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ובצע הדמיה באופן מיידי. כאן המיקרוסקופיה מבוצעת באמצעות מערכת קונפוקלית ומולטי-פוטון של Leica SP five five channel הפוכה, המצוידת בלייזרים נראים של argon diode 561 nanometer, helium neon 594 nanometer ו-helium neon 633 nanometer. הנח אחת מהדגימות שעברו טרנסדוקציה של Lego בודד עלבמת המיקרוסקופ ובצע פוקוס.אספו ערימות תמונות למבדה במרווחי רוחב פס של חמישה ננומטרים המכסים את כל ספקטרום האור. לאחר מכן, השתמשו בתוכנה כדי לבחור אזור עניין בתמונה וצפו בהיסטוגרמה של ספקטרום הייחוס. שמרו נתונים אלו.לאחר מכן, חזור על תהליך זה עבור כל חלבון פלואורסצנטי בניסוי. בשלב הבא, השתמש בספקטרום שנאסף מחלבונים פלואורסצנטיים בודדים כדי לקבוע את רוחב הפס (bandwidth) במצב ערוצים (channel mode). כדי לבצע זאת עבור כל ערוץ, לחץ על הסליידר השחור והזן את רוחב הפס שבו ייעשה שימוש.יש לבחור רוחב פס שיקיף את אזור השיא של ספקטרום העירור של כל אחד מהחלבונים הפלואורסצנטיים, תוך הבטחה שאין חפיפה בין הערוצים הפלואורסצנטיים. הגדירו את ה-gain וה-offset עבור כל גלאי כך שהטווח הדינמי של פלט הדגימה יהיה ברמה ניתנת לגילוי, דומה בין החלבונים הפלואורסצנטיים וללא רוויה. לדוגמה, חלבון M cherry בהיר בערך בחצי מ-EGFP, לכן יש לכוונן את ה-gain וה-offset כדי להשיג טווח דינמי דומה עבור שניהם.לבסוף, במצב ערוצים (channel mode), צלם תמונה של כל דגימת ביקורת בצבע בודד באמצעות כל חמשת הערוצים, וודא שכל חלבון פלואורסצנטי נראה רק בערוץ המתאים לו ואינו מופיע בשאר הערוצים. לאחר שספקטרום כל הערוצים תוקף, שמור את ההגדרות. ניתן לייבא ולהשתמש בהן בניסויים עתידיים המשתמשים באותם חלבונים פלואורסצנטיים ובאותה רקמת דגימה.כאן מודגמת שילוב של מיקרוסקופיה קונפוקלית ודו-פוטונית במוחי עצם של עצם החזה, תוך שימוש בסקלפל ופינצטה לחיתוך עצם החזה לאורך המישור הסגיטלי. לאחר מכן, בצעו חיתוך טרנסוורסלי במפרק שבין שתי גומחות החזה. הניחו את העצמות כאשר הפנים החתוכה פונה כלפי מטה בתוך צלחת תרבית של זכוכית כיסוי מספר 0 בקוטר 35 מילימטר המכילה 50 עד 100 µL של PBS קר; הדמיון יתבצע דרך הפנים החתוכה.בדקו את מיקום העצמות תחת מיקרוסקופ דיסקציה. מקמו את הדגימה על במת המיקרוסקופ. לאחר מכן, הגדירו את תוכנת ההדמיה ללכידה רצפית של אות two photon עם second harmonic generated.לאחר מכן בצע עירור קונפוקאלי בחמישה צבעים. הגדר את גבולות אזור האיסוף של ה-Z-stack עם גודל צעד של 5 microns בטווח של 150 עד 300 microns. השתמש בפונקציית ה-tile כדי להנחות את התוכנה להפיק באופן אוטומטי נפחים מאוחים הכוללים את כל ה-sternum Fosse, בשטח של כ-2.5 על 1.2 square millimeters בכיווני XY.התחל את הלכידה כדי לאסוף באופן רציף תמונות X, Y, Z בכל חמישה ערוצים, בתוספת מיקרוסקופיית פוטון כפול עם אות של הרמונית שנייה שנוצרה מעצם וקולגן סיבי לצורך דימוי time-lapse ב-4D. הנח דגימות טריות שחולצו ללא חיתוך של קשרי לימפה פופליטיאליים, טחול, ריאה או עצם הגולגולת (calvarial bone) על מנות תרבית של זכוכית כיסוי מספר 0 במידה של 35 מילימטר, ב-50 עד 100 µL של DMEM עם 10% FBS ו-20 mM HEPES בטמפרטורה של 37 °C.הניחו את הדגימה על במה המיקרוסקופ המחוממת. לאחר מכן, שנו בתוכנה את פרמטרי הלכידה לשימוש בעירור דו-פוטוני של טיטניום-ספיר (titanium sapphire) ב-860 nanometers, בשילוב עם עירור קונפוקאלי וסורק רזוננס של Leica ב-8,000 hertz לשנייה. לצורך לכידת Z stacks ברוחב 80 micron במרווחים של 22 שניות למשך עד שעה, ולביצוע דימוי דו-פוטוני תלת-צבעי סימולטני, הגדירו בתוכנה להשתמש בטיטניום-ספיר מכוון ל-860 nanometers בו-זמנית עם לייזר OPO מכוון ל-1,130 nanometers עבור TD tomato או ל-1,140 nanometers עבור M cherry.לבסוף, התחילו את הלכידה לאיסוף ארבע תמונות D. כפי שנעשה קודם לכן, לאחר איסוף כל התמונות, בצעו שחזור ואנליזה בתלת-ממד (3D) ובארבעה ממדים (4D) באמצעות גרסת Amer 64 bit או תוכנה דומה. פתחו את תמונת ה-Zack ובחרו ב-surpass כדי להציג את ויזואליזטור הנפח התלת-ממדי.לאחר מכן, השתמש בכלי ה-Navigate כדי לסובב את הנפח ב-360 מעלות. בשלב הבא בחר באנימציה. השתמש ב-key frames כדי להוסיף תצוגות נבחרות, זום וסיבובים של הנפח.צפו בתצוגה המקדימה של הסרט ועבדו אותו כנדרש. לבסוף, שמרו את הקובץ בפורמט הווידאו הרצוי כדי לעקוב אחר ההיסטוריה הקלונאלית של תאי גזע ותאי פרוגניטורים המטופואטיים המסומנים פלואורסצנטית. תאי תורם שעברו טרנסדוקציה משותפת עם חמישה וקטורי Lego שונים הושתלו בעכבר מקבל, ומח העצם של עצם החזה דומיין ואנולף כפי שמתואר בסרטון זה.ארבעה ימים לאחר ההשתלה, נראו מקבצי תאים המסומנים במגוון רחב של צבעים בקרבה רבה לקצה העצם, המוצג בצבע לבן. עד היום ה-31, קלון גדול בצבע צהוב-ירוק ייחודי התרחב עד שתפס את כל ה-Fosse, כפי שמוצג בתמונות הממוזגות וכן בתמונות הערוץ הבודד. ניתוח תוכן של ה-FPS הדגים סימון הומוגני על ידי שני וריאנטים של FPS, EGFP ו-Venus.סרטון שחזור תלת-ממדי זה מדגים את הארכיטקטורה המרחבית של השיבטים המסומנים העטופים בעצם העשן. תמונה זו מראה דוגמה לתאים ממקור של מח עצם בקשרי לימפה פופליטאיים 120 ימים לאחר השתלה. תאים מפוזרים מסומנים בעיקר בצהוב ובאדום, והם מוקפים היקפית בסיבי קולגן המוצגים בלבן בלב כפי שנראה מהצד האפיקרדיאלי.תאים בודדים רבים נראים כמפוזרים בין התאי השריר של הלב (cardiomyocytes) המוצגים בלבן, אשר הודגשו באמצעות אוטופלואורסצנציה של שני פוטונים באורך גל של 780 nanometers. לאחר ששולטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר ימים אם היא מבוצעת כהלכה. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי ההתחדשות וההתפתחות של איברים, ואפשרה לביולוגים לחקור סידורים מרחביים-זמניים של אלמנטים תאיים ומבניים מורכבים קלונלית באמצעות סימון רב-צבעי ודימוי קונפוקאלי ושל שני פוטונים.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה מעמיקה לגבי פיתוח מתודולוגיית סימון פלואורסצנטי למעקב אחר סימון קלונאלי של תאי גזע ותאי פרוגניטור המטופואטיים באיברים חיים.

in-vivo-clonal-tracking-hematopoietic-stem-progenitor-cells-marked

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

להערכת טיפולים בתאי גזע חדש חשוב הלא פולשני המסלול התאים מוזרקים in vivo. סרט הווידאו הזה יראה לכם כיצד לתייג אדם בתאי גזע mesenchymal ו עובריים עם סוכני תחמוצת ברזל מבוסס בניגוד in vivo עבור הבאים MR הדמיה in vivo.

תיוג hESCs ו hMSCs עם ברזל אוקסיד חלקיקים עבור פולשני של מעקב vivo עם MR Imaging

שיטה לנתח את התפלגות אבות היווצרות הדם במח העצם ב cytometry זרימה, כמו גם ביעילות לבודד מטוהרים מאוד בתאי גזע hematopoietic (HSCs) מתואר. הליך הבידוד מבוסס בעיקרו על העשרת המגנטי של כ-Kit תאים + תא מיון לטהר HSCs ללימודי תאית ומולקולרית.

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

מקור: Gómez-Villafuertes, R., et. al., הדמיה חיה ואחריה מעקב אחר תא בודד כדי לנטר את הביולוגיה של התא ואת התקדמות השושלת של אוכלוסיות עצביות מרובות. J. Vis. exp. (2017)} } וידאו מדגים את תהליך ההכנה, ההדמיה והמעקב אחר תאי גזע עצביים בוגרים בזמן אמת כדי לחקור התנהגויות תאיות, כולל חלוקה והתמיינות.

 הדמיה חיה ומעקב אחר תא בודד לניטור שושלת עצבית בתאי גזע עצביים בוגרים

פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח, הרחבה, ובתחום ההדמיה vivo של תאי NK הנגזרים מhESCs וiPSCs.

פיתוח, הרחבה, ו<em&gt; בvivo</emתאי גזע pluripotent&gt; ניטור של תאי NK אדם מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ומושרה (iPSCs)

המוני רקמות מורכבים, מאיברים לגידולים, מורכבים מאלמנטים הסלולר שונים. אנו הובהר התרומה של פנוטיפים הסלולר בתוך רקמת ניצול עכברים הטרנסגניים ניאון רב שכותרתו בשילוב עם מכתים immunofluorescent multiparameter אחרי unmixing רפאים לפענח מוצא תא, כמו גם מאפייני תא המבוססים על ביטוי חלבון.

כמותיים Multispectral ניתוח בעקבות השתלת רקמות פלורסנט וליזואליזציה של מקורות ניידים, סוגים, ואינטראקציות

מדידת כמותית של פונקצית אב עצם בריפוי שבר דורשת טכנולוגיית הדמיה סידורי ברזולוציה גבוהה. הנה, פרוטוקולים ניתנים לשימוש במיקרוסקופיה intravital ומעקב osteo שושלת ברצף תמונה ולכמת את ההגירה, השגשוג והתמיינות של תאי גזע / אב osteogenic אנדוגני בתהליך של תיקון שברים בעצמות.

עוקב<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה של תאי גזע / אב osteogenic במהלך תיקון שבר

הטבע של האינטראקציות בין תאי גזע hematopoietic ואב (HSPCs) ונישות מח עצם הוא הבין היטב. שינויי חומרה מותאם אישית ופרוטוקול רכישה רב שלבים לאפשר את השימוש בשני הפוטונים ומיקרוסקופיה confocal לתמונת vivo לשעבר HSPCs שכותרתו התביית בתוך אזורי מוח עצם, אינטראקציות מעקב ותנועה.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

מונוציטים הם מווסתים מרכזיים של חסינות מולדת וממלאים תפקיד קריטי בחידוש המערכת הפגוציטית החד-גרעינית ההיקפית ובמקרה של דלקת. כתב יד זה מתאר את הליך ההדמיה בזמן אמת של מח העצם של קלווריה של העכבר כדי לחקור את מנגנון הגיוס של המונוציטים.

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים<em&gt; In vivo</em

במאמר זה אנו מתארים את העקרונות לתכנון וביצוע ניסוי מעקב שושלת רב-צבעוני באמצעות עכברי R26R-Confetti. אנו מספקים פרוטוקול ספציפי למעקב אחר תאי אפיתל בקרנית שניתן לשנות עבור רקמות אחרות מעניינות.

שיטה לאיתור שושלת של תאי קרנית באמצעות עכברים כתב ניאון רב-צבע

מיקרוסקופ זריחה intravital (IVFM) של החילונית מוחל בשילוב עם דגמים גנטיים בעלי חיים כדי ללמוד את יונת ואת engraftment של תאים hematopoietic גומחות מח עצם (מוניטור).

שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי Intravital (IVFM) עם דגמים גנטיים בחקר דינמיקה Engraftment Hematopoietic תאים במח העצם נישות

למדו מעקב אחר תאי גזע hematopoietic מסומנים בחמישה חלבונים פלואורסצנטיים באמצעות מיקרוסקופיית confocal ו-multiphoton. שיטה זו מאפשרת מיפוי קלונלי וניתוח התנהגות תאים ברקמות חיות לאורך זמן.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

גלה סרטונים נוספים