Name: דור וטיהור של מכלולי אדם INO80 הכרומטין שיפוץ וSubcomplexes (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: למד לייצר ולטהר מכלולי INO80 מסוג פראי ומוטנטיים מתאי HEK293 באמצעות כרומטוגרפיית אפיניות. שיטה זו מאפשרת ניתוח הרכב תת-יחידות ותרומתן לפעילות המכלול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה במעבדה של המחברים נתמכת על ידי מענק מהמכון הלאומי למדעי רפואה כלליים (GM41628) ועל ידי מענק למכון Stowers למחקר רפואי מהלן נלסון רפואי קרן המחקר בקרן קהילת קנזס רבתי העיר.

<ol><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chromatin+remodeling+complexes%2C+Annual+Review+of+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The biology of chromatin remodeling complexes, Annual Review of Biochemistry.</a> 78, 273-304 (2009).</li>
<li>Szerlong, H., Hinada, K., Viswanathan, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HSA+domain+binds+nuclear+actin-related+proteins+to+regulate+chromatin-remodeling+ATPases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases.</a> Nature Struct. Mol. Biol. 15 (5), 469-476 (2008).</li>
<li>Shen, X., Mizuguchi, G., Hamiche, A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+remodelling+complex+involved+in+transcription+and+DNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A chromatin remodelling complex involved in transcription and DNA processing.</a> Nature. 406 (6795), 541-544 (2000).</li>
<li>Shen, X., Ranallo, R., Choi, E., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+actin-related+proteins+in+ATP-dependent+chromatin+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Involvement of actin-related proteins in ATP-dependent chromatin remodelling.</a> Mol. Cell. 12, 147-155 (2003).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+organization+of+the+human+INO80+chromatin+remodeling+complex%3A+an+evolutionarily+conserved+core+complex+catalyzes+ATP-dependent+nucleosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).</li>
<li>Sauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombination%3A+developments+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombination: developments and applications.</a> 5 (5), 521-527 (1994).</li>
<li>Gorman, S., Fox, D. T., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinase-mediated+gene+activation+and+site-specific+integration+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recombinase-mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells.</a> Science. 251 (4999), 1351-1355 (1991).</li>
<li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+chromatin+remodeling+complex+with+similarities+to+the+yeast+INO80+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (2005).</li>
<li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YY1+functions+with+INO80+to+activate+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">YY1 functions with INO80 to activate transcription.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (9), 872-874 (2007).</li>
<li>Yao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Modes+of+Regulation+of+the+Uch37+Deubiquitinating+Enzyme+in+the+Proteasome+and+in+the+Ino80+Chromatin-Remodeling+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct Modes of Regulation of the Uch37 Deubiquitinating Enzyme in the Proteasome and in the Ino80 Chromatin-Remodeling Complex.</a> Mol.Cell. 31 (6), 909-917 (2008).</li>
<li>Brizzard, B. L., Chubet, R. G., Vizard, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+purification+of+FLAG+epitope-tagged+bacterial+alkaline+phosphatase+using+a+novel+monoclonal+antibody+and+peptide+elution%2C+Biotechniques%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity purification of FLAG epitope-tagged bacterial alkaline phosphatase using a novel monoclonal antibody and peptide elution, Biotechniques.</a> 16 (4), 730-735 (1994).</li>
<li>Barker, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarker%2C+K+%22At+the+Bench%3A+A+Laboratory+Navigator%22">At the Bench: A Laboratory Navigator</a>. 10, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 207-245 (2005).</li>
<li>Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+transcription+initiation+by+RNA+polymerase+II+in+a+soluble+extract+from+isolated+mammalian+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian cell nuclei.</a> Nucleic. Acids. Res. 11 (5), 1475-1489 (1983).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מחקרים מבניים ותפקודיים של רב למקטע מתחמי שיפוץ הכרומטין יונקים מאאוקריוטים גבוהים כבר הקשו על ידי הקושי של הכנה ביוכימית כמויות שימושיות של מתחמים כגון המכילים יחידות משנה שעברו מוטציה או חסרי יחידות משנה מסוימות לגמרי. ישנם מספר של מכשולים טכניים: ראשית, מניפולציה גנטית בתאי יונקים הייתה מאתגרת מבחינה טכנית ודורש זמן רב. שלא כמו תאי שמרים, הגנום שניתן לערוך בקלות וממוקדת תוך שימוש בטכניקות recombineering, הגנום של היונקים הוא יותר מבחינה מבנית מורכב ופחות רגיש להתערבויות recombi...

מתחמי שיפוץ הכרומטין משפחת SNF2 אבולוציונית שמורים הם רגולטורים מרכזיים של ארגון הכרומטין ונגישות DNA 1. מתחמי שיפוץ אלה תמיד כוללים מקטע מרכזי כמו SNF2-ATPase, אשר, במקרים מסוימים, מרכיב בחלבוני אבזר שונים ויוצר מכלולי מקרו מולקולרי רב למקטע. כדי לחקור את הפרטים המולקולריים של תהליך שיפוץ הכרומטין תלוי ATP, זה חשוב להבין את תרומתם של תת קבוצות מסוימות של יחידות משנה ו / או מבני תחום לפעילות של מתחמים. ניתוח מסוג זה דורש את היכולת ליצור מתחמי מוטציה נקיים במיוחד שחסרות יחידות משנה חלבון מסוימות או מבני תחום. מחקרי מבנה פונקציה קודמים של מתחמי שיפוץ הכרומטין תלוי ATP התמקדו באופן נרחב במערכת שמרי המודל בשל manipulability מעולה של הגנום השמרים (ראה, למשל, שופטים 1-4). בהתחשב בשימורהרכב למקטע ופונקציונליות בין מתחמי שיפוץ orthologous, מחקרים של המבנה והתפקוד של קומפלקסי שיפוץ שמרים סיפקו תובנות חשובות עמיתיהם באאוקריוטים גבוהים יותר. עם זאת, מינים ספציפיים ניכרים הבדלים בין מתחמי שיפוץ קיימים, כתוצאה מרווח או הפסד של מינים ספציפיים יחידות משנה, הרווח או הפסד של תחומים מינים ספציפיים של יחידות משנה נשמרו, והשתנות רצף בתוך תחומים משומרים של יחידות משנה נשמרת. יכולים באופן עקרוני להיות מונעים את ההבדלים כאמור על ידי הצורך בתאים האיקריוטים גבוהים יותר להסתגל לסביבות מולקולריות ותאיות חדשות. לפיכך, ההבנה כיצד יחידות משנה של מתחמי שיפוץ אוקריוטים גבוהים לתרום לתהליך שיפוץ הנוקלאוזום היא בעל ערך, כי זה לא רק גם שופך אור על מנגנונים בסיסיים של תהליך שיפוץ הכרומטין תלוי ATP, אבל יכול לספק תובנה חשובה המנגנונים שבאמצעותם מבנה הכרומטין וביטוי גנים בפואאוקריוטים מוסדרים. עד כה, יש כבר מוגבל רק מחקרים מבניים ותפקודיים של מתחמי שיפוץ הכרומטין יונקים רב למקטע, נובע בחלקו בקשיים בהשגת מתחמים מוגדרים ביוכימית הכרומטין שיפוץ וsubcomplexes. באופן חלקי יש לנו לעקוף את הקשיים הללו לנהלים שיפורטו להלן, שבו לטיהור immunoaffinity משמשת להכנת subcomplexes INO80 או INO80 שלם מהתאים אנושיים ביציבות להביע epitope דגל N-סופני מתויג סוג בר או גרסאות מוטציה של Ino80 5-7 (איור 1) . כדי להשיג מתחמי INO80 שלמים מהתאים אנושיים, רקומבינציה בתיווך FLP משמשת ליצירת שורות תאי HEK293 מהונדסים ביציבות להביע cDNAs מתויגים epitope דגל קידוד יחידות משנה של המתחם INO80 8-10. בגלל ביטוי יתר של יחידות משנה INO80 יכול להיות רעיל במידה מסוימת, יש צורך לבודד ולשמור על שורות תאים משובטים תחת שיתוף סלקטיביnditions כדי להבטיח ביטוי transgene יציב במהלך הקטעים רבים הנדרשים להרחבה של תרביות תאים בקנה מידה גדולה. כדי להשיג subcomplexes INO80 קטן יותר המכיל רק קבוצת משנה של יחידות משנה, השתמשנו בהצלחה שתי גישות (איור 2 א, ב &#39;). בחלק הראשון, אנו יוצרים שורות תאי HEK293 FLP-In ביציבות להביע גרסאות מוטציה של Ino80 שחסרת ​​תחומים הנדרשים לאינטראקציה עם יחידות משנה ספציפיות 5. לחלופין, מציאה בתיווך siRNA משמשת לרוקן למקטע הרצוי מהתאים לבטא מקטע מתאים מתויג דגל INO80 (נתונים שלא פורסמו). לבסוף, כדי לטהר את מתחמי INO80 האנושיים, כרומטוגרפיה המבוססת agarose FLAG 11 משמשת להעשרת חלק המכיל INO80 מתמציות גרעיניות, ובכך מפחיתה ביעילות את נוכחותם של חלבונים מזהמים cytosolic בשבריר הסופי המכיל subcomplexes INO80 או INO80 המטוהר.

<table><tbody><tr><td>Dualbecco's Modified Eagle</td><td>Medium Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I (גלוטמין מיוצב)</td> <td>Life Technologies</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>SAFC</td><td>12176C</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE6 מגיב טרנספקציה</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin B, סטרילי ב-PBS</td><td>AG Scientific</td><td>H-1012-PBS</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA5/FRT וקטור</td><td>Life Technologies</td><td>V6010-20</td><td></td></tr><tr><td>Flp-In HEK293 תאים</td><td>Life</td><td>Technologies R780-07</td><td></td></tr><tr><td>pOG44 Flp-Recombinase Expression</td><td>Vector Life Technologies</td><td>V600520</td><td></td></tr><tr><td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל</td><td>SAFC</td><td>12138C</td><td></td></tr><tr><td>TARGETplus SMARTsiRNA בריכה</td><td>Dharmacon / Thermo Scientific</td><td>שונים</td><td></td></tr><tr><td>5x siRNA מאגר השעיה</td><td>מחדש Dharmacon / Thermo Scientific</td><td>#B-002000-UB-100</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Life Technologies</td><td>13778</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM סרום מופחת</td><td>טכנולוגיות חיים בינוניים</td><td>51985-091</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>45000</td><td>VWR</td></tr><tr><td>TrypLE (trypsin)</td><td>Life Technologies</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>1x FLAG Peptide</td><td>Sigma</td><td>F3290</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin Chromatography Column</td><td>Bio-Rad</td><td>737-5021</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)</td><td>Amicon</td><td>UFC805024</td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Zeba Desalting Columns</td><td>Thermo Scientific</td><td>89882</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד FLAG M2, נוגדן</td><td>עכבר Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2, ארנב</td><td>Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז קוקטייל</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>benzonase</td><td>Novagen</td><td>70664</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">ציוד</td></tr><tr><td>רוטור JS-4.2 ברוטור J6</td><td>Beckman-Coulter</td><td>339080</td><td></td></tr><tr><td>JA-17</td><td>בקמן-קולטר</td><td>369691</td><td></td></tr><tr><td>צינורות פוליקרבונט 10 מ"ל</td><td>בקמן-קולטר</td><td>355630</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקי פוליקרבונט 70 מ"ל</td><td>בקמן-קולטר</td><td>355655</td><td></td></tr><tr><td>סוג 45 רוטור Ti</td><td>בקמן-קולטר</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>סוג 70.1 רוטור Ti</td><td>בקמן-קולטר</td><td>342184</td><td></td></tr><tr><td>BD קליי אדמס נואטור מיקסר</td><td>BD דיאגנוסטיקה</td><td>15172-203</td><td>VWR</td></tr><tr><td>Glas-Col צינור/בקבוקון מסובב</td><td>Glas-Col</td><td>099A RD4512</td><td></td></tr><tr><td>PCR תרמי cycler PTC 200</td><td>MJ מחקר</td><td>PTC 200</td><td></td></tr><tr><td>רולר בקבוק אינקובטור</td><td>Bellco ביוטכנולוגיה</td><td>353348</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL העברת ממברנה 7 x 8.4</td><td>Millipore</td><td>IPFL07810</td><td></td></tr><tr><td>משומן 1.5 מ"ל מיקרוצנטריפוגה</td> <td>צינורותקוסטאר</td><td>3207</td><td></td></tr></tbody></table>

דור וטיהור של מכלולי אדם ino80 הכרומטין שיפוץ וsubcomplexes

Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

מתחמי שיפוץ הכרומטין INO80 להסדיר דינמיקת הנוקלאוזום ונגישות DNA על ידי מזרזות שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP. מתחמי INO80 אדם מורכבים מ14 יחידות משנה חלבון כולל Ino80, ATPase כמו SNF2, המשמש גם כמקטע קטליטי והפיגום להרכבה של המכלולים. פונקציות של יחידות משנה האחרות והמנגנונים שבאמצעותם הם תורמים לפעילות שיפוץ הכרומטין של מתחם INO80 להישאר הבינו היטב, בין שאר בשל האתגר של יצירת מכלולי INO80 בתאים אנושיים או מערכות ביטוי Heterologous. פרוטוקול יופיטר זה מתאר הליך המאפשר טיהור של subcomplexes שיפוץ הכרומטין INO80 האנושי שחסרי מקטע או קבוצת משנה של יחידות משנה. epitope דגל N-סופני מתויג Ino80 cDNA הם הציגו ביציבות לכליה עוברית אנושית (HEK) 293 שורות תאים באמצעות רקומבינציה בתיווך FLP. במקרה שקבוצת משנה של יחידות משנה של מתחם INO80 הוא bדואר שנמחק, אחד מבטא חלבוני Ino80 במקום מוטציה שחסר את הפלטפורמה הנדרשת להרכבה של תת יחידות אלה. באירוע למקטע בודד הוא להיות מדולדל, siRNAs אחד transfects מיקוד למקטע זה לשורת תאי HEK 293 יציבות להביע FLAG tagged Ino80 ATPase. תמציות גרעיניות מוכנות, וimmunoprecipitation FLAG מתבצעת על מנת להעשיר את השברים חלבון המכילים נגזרי Ino80. הקומפוזיציות של subcomplexes INO80 מטוהר לאחר מכן ניתן לנתח באמצעות שיטות כגון immunoblotting, צביעת כסף, וספקטרומטריית מסה. Subcomplexes INO80 וINO80 שנוצר על פי פרוטוקול זה ניתן לנתח נוסף באמצעות מבחני ביוכימיים שונים, אשר מתוארים בפרוטוקול יופיטר הנלווה. השיטות שתוארו כאן יכולות להיות מותאמות ללימודים של התכונות המבניות ותפקודיות של כל שיפוץ הכרומטין רב למקטע של יונקים ומתחמי שינוי.

איור 1 מציג תרשים זרימה המסכם את הנהלים המשמשים לייצור, לטהר, ולאפיין מתחמי הכרומטין INO80 תלוי ATP אנושיים שיפוץ. כפי שמודגם באיורים 2 ו -3, נהלים אלה מאפשרים את הדור של שני subcomplexes INO80 הסוג וINO80 הפראי שאין תת יחידות שונות, ובכך מאפשרים ניתוחים ביוכימיים הבאים של התרומה של יחידות משנה חסרות אלה לפעילות האנזימטית של INO80. איור 2 מתאר שת...

פרוטוקול זה מתאר הליך להפקת וטיהור מסוג בר וגרסאות מוטציה של מתחם שיפוץ הכרומטין INO80 האנושי. Epitope מתויג גרסאות של יחידות משנה INO80 באות לידי ביטוי ביציבות בתאי HEK293, ומתחמים שלמים ומתחמים חסרי מערכות ספציפיות של יחידות משנה הם מטוהרים על ידי כרומטוגרפיה immunoaffinity.

דור וטיהור של מכלולי אדם INO80 הכרומטין שיפוץ וSubcomplexes

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

מטרת פרוצדורה זו היא להפיק ולטהר גרסאות מסוג בר (wild type) וגרסאות מוטנטיות של תת-היחידה הרב-יחידית בקומפלקס remodel chromatin של NO80. הדבר משיג תחילה על ידי בידוד הגרעינים מתאים המבטאים חלבוני NO80 עם תג flag epitope. בשלב השני, מכינים תמרירי גרעין, ולאחר מכן מטהרים את קומפלקסי remodel chromatin של NO80 האנושיים, מסוג בר או מוטנטיים, באמצעות כרומטוגרפיית שפשוף (affinity chromatography) עם Anti-Flag. לבסוף, ניתן לנתח את הרכבי תתי-היחידה של קומפלקסי NO80 המטוהרים באמצעות western blot או צביעת כסף.שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח לגבי האופן שבו תתי-היחידות של קומפלקסי רה-ארגון של כרומטין מסוג MultiPro תורמות לפעילותם הכללית. שיטה זו תוכננה במיוחד למחקר של גרסאות פראיות (wild type) ומוטנטיות של קומפלקס רה-ארגון של כרומטין מסוג NO 80, אך ניתן להשתמש בה גם למחקר של קומפלקסים גרעיניים רב-תתי-יחידות אחרים, כגון ה-mediator.השלב הקריטי ביותר בפרוצדורה הוא שלב המיצוי הגרעיני. בדרך כלל עולות בעיות מכיוון שבמהלך שלב המיצוי במלח, יש נטייה להוסיף את המלח במהירות רבה מדי או בעוצמה רבה מדי. לאחר גידול בבקבוקי גלגול (roller bottles), העבירו את תאי HEC 2 9 3 למבחנה קונית מדורגת בגודל מתאים וסובבו אותם למשך 10 דקות ב-1000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C. לאחר הסרת העליון (supernatant), מדדו את נפח משקע התאים הדחוס, ולאחר מכן השביו את המשקע בנפח של פי חמישה מנפח התאים הדחוסים של Buffer A באמצעות פיפוט עדין, והדגירו את התאים על קרח למשך 10 דקות בדיוק.לאחר סבב צנטריפוגה נוסף להסמכת התאים, מדוד את משקע התאים פעם שנייה; גודלו אמור להגדיל את עצמו עד פי שניים. הפעם, השהה מחדש את התאים בשני נפחי תאים של buffer A, ואז העבר את תרחיף התאים למערבב רקמות (tissue homogenizer) בגודל מתאים והומגן את תרחיף התאים בעזרת העשק זכוכית רופף עד ש-90% מהתאים נצבעים בחיוביות ב-trian blue. צנטריפוג את התאים ההומוגניים בפרוטוקול של 20 דקות ב-25,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C בתוך מבחנה לצנטריפוגה מהירה בנפח 45 milliliter וברוטור מזווית קבועה. לאחר מכן, הסר את העלייה (supernatant) המכילה את החלבונים הציטוזוליים ממשקע הגרעינים כדי לחלץ את הגרעינים בעזרת מלח.כעת הוסיפו 2.5 מיליליטר של באפר C, עבור כל שלושה מיליליטר של נפח תאי דחוס התחלתי, אל המשקע. לאחר מכן, באמצעות פיפטה סרולוגית, שחררו את המשקע מהדופן של המבחנה והעבירו את כל התערובת להומוגנייזר דהון בגודל מתאים. הומוגניזו את התערובת בשני תנועות של פסטל רפוי כדי לתלה מחדש את הגרעינים, ולאחר מכן העבירו את פראקציית הגרעינים התלויה לכלי זכוכית מקורר בגודל כזה שהסספנסיה תמלא את הכלי לעומק של לפחות 0.5 סנטימטרים.בשלב הבא, חשב את הנפח של נתרן כלורי בריכוז 5 M הדרוש כדי להביא את התמיסה לריכוז סופי של 0.42 M נתרן כלורי, לפי הנוסחה הבאה. כעת, הוסף בהדרגה את נפח תמיסת המלח שחושב, טיפה אחר טיפה, תוך כדי ערבוב עדין של התגסוס בעזרת מקל זכוכית על קרח, כדי להעלות את ריכוז המלח בתגסוס עד להוספת כל הנתרן כלורי והתמיסה הופכת לצמיגית מאוד. לאחר מכן, העבר בזהירות את התגסוס הצמיגי למבחנות פוליקרבונט של 70 מיליליטר ברוטור Type 45 TI עם מכלול מכס, והשתמש במערכת ערבוב (mutator) כדי לנער בעדינות את המבחנות האטומות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר 30 דקות, בצע אולטרacentrifugation לדגימות ברוטור TI 45 למשך 30 דקות ב-40,000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C, והעבר את תמצית הגרעין המכילה את העילאיים למכל פלסטיק אחד.לאחר מכן, חלק את תמיסת התמצית הגרעינית לאליקוואוטים בגדלים נוחים, הקפא אותם בהקפאה מהירה (snap freeze) בחנקן נוזלי ואחסן אותם בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. כדי להכין Anti-Flag aros לניקוי אימונולוגי, התחל בשימוש בפיפט של 200 microliter עם קצה חתוך כדי להעביר 200 microliters של תמיחת חרוזי 50% Anti-Flag aros לשפרוס מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter. העבר את החרוזים שנשטפו מראש למבחנה קונית המכילה 10 milliliters של תמצית גרעינית שהופשרה לאחרונה, והדגרה במשך ארבע שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס תוך סיבוב איטי על רוטטור מעבדה, ולאחר מכן אסוף את ה-flag aros על ידי צנטריפוגציה למשך חמש דקות ב-1000 times G ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.בשלב הבא, שטפו את תמצית החרוצים P ב-10 milliliters של בופר lice, four 50 למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius, תוך כדי נענוע עדין על מחוש (rotator). לאחר מכן, לאחר ספינטדאון של תערובת תמצית החרוצים, חזרו על הפעולה פעם נוספת. השעו את המשקע ב-100 עד 150 microliters של lice four 50 טרי, והעבירו את החרוצים למבחנת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter.המשיכו לשטוף את המבחנה הקונית בנפח 15 מיליליטר עם 100 עד 150 מיקרוליטר של Lysol 50 עד שכל החרוזים יועברו למבחנת המיקרו-צנטריפוגה. לאחר סבב של החרוזים במיקרו-צנטריפוגה, שטפו אותם שלוש פעמים עם 1 מיליליטר של lys four 50 ופעם אחת עם 1 מיליליטר של EB 100 Buffer. לאחר מכן, כדי לאלות את החלבונים הקשורים, הוסיפו 200 מיקרוליטר של EB 100 buffer המכיל flag peptide והדגירו את הדגימה בטמפרטורה של 4 °C על נערור.לאחר חצי שעה, השקיעו את החרוזים במ이크רו-צנטריפוגה והעבירו את הסופרנאט (SUP natant) המכיל את קומפלקס OAC C האלואט למבחנת מיקרו-צנטריפוגה נקייה. לאחר חזרה על תהליך האלואציה ארבע פעמים נוספות, העבירו את האלואט המאוסף דרך עמודת ספין ריקה כדי להסיר שאריות של חרוזי flag aero מהfrakציה החלבונית. לבסוף, השתמשו במכשיר אולטרה-פילטרציה צנטריפוגלי עם סף חיתוך של 50,000 למשקל מולקולרי כדי לרכז את פראקציית החלבון האלואט פי 10 בקירוב.כפי שמוצג בדמות זו, ניתן להעריך את טוהר קומפלקסי ה-NO 80 שהוכנו באמצעות תת-יחידות ה-flag tag המצוינות, כפי שהודגם זה עתה, באמצעות ג'לים של SDS poly acrylamide שצבעו בכסף. חלבונים המופיעים בנתיב הבקרה הם זיהומים הנקשרים באופן לא ספציפי ל-flag aeros. תוויות אלו מצביעות על הפסים המתאימים לתת-יחידות ה-NO 80 שנבדקו, ואלו מצביעות על הניידות של סמני המשקל המולקולרי.מיקומו של ה-NO 80 מסוג הפרא (wild type) מסומן על ידי הריבוע השחור, ומיקומם של מוטציות ה-NO 80 מסומנים על ידי העיגולים הפתוחים. הנתיבים המופרדים על ידי הקו השחור הם מגילים נפרדים. ניתן להעריך את הרכב הקומפלקסים באמצעות Western blot באמצעות נוגדנים נגד תתי-יחידות שונות של NO 80.לדוגמה, כאן הוערכו תתי-היחידות של מודול דומיין הקצה הטרמינלי, המודול המשויך למרכז ההליקאז ומודול SNF two. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בתוך יום אחד, החל מקצירת התאים ועד לטיהור הקומפלקסים.טכניקה זו תאפשר לחוקרים לטהר קומפלקסים רב-תתי-יחידות וסב-קומפלקסים מתאי יונקים במטרה לחקור את תפקודיהם. לאחר צפייה בסרטון זה, תגבירו את הבנתכם לגבי אופן טיהורם של קומפלקסים של רה-ארגון כרומטין ושל קומפלקסים אחרים של חלבונים רב-תתי-יחידות מתאי אדם או מקווי תאים אחרים של יונקים.

generation-purification-human-ino80-chromatin-remodeling-complexes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד הכרומטין immunoprecipitation (שבב) משמש ללימוד שינויים דינאמיים לתבנית הכרומטין המווסתים את שעתוק המושרה על ידי במסלול הולכת אותות.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם

אנו מתארים שיטה חזקה לimmunoprecipitation הכרומטין באמצעות תאי T ראשוניים. השיטה מבוססת על גישות סטנדרטיות, אך משתמשת בקבוצה מסוימת של תנאים וריאגנטים המשפרים את היעילות למוגבלים בכמויות של תאים. חשוב מכך, תיאור מפורט של שלב ניתוח הנתונים מוצג.

הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

שילוב של immunoprecipitation הכרומטין ורצף אולטרה תפוקה גבוהה (שבב ואילך) יכול לזהות ולמפות DNA חלבונים אינטראקציות בקו רקמה או תא נתון. התווה הוא איך ליצור תבנית באיכות גבוהה עבור סידור שבב שלאחר מכן, תוך שימוש בניסיון עם TCF7L2 גורם השעתוק לדוגמא ירושלים.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.

גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין

כאן אנו מתארים מבחנים ביוכימיים שניתן להשתמש בהם כדי לאפיין אנזימים לעיצוב מחדש של כרומטין תלויי ATP על יכולותיהם 1) לזרז החלקה של נוקלאוזום תלוי ATP, 2) לעסוק במצעי נוקלאוזום, ו-3) הידרוליזה של ATP באופן תלוי נוקלאוזום או DNA.

מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

זיהוי מולקולות הקשורות לאזורי עניין גנומיים ספציפיים נדרש כדי להבין את מנגנוני הבקרה של התפקודים של אזורים אלה. פרוטוקול זה מתאר נהלים לביצוע אימון-אופרפריצציה של כרומטין בתיווך מולקולות קשירת DNA (enChIP) לזיהוי חלבונים ו-RNA הקשורים לאזור גנומי ספציפי.

בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשגת רזולוציה קרובה לזוג הבסיס של אינטראקציות חלבון-DNA. זה מתקבל על ידי טיפול אקסונוקלאז בשברי DNA המועשרים באופן סלקטיבי על ידי משקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP-exo) ואחריו ריצוף תפוקה גבוה.

שיטת שבב exo: זיהוי אינטראקציות חלבון-דנ&quot;א עם Precision סמוך לבסיס זוג

הפקת מלח רציפים של חלבוני כרומטין מאוגד הוא כלי שימושי לקביעת מאפייני האיגוד של מתחמי חלבון גדולה. שיטה זו יכולה להיות מועסק כדי להעריך את התפקיד של subunits בודדים או קבוצות מחשבים הנמצאות בזיקה הכוללת של חלבון מורכב בכמות גדולה כרומטין.

עקירות מלח רציפים לניתוח של כרומטין בצובר מחייב מאפיינים של כרומטין שינוי מתחמי

כאן נתאר עבור פרוטוקול immunoprecipitation היעילה כרומטין (ChIP) ואחריו רצפי DNA תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) של רקמת שומן חום (בת) מבודד מן העכבר. פרוטוקול זה מתאים גם מיפוי היסטון שינויים וגם חוקרים הגנום כולו לוקליזציה של חלבונים היסטון שאינו של הריבית ב vivo.

כרומטין Immunoprecipitation של רקמת שומן חום מאתר

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת כרומטין מרקמות קפואות והוא מתאים ל- Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ואחריו ניתוח PCR כמותי (X-ChIP-qPCR) או גישות ריצוף מהדור הבא (X-ChIP-seq).

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

פרוטוקול זה מציג שיטת בידוד כרומטין ספציפית ללוקוס המבוססת על רקומבינציה ספציפית לאתר כדי לטהר מוקד גן בעל עניין של עותק יחיד בהקשר הכרומטין הטבעי שלו משמרים ניצנים, Saccharomyces cerevisiae.

עותק יחיד של גן לוקוס כרומטין טיהור ב Saccharomyces cerevisiae

למד לייצר ולטהר מכלולי INO80 מסוג פראי ומוטנטיים מתאי HEK293 באמצעות כרומטוגרפיית אפיניות. שיטה זו מאפשרת ניתוח הרכב תת-יחידות ותרומתן לפעילות המכלול.

דור וטיהור של מכלולי אדם INO80 הכרומטין שיפוץ וSubcomplexes

גלה סרטונים נוספים