דור וטיהור של מכלולי אדם INO80 הכרומטין שיפוץ וSubcomplexes

מטרת הליך זה היא ליצור ולטהר גרסאות פראיות ומוטנטיות של תת-היחידה הרב-תכליתית במתחם שיפוץ כרומטין 80. זה מושג על ידי בידוד הגרעינים תחילה מתאים המבטאים אפיטופ דגל המתויג בחלבוני O 80 בשלב השני, מכינים תמציות גרעיניות, ולאחר מכן מטוהרים את סוג הבר או האדם המוטנטי במתחמי שיפוץ כרומטין O 80 על ידי כרומטוגרפיה של Anti-Flag. בסופו של דבר, ניתן לנתח את הרכבי תת-היחידות של קומפלקסי NO 80 המטוהרים על ידי כתם מערבי או צביעת כסף.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי האופן שבו יחידות המשנה של מתחמי שיפוץ כרומטין MultiPro תורמות לפעילותם הכוללת. שיטה זו תוכננה במיוחד לחקר גרסאות פראיות ומוטנטיות של קומפלקס שיפוץ הכרומטין NO 80, אך ניתן להשתמש בה גם לחקר קומפלקסים גרעיניים מרובי תת-יחידות אחרים. כמו המתווך.

השלב הקריטי ביותר בהליך הוא שלב ההפקה הגרעינית. אנשים בדרך כלל נתקלים בבעיה מכיוון שבשלב מיצוי המלח, אנשים נוטים להוסיף מלח מהר מדי או נמרץ מדי לאחר תרבית בבקבוקי רולר, העבירו את תאי HEC 2 9 3 לצינור חרוטי מדורג בגודל מתאים וסובבו אותם למשך 10 דקות ב 1000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסרת הסופינאט, מדוד את נפח כדור התא הארוז, ואז השהה מחדש את הגלולה בחמישה נפחי תאי אריזה של מאגר A עם פיפטינג עדין ודגר את התאים על הקרח למשך 10 דקות בדיוק.

לאחר סיבוב התאים שוב, מדוד את כדור התא בפעם השנייה, הוא היה אמור לגדול עד פי שניים. הפעם, השעו מחדש את התאים בשני נפחי תאי אריזה של מאגר A ואז העבירו את תרחיף התא להומוגניזטור רקמות פוך בגודל מתאים והומוגניזציה של תרחיף התאים עם עלי הזכוכית הרופף עד ש-90% מהתאים מכתימים באופן חיובי עם צנטריפוגה כחולה טריאן, התאים ההומוגניים בצינור צנטריפוגה מהיר של 45 מיליליטר למשך 20 דקות ב-25, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס ברוטור זווית קבועה. לאחר מכן הסר את ה-SUP natant המכיל את החלבונים הציטוזוליים מהגלולה הגרעינית כדי לחלץ את הגרעינים במלח.

כעת הוסף 2.5 מיליליטר של מאגר C, אך כל שלושה מיליליטר של נפח תא ארוז התחלתי לגלולה. לאחר מכן בעזרת פיפטה סרולוגית, עקרו את הגלולה מדופן הצינור והעבירו את כל התערובת להומוגנייזר למטה בגודל מתאים. הומוגניזציה של התערובת בשתי משיכות של עלי רופף כדי להחיות את הגרעינים ואז להעביר את השבר הגרעיני התלוי לכוס צוננת בגודל כזה שהמתלה ימלא את הכוס לעומק של 0.5 סנטימטרים לפחות.

לאחר מכן, חשב את הנפח של חמישה נתרן כלורי מולארי הדרוש כדי להביא את התמיסה לריכוז סופי של 0.42 נתרן כלורי מולארי לפי הנוסחה הבאה. כעת הוסיפו בהדרגה את תמיסת המלח בנפח המחושב טיפה אחר טיפה תוך כיכוב עדין של התרחיף עם מוט זכוכית על הקרח כדי להגדיל את ריכוז המלח של התרחיף עד להוספת כל הנתרן הכלורי והתמיסה הופכת לצמיגה מאוד. לאחר מכן העבירו בזהירות את המתלה הצמיג לצינורות פוליקרבונט של 70 מיליליטר ברוטור מסוג 45 TI עם מכלול מכסה והשתמשו במוטטור כדי לנענע לאט את הצינורות האטומים בארבע מעלות צלזיוס לאחר 30 דקות, אולטרה-צנטריפוגה את הדגימות ברוטור TI 45 למשך 30 דקות ב-40, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס, ומשוך את התמצית הגרעינית המכילה סופרנטנטים לתוך מיכל פלסטיק יחיד.

לאחר מכן חלקו את תמיסת התמצית הגרעינית לבקבוקים בגודל נוח, הקפיאו אותם בחנקן נוזלי ואחסנו אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי להכין אנטי-פלאג לטיהור חיסוני, התחל בשימוש בפיפטה של 200 מיקרוליטר עם חיתוך הקצה כדי להעביר 200 מיקרוליטר על פני תמיסת חרוזי ארוס 50% נגד דגל לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. העבירו את החרוזים השטופים מראש לתוך צינור חרוטי המכיל 10 מיליליטר של תמצית גרעינית שזה עתה הופשרה לפני שעות של ארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב איטי על מסובב מעבדה, ולאחר מכן אספו את הדגל על ידי צנטריפוגה למשך חמש דקות של 1000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, שטפו את תמצית החרוזים P ב -10 מיליליטר כינים, ארבע 50 חיץ למשך חמש דקות של ארבע מעלות צלזיוס עם נדנוד עדין על מוטטור. לאחר מכן לאחר סיבוב תערובת תמצית החרוזים, שוב לעשות שימוש חוזר. תלו את הגלולה ב-100 עד 150 מיקרוליטר של כינים טריות ארבע 50, העבירו את החרוזים לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

המשך שטיפת הצינור החרוטי של 15 מיליליטר עם 100 עד 150 מיקרוליטר של ליזול 50 עד שכל החרוזים הועברו לצינור המיקרו צנטריפוגה. לאחר סיבוב החרוזים במיקרו צנטריפוגה, שטפו אותם שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של ליס ארבע 50 ופעם אחת עם מיליליטר אחד של EB 100. לאחר מכן כדי לנטרל את החלבונים הקשורים, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר EB 100 המכיל פפטיד דגל ודגר את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס על אגוז.

לאחר חצי שעה, גלולה את החרוזים במיקרו צנטריפוגה שאתה מרוויח ואז העבירו את ה-SUP natant המכיל את קומפלקס OAC C לצינור מיקרו צנטריפוגה טרי. לאחר חזרה על האלוציאן ארבע פעמים נוספות, העבירו את הפליטה הנמשכת דרך עמוד סיבוב ריק כדי להסיר את כל חרוזי הדגל הנותרים משבר החלבון. לבסוף, השתמש במכשיר סינון אולטרה צנטריפוגלי עם חתך משקל מולקולרי של 50,000 כדי לרכז את חלק החלבון הנרמז בערך פי 10.

כפי שמודגם באיור זה, ניתן להעריך את הטוהר של קומפלקסי NO 80 שהוכנו באמצעות יחידות המשנה של תג הדגל המצוינות, כפי שהודגם זה עתה, באמצעות ג'לים SDS פולי אקרילאמיד מוכתמים בכסף. כל החלבונים המופיעים בנתיב הבקרה הזה הם מזהמים הנקשרים באופן לא ספציפי לאירו הדגל. תוויות אלה מציינות את האיסורים המתאימים ליחידות המשנה NO 80 שנבדקו, ואלה מצביעות על הניידות של סמני המשקל המולקולרי.

מיקומו של הסוג הפראי NO 80 מסומן על ידי הריבוע השחור, ומיקומם של המוטאנטים NO 80 מסומן על ידי העיגולים הפתוחים. הנתיבים המופרדים על ידי הקו השחור הם מג'לים נפרדים. ניתן להעריך את הרכב הקומפלקסים על ידי Western blott באמצעות נוגדנים כנגד תת-יחידות NO 80 שונות.

לדוגמה. להלן יחידות המשנה של מודול תחום מסוף הקצה, המודול המשויך למרכז הליקאז ומודול SNF שני הוערכו. לאחר השליטה, ניתן לסיים טכניקה זו תוך יום אחד, החל מקצירת תאים וכלה בטיהור קומפלקסים.

טכניקה זו תאפשר לחוקרים לטהר קומפלקסים ותת-קומפלקסים מרובי יחידות עבור תאי יונקים על מנת לחקור את תפקודיהם. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה יותר כיצד לטהר שיפוץ כרומטין וקומפלקסים אחרים של חלבונים מרובי יחידות מתאים אנושיים או מקווי תאי מומנטום אחרים.