Name: מבחני כתב מקבילים מסיבי בתאי יונקים בתרבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: למד כיצד לבצע מבחני כתב מקבילים מסיביים בתאי יונקים בתרבית. שיטה זו מאפשרת ניתוח רגולציה גנטית בקנה מידה גדול באמצעות ריצוף עמוק וניתוח חישובי של אלפי רצפי DNA במקביל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומי לחקר גנום אדם במכון המחקר של המכון הלאומי לבריאות בפרס מספר R01HG006785.

<ol><li>Kinney, J., Murugan, A., Callan, C. G., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+deep+sequencing+to+characterize+the+biophysical+mechanism+of+a+transcriptional+regulatory+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Using deep sequencing to characterize the biophysical mechanism of a transcriptional regulatory sequence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (20), 9158-9163 (2010).</li>
<li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 271-277 (2012).</li>
<li>Patwardhan, R. P., Lee, C., Litvin, O., Young, D. L., Pe’er, D., Shendure, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+analysis+of+DNA+regulatory+elements+by+synthetic+saturation+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-resolution analysis of DNA regulatory elements by synthetic saturation mutagenesis.</a> Nature Biotechnology. 27 (12), 1173-1175 (2009).</li>
<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
<li>Arnold, C. D., Gerlach, D., Stelzer, C., Boryń, ŁM., Rath, M., Stark, A. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArnold%2C+CD+%22Science+%28New+York%2C+N.+Y.%29%22">Science (New York, N. Y.)</a>. 339 (6123), 1074-1077 (2013).</li>
<li>Kheradpour, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+of+regulatory+motifs+in+2000+predicted+human+enhancers+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection of regulatory motifs in 2000 predicted human enhancers using a massively parallel reporter assay.</a> Genome Research. 23 (5), 800-811 (2013).</li>
<li>White, M. A., Myers, C. A., Corbo, J. C., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+in+vivo+enhancer+assay+reveals+that+highly+local+features+determine+the+cis+-regulatory+function+of+ChIP-seq+peaks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Massively parallel in vivo enhancer assay reveals that highly local features determine the cis -regulatory function of ChIP-seq peaks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (29), 11952-11957 (2013).</li>
<li>Mogno, I., Kwasnieski, J. C., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+synthetic+promoter+assays+reveal+the+in+vivo+effects+of+binding+site+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Massively parallel synthetic promoter assays reveal the in vivo effects of binding site variants.</a> Genome Research. 23 (11), 1908-1915 (2013).</li>
<li>Schütze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410 (1), 155-157 (2011).</li>
<li>Panne, D., Maniatis, T., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atomic+model+of+the+interferon-beta+enhanceosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An atomic model of the interferon-beta enhanceosome.</a> Cell. 129 (6), 1111-1123 (2007).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

MPRA הוא כלי גמיש ורב-עוצמה לניתוח קשרי רצף-פעילות באלמנטים מווסתים של גנים. הצלחת ניסויי MPRA תלויה בשלושה גורמים לפחות: 1) תכנון קפדני של ספריית הרצפים, 2) מזעור חפצים במהלך הגברה ושיבוט, ו-3) יעילות טרנספקציה גבוהה. 
האורכים האפשריים של האזורים המשתנים במבני המדווח נקבעים במידה רבה על ידי טכנולוגיית הסינתזה או השיבוט בה נעשה שימוש. OLS סטנדרטי מוגבל בדרך כלל לכ-200 nt, אך פרוטוקול זה תואם לתוספות של עד לפחות 1,000 nt. שימו לב שאזורים משתנים שחוזרים על עצמם מאוד או מכילים מבנים משניים חזקים עלולים בסופו של דבר להיות מיוצגים בתת-ייצוג עקב הטיות PCR ושיבוט. אורך התגים המזהים כל אחד מהאזורים המשתנים צריך להיות 10-20 nt ואוסף התגים צריך להיות מתוכנן באופן אידיאלי כך שיהיו לפחות שני הבדלים נוקלאוטידים בין כל זוג. יש להימנע גם מתגים המכילים את רצפי הזרעים של מיקרו-RNA ידוע או גורמים אחרים שעשויים להשפיע על יציבות ה-mRNA במידת האפשר.
פרמטר מרכזי בתכנון ניסויי MPRA הוא המספר הכולל של מבני מדווח נפרדים שייכללו בספרייה (מורכבות התכנון, מסומנת CD). בפועל, CD מוגבל על ידי מספר התאים המתורבתים שניתן להעביר. ככלל אצבע, המספר הכולל של תאים שעברו טרנספטציה צריך להיות גדול לפחות פי 50-100 מ-CD. לדוגמה, אם ניתן להעביר 20 מיליון תאים ביעילות טרנספקציה של 50%, אז CD צריך להיות לא יותר מ-~200,000. שימו לב ש-CD שווה למספר גרסאות הרצף הרגולטוריות המובחנות כפול מספר התגים המובחנים לכל רצף. ככל שתגים מובחנים יותר מקושרים לכל רצף רגולטורי, כך ניתן לבצע הערכה מדויקת יותר של הפעילות של אותו רצף (מכיוון שניתן לחשב ממוצע של מדידות מתגים נפרדים), אך ניתן לבחון פחות גרסאות שונות בניסוי אחד. הבחירה האופטימלית תלויה בתכנון הניסוי. בניסוי פשוט של "התנגשות מקדם", שבו מודל מתמטי יותאם למדידות המצטברות, בדרך כלל מספיק תג בודד לכל וריאנט. במסך לפולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים הגורמים לשינויים בפעילויות הרגולציה, ייתכן שיהיה צורך להשתמש ב-20 תגים או יותר לכל אלל כדי לקבל תוצאות חזקות סטטיסטית, מכיוון שהשוואה בין כל זוג אללים דורשת בדיקת השערה נפרדת. 
אם הרצפים שייבדקו אינם צפויים להכיל אתרי התחלת שעתוק, ניתן להוסיף מקדם קבוע גם באותו מקטע. לדוגמה, pMPRAdonor2 (Addgene ID 49353) כולל מקדם TATA-box מינימלי שימושי כאשר לאזור המשתנה במעלה הזרם צפויה להיות פעילות משפרת משמעותית, בעוד ש-pMPRAdonor3 (Addgene ID 49354) כולל מקדם ויראלי SV40 מותאם וחזק ששימושי כאשר האזור המשתנה צפוי להכיל פעילות משתיק קול או אלמנטים רגולטוריים שליליים אחרים. 
מוצרי OLS גולמיים מכילים לרוב חלק משמעותי של אוליגונוקלאוטידים קטומים. אלה עלולים להפריע להגברת PCR מדויקת של הרצפים המתוכננים, במיוחד כאשר יש הומולוגיה משמעותית ביניהם. שימוש בטיהור PAGE להסרת תוצרי סינתזה קטומים ו-PCR תחליב כדי למזער חפצי הגברה הם טכניקות יעילות להבטחת איכות ספרייה גבוהה. אם אחד השלבים אינו מעשי, הכרחי למזער את מספר מחזורי ה-PCR המשמשים בכל שלב הגברה. בחירה והרחבה של הספרייה המשובטת בתרבית נוזלית מספיקים בדרך כלל כדי לשמור על מורכבות העיצוב, אך אם יש להשתמש בווקטורים המועדים לרקומבינציה או נצפית הטיית ייצוג משמעותית, ניתן במקום זאת לצפות את התאים המשוחזרים ישירות על לוחות אגר LB גדולים, להרחיב אותם כמושבות בודדות ולאחר מכן לגרד אותם לבידוד DNA. חשוב גם לקחת בחשבון את ההשפעה הפוטנציאלית של שגיאות סינתזה, שנמצאות בדרך כלל בשיעור של 1:100-500 ב-OLS. מומלץ לבצע ריצוף באורך מלא של מבני המדווח לפני הטרנספקציה כדי לזהות ולתקן שגיאות כאלה.
אין צורך להכניס מבני מדווח לכל תא בתרבית המועברת, אך יעילות טרנספקציה מתחת ל-~50% עלולה להוביל ליחסי אות לרעש גרועים. רצוי לייעל את תנאי הטרנספקציה לפני ביצוע ניסויי MPRA בסוג תא חדש. כאשר עובדים עם סוגי תאים קשים לטרנספטקט, ניתן להגביר את אותות MPRA על ידי בחירה מראש של תאים שעברו טרנספטציה. סדרת וקטורי ה-pMPRA כוללת גרסאות המבטאות באופן מכונן סמן פני תא קטום שניתן להשתמש בו להעשרה פיזית עבור תאים שעברו טרנספטציה לפני בידוד RNA (לדוגמה, מזהי Addgene 49350 ו-49351).

A correction to the author list has been made for article <a href="http://www.jove.com/video/51719">Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells</a>.

Erratum: Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

מבחני כתב מקבילים מסיבי (MPRA) מאפשרים מדידה מרובבת של פעילות הרגולטורית תעתיק של אלפים למאה אלפי רצפי DNA 1 7. ביישום הנפוץ ביותר שלהם, ריבוב מושגת על ידי צימוד כל רצף של עניין לגן כתב סינטטי המכיל תג זיהוי רצף במורד הזרם של מסגרת קריאה פתוחה (ORF; איור 1). בעקבות transfection, בידוד RNA ורצף עמוק של קצוות &quot;3 של תעתיקי גן הכתב, הפעילויות היחסית של הרצפים בשילוב ניתן להסיק מהשפע היחסי של תגי זיהוי שלהם. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig1highres.jpg" /> איור 1 סקירה כללית של MPRA. ספרייה של כתב MPRA בונה בנויה על ידי צימוד רצפים רגולטוריים המשוערת לסינטטיגני כתב שיכללו &quot;אינרטי&quot; ORF (כגון GFP או לוציפראז) ואחריו תג זיהוי רצף. הספרייה היא transfected בהמוניהם לאוכלוסייה של תאים בתרבית וmRNA הכתב עיבד הוא התאושש לאחר מכן. רצף עמוק משמש לספירת מספר המופעים של כל תג בקרב mRNAs הכתב ופלסמידים transfected. היחס של mRNA סופר על יכול לשמש ספירת פלסמיד להסיק הפעילות של רצף הרגולציה המתאים. מותאם באישור מלניקוב, et al 2. ניתן להתאים MPRA למגוון רחב של עיצובים ניסיוניים, כולל 1 mutagenesis) המקיף של יסודות רגולציה גן בודד, 2 סריקה) לאלמנטים רגולטוריים רומן על פני מוקד של עניין, 3) בודק את ההשפעה של שונות גנטיות טבעיות בקבוצה של משוער יזמים, משפרי או משתיקי קול, ו4) הנדסה למחצה רציונאלית של אלמנטים רגולטוריים סינטטיים. ליbraries של גרסאות רצף יכול להיות שנוצר תוך שימוש במגוון של שיטות, כולל סינתזת ספריית oligonucleotide (OLS) על microarrays תכנות 2,3,6,7, הרכבה של oligonucleotides המנוון 1,4, קשירה קומבינטורית 8 ופיצול של הדנ&quot;א הגנומי 5. פרוטוקול זה מתאר בנייה של ספרייה של אמרגן גרסאות באמצעות OLS ווקטורי pMPRA1 וpMPRAdonor1 (Addgene מזהים 49,349 ו49,352, בהתאמה; http://www.addgene.org), transfection החולף של ספרייה זו לתאי יונקים בתרבית וquantitation הבא של פעילויות האמרגן ידי רצף עמוק של התגים הקשורים בם (Tag-Seq). גרסאות קודמות של פרוטוקול זה היו בשימוש במחקר דיווח מלניקוב et al. טבע 30 ביוטכנולוגיה, 271-277 (2012) ובKheradpour et al. הגנום 23 מחקר, 800-811 (2013).

<table><tbody><tr><td>סינתזת ספריית אוליגונוקלאוטידים</td><td>Agilent, CustomArray, או ספקי OLS אחרים</td><td>מותאמים אישית</td><td>אם משתמשים בשיטת בנייה של OLS</td></tr><tr><td>pMPRA1</td><td>Addgene</td><td>49349</td><td>MPRA עמוד שדרה פלסמיד</td></tr><tr><td>pMPRAdonor1</td><td>Addgene</td><td>49352</td><td>luc2 ORF תורם פלסמיד</td></tr><tr><td>TE 0.1 מאגר (10 מ"מ Tris-HCl, 0.1 מ"מ EDTA, pH 8.0)</td> <td>מאגר OLS</td> <td>גנרי</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Novex ג'לים TBE-Urea, 10%</td> <td>Life Technologies</td><td>EC6875BOX</td><td>PAGE טיהור מוצרי</td></tr><tr><td>OLS Novex TBA-Urea Sample Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC6876</td><td>PAGE טיהור</td>מוצרי</tr><tr><td>OLS SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain Life</td><td>Technologies</td><td>S-11494</td><td>PAGE טיהור מוצרי OLS</td></tr><tr><td>תחליב DNA מיצלולה & ערכת טיהור</td><td>EURx/CHIMERx</td><td>3600-01</td><td>הגברת ספרייה על ידי אמולסיה PCR</td></tr><tr><td>הרקולאז II היתוך DNA פולימראז</td><td>Agilent</td><td>600675</td><td>פולימראז לאמולסיה PCR</td></tr><tr><td>SfiI</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0123S</td><td>שיבוט ספרייה עם וקטורי pMPRA</td></tr><tr><td>KpnI-HF</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R3142S</td><td>שיבוט ספרייה עם וקטורי pMPRA</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>חדש שיבוט</td> ספריית England <td>Biolabs R0145S</td><td>עם וקטורי pMPRA</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase (2,000,000 יחידות/מ"ל)</td><td>שיבוט ספריית New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>עם וקטורי pMPRA</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Electrocomp E. coli</td><td>Life Technologies</td><td>C4040-50</td><td>שיבוט ספרייה עם וקטורי pMPRA</td></tr><tr><td>אגר LB ומדיה נוזלית עם קרבניקלין</td><td>Generic</td><td>n/a</td><td>מדיית גידול עבור שיבוט</td></tr><tr><td>E-Gel EX Gels 1%</td> <td>Life Technologies</td><td>G4010-01</td><td>אימות וטיהור ספרייה</td></tr><tr><td>E-Gel EX Gels, 2%</td><td>Life Technologies</td><td>G4010-02</td><td>אימות וטיהור ספרייה</td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>טיהור ספרייה ועמוד שדרה</td></tr><tr><td>EndoFree פלסמיד ערכת מקסי</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>בידוד DNA של ספרייה</td></tr><tr><td>מדיה של תרבית תאים</td><td>n/a</td><td>n/a</td> ריאגנטים <td>טרנספקציה ספציפיים לניסוי</td></tr><tr><td></td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>MicroPoly(A)Purist Kit</td> ספציפי לניסוי <td>Life Technologies</td><td>AM1919</td><td>בידוד mRNA</td></tr><tr><td>TURBO ערכת נטולת DNA TURBO Life</td><td>Technologies</td><td>AM1907</td><td>הסרת DNA פלסמיד</td></tr><tr><td>SuperScript III חיי מערכת סינתזה של גדיל ראשון</td><td> טכנולוגיות</td><td>18080-051</td><td>סינתזת cDNA</td></tr><tr><td>PfuUltra II Hotstart PCR Master Mix</td><td>Agilent</td><td>600850</td><td>פולימראז עבור פריימרים PCR של Tag-Seq</td></tr><tr><td>(ראה טקסט)</td> <td>IDT</td><td>מותאם אישית</td><td>PAGE טיהור פריימרים Tag-Seq</td></tr></tbody></table>

מבחני כתב מקבילים מסיבי בתאי יונקים בתרבית

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

בדיקת המדווח הגנטי היא כלי מבוסס ורב עוצמה לניתוח הקשר בין רצפי DNA לפעילויות ויסות הגנים שלהם. עם זאת, התפוקה הפוטנציאלית של בדיקה זו הוגבלה על ידי הצורך לשכפל ולבחון בנפרד את הפעילות של כל רצף על פי עניין באמצעות פלואורסצנטיות חלבון או פעילות אנזימטית כפרוקסי לפעילות רגולטורית. התקדמות בטכנולוגיות סינתזה וריצוף DNA בתפוקה גבוהה אפשרה לאחרונה להתגבר על מגבלות אלה על ידי ריבוב הבנייה והחקירה של ספריות גדולות של מבני מדווחים. פרוטוקול זה מתאר יישום של מבחן מדווח מקביל מאסיבי (MPRA) המאפשר השוואה ישירה של מאות אלפי רצפים רגולטוריים משוערים בצלחת תרבית תאים בודדת.

MPRA מאפשר רזולוציה גבוהה, לנתיחה כמותי של יחסי רצף פעילותם של גורמי רגולציה תעתיק. ניסוי MPRA מוצלח בדרך כלל יניב מדידות לשחזור מאוד עבור רוב הרצפים בספריית transfected (איור 3 א). אם שחזור עני הוא ציין (איור 3 ב), זה מעיד על ריכוז נמוך מדי של mRNAs כתב בדגימות RNA התאוששו, בשל או 1) פעילות נמוכה מוחלטת בין רצפי assayed, או 2) יעילות transfection נמוכה. איור 4 מראה &quot;טביעת רגל מידע&quot; נציג 1,2 שנוצרה על ידי מנסה לאמוד ~ 37,000 וריאנטים של רצף 145 נ&quot;ב במעלה הזרם של גן IFNB האנושי בתאי HEK293 עם או בלי חשיפה לוירוס סנדאי אקראיים. אמרגן TATA-box ומשפרים הפרוקסימלי ידוע 10 יכולים בבירור להיות מזוהה כregi מידע עשירתוספות באופן וירוס תלוי. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig3highres.jpg" /> איור 3 Tag-Seq שחזור. מגרשי פיזור מראים דוגמאות של נתונים Tag-Seq משני transfections לשכפל עצמאי עם גבוה (A) ואת שחזור נמוך (B). העלילה האחרונה מראה תגי נתון חריגים רבים עם ספירה הגבוהה mRNA רק באחת משתי החזרות. חפצים כגון בדרך כלל מצביעים על כך שהריכוזים של mRNAs הכתב היו נמוכים מדי עבור ההגברה PCR כמותי, גם בשל פעילות נמוכה מוחלטת בין מבני הכתב, או את יעילות transfection נמוכה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig4highres.jpg" /> איור 4 footprinting מידע של האתר האנושי שעתוק IFNB התחלה ומשפרים הפרוקסימלי. </strאונג&gt; כ 37,000 גרסאות אקראיות של 145 נוקלאוטיד אזור (NT) במעלה הזרם של גן IFNB האנושי היו assayed באמצעות MPRA בתאי HEK293 עם () וללא חשיפה (ב &#39;) לוירוס סנדאי. הסורגים הכחולים להציג את המידע ההדדי בין פלט הכתב ונוקלאוטיד בכל עמדה. משפר הפרוקסימלית וTATA-box עומדים בתור אזורים של תוכן מידע גבוה על זיהום ויראלי.

בדיקת המדווח הגנטי היא כלי מבוסס ורב עוצמה לניתוח הקשר בין רצפי DNA לפעילויות ויסות הגנים שלהם. צימוד אלמנטים רגולטוריים מועמדים לגנים מדווחים הנושאים תגי רצף מזהים מאפשר הקבלה מסיבית של מבחנים אלה.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבחון את פעילויות ויסות הגנים של אלפי רצפי DNA במקביל. זה מושג על ידי בניית ספריית מדווחים שבה רצפי ה-DNA המעניינים מקושרים לגנים מדווחים עם תג רצף מזהה אחד או יותר בשלושת הראשונים שלהם. השלב השני של ההליך הוא להעביר את ספריית הכתבים הזו לאוכלוסייה של תאים.השלב האחרון הוא לספור את מספר המופעים של כל אחד מתגי הרצף המזהים ב-mRNA של המדווח ובספריית המדווח המתאימה על ידי ריצוף עמוק. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בתוצאות כדי להסיק את הקשר בין רצף ה-DNA לפעילויות של אלמנטים רגולטוריים של גנים באמצעות ניתוח חישובי של ספירת תגי הרצף. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו לוציפראז או מבחני דיווח מבוססי GFP, הוא שהיא מאפשרת לך לבחון אלפי רצפים רגולטוריים בצלחת אחת של תאים מתורבתים.שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ויסות הגנים, כגון אילו נוקלאוטידים בתוך הפעילות החיונית של המקדם או המשפר. ניתן להשתמש בשיטה זו למגוון רחב של תכנון ניסויים אחרים, כגון סינון ספרייה גדולה של אלמנטים מווסתים משוערים לפעילות במצבים תאיים ספציפיים. מי שידגים את הליך בניית ספריית הכתבים יהיה פיטר רוגו, עמית מחקר בכיר ממעבדות ביוטכנולוגיה, המדגים את ספריית הכתבים TRANSFECT ושחזור RNA יהיה לי וואנג, עמית מחקר בכיר מהקבוצה שלי, מבחני מדווח מקבילים מסיביים המתייחסים מעתה והלאה ל-NPRA, מתחילים בתכנון וסינתזה של רצפים שייבדקו לפעילות רגולטורית.ותג מציין תג מזהה אחד או יותר. אתרי הגבלת KPN one ו-XBA one ממוקמים ביניהם. השהה מחדש את ספריית האוליגונוקלאוטידים המסונתזת ב-100 מיקרוליטר של מאגר TE 0.1.הפעל את ספריית האוליגונוקלאוטידים על ג'ל פולי אקרילאמיד לדנטורציה של אוריאה 10% TBE. טען בערך אול אחד בכל נתיב ונתח את הג'ל עם כתם פלואורסצנטי רגיש ל-DNA יחיד. אם יש איסור דיסקרטי המתאים לאוליגונוקלאוטידים באורך מלא, חתוך אותו והוציא את האוליגו ל -100 מיקרוליטר של TE 0.1 למשך הלילה בטמפרטורת החדר ועם ניעור באמצעות ספריית האוליגונוקלאוטידים המטוהרים או הגולמיים בג'ל.הגדר PCR תחליב כדי להגביר את הספרייה ולהוסיף זנבות SI אחד. הגדר 50 תגובות מיקרוליטר כמתואר בטבלה השנייה. לאחר מכן שלבו את תערובת התגובה של 50 מיקרוליטר עם 300 מיקרוליטר של שמן ותערובת פעילי שטח מערכת תחליב וטיהור ה-DNA שלי למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס מערבולות מערבולות לאמולסיה.לאחר מכן הפיצו את האמולסיה לצינורות או צלחות PCR כתגובות של 50 מיקרוליטר ובצעו 20 מחזורי PCR לאחר ה-PCR. משוך את האמולסיות של 350 מיקרוליטר בחזרה. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של איזובוטנול ומערבולת לתערובת.טהר בקצרה את מוצר ההגברה באמצעות עמודת טיהור DNA והפעל Eloqua על ג'ל אגרוס של 2% או 4% כדי להעריך את איכותו. הגברת הסרום של ספריות שמן מורכבות יכולה להציג הטיית ייצוג, יישום RIC וחפצים אחרים. חיוני למזער את מספר מחזורי ה-PCR המשמשים לבקרת איכות נוספת.מומלץ לבצע ספריית רצף מלאה לפני שתמשיך לשלבים הבאים כדי להכין את עמוד השדרה של הפלסמיד הליניארי. עיכול ראשון P pra וקטור אחד עם SFI אחד ב-50 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן הפעל את המוצרים המעוכלים על ג'ל של 1% ואסוף את ה-DNA מרצועת עמוד השדרה של 2.5 קילו-בסיס באמצעות עמודת ספין לטיהור ג'ל.לאחר מכן, עכל את מוצרי ה-PCR של תחליב באותו אופן ואסוף את המוצרים גם עם עמודת טיהור ה-DNA. כעת הגדר תגובת קשירה עם 100 ננוגרם של PCR מעוכל ו-50 ננוגרם של פלסמיד ליניארי. השתמש ב-T ארבע ליגאז והפעל את התגובה למשך הלילה ב-16 מעלות צלזיוס למחרת.השבת את תגובת הקשירה על ידי חימום בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן הפוך שני אליקוטים של מיקרוליטר של תוצרי תגובת הקשירה ל-50 מיקרוליטר של שוויון אלקטרו. שחזר את התאים ב -800 מיקרוליטר של מדיום SOC ב -37 מעלות צלזיוס עם ניעור למשך שעה.לאחר מכן אסוף את כל הטרנספורמציות המקבילות והעריך אותן על ידי ציפוי דילולים סדרתיים על אגר LB עם 50 עד מאה מיקרוגרם של פניצילין פחמן למיליליטר. דגרו על הצלחות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס והעריכו את סך ה-CFU למחרת. מיד לאחר הטרנספורמציה, השתמש בשאר התאים שעברו טרנספורמציה כדי לחסן 200 מיליליטר של LB בתוספת 100 מיקרוגרם פחמן למיליליטר.גדל את התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ועם ניעור למחרת, בודד את ה-DNA של הפלזמה בהתאם להליכים סטנדרטיים כדי לאשר את נוכחותם של תוספות. עכל מנה של הספרייה המבודדת עם SFI אחד והוציא את המוצרים על ג'ל 1%aros ליניאריזציה של ספריית הפלסמיד עם עיכול סדרתי באמצעות KPN one ו-XBA עיכול ראשון עם KPN אחד ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה וטהר את המוצרים באמצעות חרוזים מגנטיים. שנית, עכל מוצר עם XBA אחד בתוספת יחידה של פוספטאז אלקליין שרימפס ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לאחר מכן.השבת את התגובה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ואז טהר את המוצרים באמצעות חרוזים מגנטיים. הפעל אליקוט על ג'ל של 1%, ואם נראה פלסמיד לא חתוך, ג'ל טהר את השבר הליניארי כעת כדי ליצור ספריית NPRA המתאימה לטרנספקציה לתאי יונקים. ראשית, הכינו מזל תואם לפתיחת קטע מסגרת קריאה מתורם P-M-P-R-A.עכל את הפלסמיד הזה עם KPN אחד ו-XBA אחד ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן יש להוציא את המוצרים על ג'ל 1% AGROS. הסר את שבר מסגרת הקריאה הפתוחה במקרה זה ב-1.7 קילו-בסיסים וטהר באמצעות עמוד ספין לטיהור ג'ל.לאחר מכן קשר את מסגרת הקריאה הפתוחה הליניארית לספריית הביניים הליניארית כמתואר עבור הקשירה הקודמת. הפוך את תוצרי הקשירה לתאי אי קולי ובודד את ספריית הפלסמיד הסופית של NPRA כפי שתואר קודם לכן. אם אתם לא זהירים, המשיכו הלאה.הפלסמידים המותאמים והמוצרים המצופים יכולים להפחית מאוד את שיעור המבנים הנכונים במאגר הפלסמיד הסופי. הקפד לבודד את הרצועה הנכונה ולבדוק אם יש רקע לפני שתמשיך לשלבים הבאים. כצ'ק לעכל Eloqua של מיקרוגרם אחד או שניים מספריית NPRA עם KPN אחד.הריצו את זה על ג'ל של 1% ואם זה רץ כרצועה אחת, המשיכו. אחרת, עיין בפרוטוקול הטקסט כיצד להתמודד עם זיהום כדי להעביר תאים מתורבתים. עם ה-NPRA.יש לבצע אופטימיזציה של תנאי הפלסמידים עבור כל סוג תא. לדוגמה, ניתן להעביר 5 מיליון תאים HK 2 93 T 17 שגדלו לכ-50% מפגש בצלחת תרבית של 10 סנטימטר עם 10 מיקרוגרם של DNA פלסמיד במיליליטר אחד של ofm, מדיום סרום מופחת אחד באמצעות 30 מיקרוליטר של lipo LTX ו-10 מיקרוליטר של פלוס ריאגנט. במקרה זה, הסר את תערובת הטרנספקציה כחמש שעות ואפשר לתאים להתאושש במשך יום או יומיים לאחר מכן, קצור את התאים והשתמש בערכה כדי לבודד את ה-mRNA הפולי-חיובי.לאחר מכן צור תג, חפש ספריית רצף ונתח את התוצאות. NPRA מאפשר ניתוח כמותי ברזולוציה גבוהה של יחסי פעילות הרצף של אלמנטים רגולטוריים שעתוק. ניסוי מוצלח של NPRA מניב בדרך כלל מדידות הניתנות לשחזור עבור רוב הרצפים בספריית Transfected.אם יכולת השחזור גרועה, ריכוז ה-mRNA המדווח ב-RNA המשוחזר כנראה נמוך מדי. זה יכול לקרות בגלל פעילות מוחלטת נמוכה בין רצפי הבדיקה או בגלל יעילות טרנספקציה נמוכה. ב-n PRAs מוצלחים אלה, נותחו 37,000 גרסאות של רצף של 1,45 זוגות בסיסים במעלה הזרם של גן בטא אינטרפרון אנושי עם או בלי חשיפה לנגיף סנדי.ניתן לזהות בבירור את תיבת המקדם Tata ואת המשפר הפרוקסימלי הידוע כאזורים עשירים במידע באופן תלוי בנגיף. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשבוע אם היא מבוצעת כראוי בעקבות הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות כמו EMCE ולכידת זיקה של DNA חלבון על מנת לענות על שאלות נוספות כמו איזה גורם שעתוק נקשר לנוקלאוטידים קריטיים בתוך רצף DNA פעיל.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין ספריות דיווח כדי לבחון את פעילויות ויסות הגנים של אלפי רצפי DNA במקביל.

massively-parallel-reporter-assays-in-cultured-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה של ​​מולקולות דנ"א בודדות התבוננות בתאים חיים מתוארת. הטכניקה מתבססת על הכריכה של חלבון מתויג fluorescently lac repressor לאתרי קישור מהונדס לתוך הדנ"א של עניין. שיטה זו יכולה להיות מותאמת למעקב DNAs רקומביננטי רב בתאי חיים לאורך זמן.

ניטור כפול פלסמיד בתאי יונקים חיים דרך מספר דורות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי

אנו מציגים שיטת סינון מהירה וזולה לזיהוי רגולטורים תעתיק באמצעות transfections רובוטית תפוקה גבוהה וassay בלוציפראז כפול זוהר תוצרת בית. פרוטוקול זה במהירות מייצר נתונים פונקציונליים Side-by-צד ישיר לאלפי גנים והוא שינוי בקלות למקד כל גן של עניין.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

השגת הבנה ברמת מערכות של תהליכים תאיים היא מטרה של ביולוגיה של התא המודרנית. אנו מתארים כאן אסטרטגיות לכתבי לוציפראז ריבוב של תפקוד תאי שונים נקודות קצה לחקור את תפקוד גן באמצעות הגנום בקנה מידה ספריות RNAi.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

אנחנו פיתחו תרבות תא אוטומטית וחקירת פלטפורמה לניסויי גירוי תא מיקרו בקנה מידה. הפלטפורמה מציעה שליטה פשוטה, תכליתית, ומדויקת בטיפוח ועידוד אוכלוסיות קטנות של תאים, ומחל lysates לניתוחים מולקולריים. הפלטפורמה מתאימה גם למחקרים המשתמשים בתאים ו / או חומרים כימיים יקרים.

פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

תאי יונקים המבטאים את קלטת גן פליטת אור...

תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent לניטור רציף וזמן אמת של Cytotoxicity

כאן, אנו מתארים בדיקה פנוטיפית החלה על מסכי תפוקה גבוהה / תוכן גבוה של RNA סינתטי קטן מפריע (siRNA), תרכובת כימית, וספריות מוטציה שחפת Mycobacterium. שיטה זו מסתמכת על זיהוי של שחפת Mycobacterium שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תא מארח שכותרתו פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

בדיקה בתפוקה גבוהה בזמן אמת פותחה כדי לזהות בו זמנית (1) אנטי-מיקרוביאלים חודרי תאים אוקריוטיים המכוונים לפתוגן חיידקי תוך תאי, ו-(2) להעריך ציטוטוקסיות של תאים אוקריוטיים. וריאציה על אותה טכנולוגיה שולבה לאחר מכן עם טכנולוגיית חלוקה דיגיטלית כדי לאפשר מחקרי סינרגיה קלים, ברזולוציה גבוהה, מינון-תגובה וסינרגיה דו-ממדית ותלת-ממדית.

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

טכניקות ליצירת ספרייה של פפטידים קצרים שיכולים להפעיל תאי פיסט באמצעות קולטן MRGPRX2 מתוארים. טכניקות הקשורות הן קלות, זולות, וניתן להרחיבן לקולטני תאים אחרים.

הקרנת פפטידים המפעילים MRGPRX2 באמצעות תאי HEK מהונדסים

פיתחנו בדיקת כתב ביוגנזה של מיקרו-רנ"א אינטרוני, שתשמש בתאים במבחנה עם ארבעה פלסמידים: אחד עם miRNA אינטרוני, אחד עם המטרה, אחד כדי לבטא יתר על המידה חלבון רגולטורי, ואחד עבור Renilla luciferase. ה-miRNA עובד ויכול היה לשלוט בביטוי לוציפראז על ידי קשירה לרצף המטרה.

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

מחקר זה פיתח בדיקה לסינון בתפוקה גבוהה נגד Mycobacterium abscessus עם זן כפול של כתב שנוצר לאחרונה, תוך שימוש בפלואורסצנטיות ולומינסנציה כדי להעריך את כדאיות החיידקים במהירות. פרוטוקול זה יהיה רלוונטי לחוקרים השואפים לסנן תרופות חדשות נגד חיידק עמיד לתרופות.

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

למד כיצד לבצע מבחני כתב מקבילים מסיביים בתאי יונקים בתרבית. שיטה זו מאפשרת ניתוח רגולציה גנטית בקנה מידה גדול באמצעות ריצוף עמוק וניתוח חישובי של אלפי רצפי DNA במקביל.

מבחני כתב מקבילים מסיבי בתאי יונקים בתרבית

גלה סרטונים נוספים