דור וטיהור של מכלולי אדם INO80 הכרומטין שיפוץ וSubcomplexes

מטרת פרוצדורה זו היא להפיק ולטהר גרסאות מסוג בר (wild type) וגרסאות מוטנטיות של תת-היחידה הרב-יחידית בקומפלקס remodel chromatin של NO80. הדבר משיג תחילה על ידי בידוד הגרעינים מתאים המבטאים חלבוני NO80 עם תג flag epitope. בשלב השני, מכינים תמרירי גרעין, ולאחר מכן מטהרים את קומפלקסי remodel chromatin של NO80 האנושיים, מסוג בר או מוטנטיים, באמצעות כרומטוגרפיית שפשוף (affinity chromatography) עם Anti-Flag. לבסוף, ניתן לנתח את הרכבי תתי-היחידה של קומפלקסי NO80 המטוהרים באמצעות western blot או צביעת כסף.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח לגבי האופן שבו תתי-היחידות של קומפלקסי רה-ארגון של כרומטין מסוג MultiPro תורמות לפעילותם הכללית. שיטה זו תוכננה במיוחד למחקר של גרסאות פראיות (wild type) ומוטנטיות של קומפלקס רה-ארגון של כרומטין מסוג NO 80, אך ניתן להשתמש בה גם למחקר של קומפלקסים גרעיניים רב-תתי-יחידות אחרים, כגון ה-mediator.

השלב הקריטי ביותר בפרוצדורה הוא שלב המיצוי הגרעיני. בדרך כלל עולות בעיות מכיוון שבמהלך שלב המיצוי במלח, יש נטייה להוסיף את המלח במהירות רבה מדי או בעוצמה רבה מדי. לאחר גידול בבקבוקי גלגול (roller bottles), העבירו את תאי HEC 2 9 3 למבחנה קונית מדורגת בגודל מתאים וסובבו אותם למשך 10 דקות ב-1000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C. לאחר הסרת העליון (supernatant), מדדו את נפח משקע התאים הדחוס, ולאחר מכן השביו את המשקע בנפח של פי חמישה מנפח התאים הדחוסים של Buffer A באמצעות פיפוט עדין, והדגירו את התאים על קרח למשך 10 דקות בדיוק.

לאחר סבב צנטריפוגה נוסף להסמכת התאים, מדוד את משקע התאים פעם שנייה; גודלו אמור להגדיל את עצמו עד פי שניים. הפעם, השהה מחדש את התאים בשני נפחי תאים של buffer A, ואז העבר את תרחיף התאים למערבב רקמות (tissue homogenizer) בגודל מתאים והומגן את תרחיף התאים בעזרת העשק זכוכית רופף עד ש-90% מהתאים נצבעים בחיוביות ב-trian blue. צנטריפוג את התאים ההומוגניים בפרוטוקול של 20 דקות ב-25,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C בתוך מבחנה לצנטריפוגה מהירה בנפח 45 milliliter וברוטור מזווית קבועה. לאחר מכן, הסר את העלייה (supernatant) המכילה את החלבונים הציטוזוליים ממשקע הגרעינים כדי לחלץ את הגרעינים בעזרת מלח.

כעת הוסיפו 2.5 מיליליטר של באפר C, עבור כל שלושה מיליליטר של נפח תאי דחוס התחלתי, אל המשקע. לאחר מכן, באמצעות פיפטה סרולוגית, שחררו את המשקע מהדופן של המבחנה והעבירו את כל התערובת להומוגנייזר דהון בגודל מתאים. הומוגניזו את התערובת בשני תנועות של פסטל רפוי כדי לתלה מחדש את הגרעינים, ולאחר מכן העבירו את פראקציית הגרעינים התלויה לכלי זכוכית מקורר בגודל כזה שהסספנסיה תמלא את הכלי לעומק של לפחות 0.5 סנטימטרים.

בשלב הבא, חשב את הנפח של נתרן כלורי בריכוז 5 M הדרוש כדי להביא את התמיסה לריכוז סופי של 0.42 M נתרן כלורי, לפי הנוסחה הבאה. כעת, הוסף בהדרגה את נפח תמיסת המלח שחושב, טיפה אחר טיפה, תוך כדי ערבוב עדין של התגסוס בעזרת מקל זכוכית על קרח, כדי להעלות את ריכוז המלח בתגסוס עד להוספת כל הנתרן כלורי והתמיסה הופכת לצמיגית מאוד. לאחר מכן, העבר בזהירות את התגסוס הצמיגי למבחנות פוליקרבונט של 70 מיליליטר ברוטור Type 45 TI עם מכלול מכס, והשתמש במערכת ערבוב (mutator) כדי לנער בעדינות את המבחנות האטומות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר 30 דקות, בצע אולטרacentrifugation לדגימות ברוטור TI 45 למשך 30 דקות ב-40,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C, והעבר את תמצית הגרעין המכילה את העילאיים למכל פלסטיק אחד.

לאחר מכן, חלק את תמיסת התמצית הגרעינית לאליקוואוטים בגדלים נוחים, הקפא אותם בהקפאה מהירה (snap freeze) בחנקן נוזלי ואחסן אותם בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. כדי להכין Anti-Flag aros לניקוי אימונולוגי, התחל בשימוש בפיפט של 200 microliter עם קצה חתוך כדי להעביר 200 microliters של תמיחת חרוזי 50% Anti-Flag aros לשפרוס מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter. העבר את החרוזים שנשטפו מראש למבחנה קונית המכילה 10 milliliters של תמצית גרעינית שהופשרה לאחרונה, והדגרה במשך ארבע שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס תוך סיבוב איטי על רוטטור מעבדה, ולאחר מכן אסוף את ה-flag aros על ידי צנטריפוגציה למשך חמש דקות ב-1000 times G ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

בשלב הבא, שטפו את תמצית החרוצים P ב-10 milliliters של בופר lice, four 50 למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius, תוך כדי נענוע עדין על מחוש (rotator). לאחר מכן, לאחר ספינטדאון של תערובת תמצית החרוצים, חזרו על הפעולה פעם נוספת. השעו את המשקע ב-100 עד 150 microliters של lice four 50 טרי, והעבירו את החרוצים למבחנת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter.

המשיכו לשטוף את המבחנה הקונית בנפח 15 מיליליטר עם 100 עד 150 מיקרוליטר של Lysol 50 עד שכל החרוזים יועברו למבחנת המיקרו-צנטריפוגה. לאחר סבב של החרוזים במיקרו-צנטריפוגה, שטפו אותם שלוש פעמים עם 1 מיליליטר של lys four 50 ופעם אחת עם 1 מיליליטר של EB 100 Buffer. לאחר מכן, כדי לאלות את החלבונים הקשורים, הוסיפו 200 מיקרוליטר של EB 100 buffer המכיל flag peptide והדגירו את הדגימה בטמפרטורה של 4 °C על נערור.

לאחר חצי שעה, השקיעו את החרוזים במ이크רו-צנטריפוגה והעבירו את הסופרנאט (SUP natant) המכיל את קומפלקס OAC C האלואט למבחנת מיקרו-צנטריפוגה נקייה. לאחר חזרה על תהליך האלואציה ארבע פעמים נוספות, העבירו את האלואט המאוסף דרך עמודת ספין ריקה כדי להסיר שאריות של חרוזי flag aero מהfrakציה החלבונית. לבסוף, השתמשו במכשיר אולטרה-פילטרציה צנטריפוגלי עם סף חיתוך של 50,000 למשקל מולקולרי כדי לרכז את פראקציית החלבון האלואט פי 10 בקירוב.

כפי שמוצג בדמות זו, ניתן להעריך את טוהר קומפלקסי ה-NO 80 שהוכנו באמצעות תת-יחידות ה-flag tag המצוינות, כפי שהודגם זה עתה, באמצעות ג'לים של SDS poly acrylamide שצבעו בכסף. חלבונים המופיעים בנתיב הבקרה הם זיהומים הנקשרים באופן לא ספציפי ל-flag aeros. תוויות אלו מצביעות על הפסים המתאימים לתת-יחידות ה-NO 80 שנבדקו, ואלו מצביעות על הניידות של סמני המשקל המולקולרי.

מיקומו של ה-NO 80 מסוג הפרא (wild type) מסומן על ידי הריבוע השחור, ומיקומם של מוטציות ה-NO 80 מסומנים על ידי העיגולים הפתוחים. הנתיבים המופרדים על ידי הקו השחור הם מגילים נפרדים. ניתן להעריך את הרכב הקומפלקסים באמצעות Western blot באמצעות נוגדנים נגד תתי-יחידות שונות של NO 80.

לדוגמה, כאן הוערכו תתי-היחידות של מודול דומיין הקצה הטרמינלי, המודול המשויך למרכז ההליקאז ומודול SNF two. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בתוך יום אחד, החל מקצירת התאים ועד לטיהור הקומפלקסים.

טכניקה זו תאפשר לחוקרים לטהר קומפלקסים רב-תתי-יחידות וסב-קומפלקסים מתאי יונקים במטרה לחקור את תפקודיהם. לאחר צפייה בסרטון זה, תגבירו את הבנתכם לגבי אופן טיהורם של קומפלקסים של רה-ארגון כרומטין ושל קומפלקסים אחרים של חלבונים רב-תתי-יחידות מתאי אדם או מקווי תאים אחרים של יונקים.