Name: מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: למדו מבחנים ביוכימיים לניתוח פעילויות אנזימי שיפוץ כרומטין תלויי ATP באמצעות EMSA וכרומטוגרפיית שכבה דקה. שיטות אלו מאפשרות מדידת החלקת נוקלאוזומים ופעילות ATPase במחקר ביוכימי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה במעבדת המחברים נתמכת על ידי מענק מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (GM41628) ועל ידי מענק למכון Stowers למחקר רפואי מקרן המחקר הרפואי הלן נלסון בקרן הקהילתית של קנזס סיטי רבתי.

מבחני Remodeling הנוקלאוזום .1 תלוי ATP כדי למדוד ATP תלוי פעילויות הנוקלאוזום שיפוץ, immunopurified INO80 או subcomplexes INO80 מודגרת עם ATP ומצע mononucleosomal, המכיל הנוקלאוזום יחיד ממוקם בקצה אחד של קטע DNA 216-BP, שכותרתו-P 32. תוצרי התגובה לאחר מכן נתון לאלקטרופורזה בג&#39;ל פולי-acrylamide ילידים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת ליצור את, בר 32 שכותרתו P &#39;601&#39; DNA, להגביר מpGEM-3Z-601 4 שבר 216 נ&quot;ב DNA המכיל 601 רצף מיצוב הנוקלאוזום מיקום סוף, באמצעות oligonucleotides 5&#39;-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG ו5&#39;-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG כ קדימה ולאחור פריימרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תגובת PCR 100 μl כפי שמתואר בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע PCR התגובות בCycler תרמית באמצעות התכנית הבאה: 1 דקות ב96 מעלות צלזיוס, followeד על ידי 45 שניות על 94 מעלות צלזיוס, 30 שניות ב57 ° C, 60 שניות ב72 מעלות צלזיוס במשך 30 מחזורים; כלה ב7 דקות ב72 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תגובת PCR נגמרה, להסיר את נוקלאוטידים מאוגדים על ידי העברת תוצרי התגובה פעמיים באמצעות עמודות ספין nuclease חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרוץ 5 μl של מוצר PCR המטוהר בagarose ג&#39;ל 1.2% כדי לאשר שתגובת PCR שנוצרה קטע DNA נ&quot;ב הרצוי ~ 216. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 5 μl של מוצר PCR המטוהר פי 20, ולמדוד את ריכוז DNA באמצעות ספקטרופוטומטר UV. התשואה הממוצעת היא ~ 40 ng / μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הרדיואקטיביות של 1 μl של מוצר PCR המטוהר במונה נצנץ. להעריך את יעילות התיוג על ידי חישוב עותקים לדקה / ng. תגובת תיוג מוצלחת צפויה להניב ~ 15,000 עותקים לדקה / ng של 601 קטע DNA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את nucleosomes תא הלה על DNA 601 שכותרתו באמצעות שיטת דילול סדרתי 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב 2 pmol של32 קטע DNA 601 עם כותרת P 6 מיקרוגרם של nucleosomes הלה (שהוכן כמתואר 5) ב50 μl של מאגר המכיל 1.0 M NaCl, 10 מ&quot;מ טריס-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.1 מ&quot;מ PMSF, ו1 מ&quot;מ DTT ולדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף לדלל את התערובת ל0.8 M, 0.6 M, ו0.4 M NaCl על ידי דילול עם 12.5 μl, 20.8 μl, ו41.6 μl, בהתאמה, של 10 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.1 מ&quot;מ PMSF, ו 1 מ&quot;מ DTT, עם דגירה 30 דקות ב30 מעלות צלזיוס לאחר כל דילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן לדלל את התערובת ל0.2 M ולאחר מכן ל0.1 M NaCl על ידי תוספת של 125 μl ולאחר מכן 250 μl מאותו המאגר המכיל 0.1% Nonidet P-40, גליצרול 20%, ו200 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​BSA, עם דגירה 30 דקות ב30 מעלות צלזיוס בין שני דילולים הסופיים. אחסן את מצע mononucleosome ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע תגובות הנוקלאוזום הזזה ATP תלויות בנפח כולל של 10 μl. המחשבהרכיבי ction מפורטים בטבלה 2. מאז ריכוז NaCl האופטימלי לפעילות שיפוץ הנוקלאוזום INO80 הוא ~ 50 mM NaCl (תוצאות לא פורסמו), להתאים את הריכוז הכולל של NaCl בכל תגובה ל50 מ&quot;מ, תוך לקיחה בחשבון את כמות NaCl הכלולה ב הכנות של nucleosomes ואנזים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שיתחיל בלהגדיר את מבחני, להטיל ג&#39;לי פולי-acrylamide ילידים (18 x 16 סנטימטר). כדי להכין ג&#39;ל יחיד המכיל 5% acrylamide (acrylamide: bisacrylamide 37.5: 1), TBE 0.5x (45 borate מ&quot;מ טריס, 1 mM EDTA), 0.01% persulfate אמוניום (APS), ו0.001% N, N, N&#39;, -tetramethylethylenediamine N&#39;(TEMED), לערבב את החומרים המפורטים בטבלה 3. אפשר ג&#39;ל לפלמר לפחות שעה 2 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, לכל תגובה שיש לבצע, לשלב בצינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge מראש צונן siliconized ~ 20 ננומטר INO80 או subcomplex INO80 (שהוכן כמתואר 3) עם סכום של חיץ EB100 ( <strאונג&gt; לוח 4) מספיק כדי לתת נפח של 4.75 μl. מייד מחדש להקפיא כל שברים המכיל INO80 שנותרו בקרח יבש אבקה או חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קוקטייל הורים עם שאר החומרים, גמלון בפקטור של &quot;X&quot; (כאשר X = מספר כולל של תגובות +3). הסכום של כל מרכיב הנחוץ לתגובת 10 μl בודדת מופיע בטבלה 5; המתכון צריך להיות בקנה מידה גדול בהתאם למספר של תגובות שיש לבצע. מערבבים היטב על ידי הקשה על הצינור או על ידי pipetting למעלה ולמטה עם Pipetman ולסובב את הצינור לכמה שניות בmicrocentrifuge המעבדתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 5.25 μl של קוקטייל האדון לכל אחד מצינורות התגובה הוקמו בצעד 1.3.2. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. התחל את התגובות על ידי העברת צינורות תגובה לאמבטית גוש חום C 30 מעלות או מים ודגירה עבור שעה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, להכין את &#39;הסרת לערבב&#39; קוקטייל המכיל DNA מתחרהוnucleosomes, גמלון בפקטור של X (X = מספר הכולל של תגובות + 4). הסכום של כל מרכיב הדרוש כדי להכין 1.5 μl הסרת תערובת לתגובה יחידה מופיע בלוח 6; המתכון צריך להיות בקנה מידה גדול בהתאם למספר מבחני שיש לבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסיים תגובות על ידי הוספת 1.5 μl של תמהיל הסרת. מערבבים היטב, ספין למטה, ולדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, לפני לרוץ ג&#39;ל polyacrylamide הילידים ביחידת אלקטרופורזה אנכית ב100 V ל30 דקות ב 4 ° C, באמצעות TBE 0.5x כחיץ פועל עם בר ומערבב מגנטי בתוך החדר התחתון כדי לשמור על זרימת דם למאגר קבועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לטעון את המדגם, להוסיף 2.5 μl של טעינת צבע המכיל 3x TBE, גליצרול 30%, 0.25% כחול bromophenol, ו0.25% Cyanol FF קסילן. מערבבים היטב, ספין בקצרה הדגימות, ולהעמיס אותו על ג&#39;ל באמצעות עצות לטעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הג&#39;ל על 200 V ל4.5 שעות על 4 מעלות צלזיוס עם זרימת חיץ.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לזהות את האות, להעביר את הג&#39;ל לערימה של שני גיליונות של נייר סינון. לעטוף את נייר הסינון עם ג&#39;ל על גבי באמצעות ניילון נצמד ברור, ולאחר מכן לחשוף אותו למסך זרחן האחסון ב 4 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את המסך עם מערכת סורק הדמיה איזוטופ ולנתח את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה. </li></ol></li></ol> 2 מבחני כריכת Mononucleosome לassay הזיקה המחייבת של מורכב INO80 ניתנו לmononucleosomes, לבצע Shift electrophoretic ניידות Assay (Emsa) באמצעות מצע mononucleosomal שנוצר בשלב 1.2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תגובת תערובות לכריכה מבחני כפי שתואר עבור מבחני שיפוץ הנוקלאוזום אבל להשמיט ATP ותמהיל הסרת מהתגובות; לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.5 μl של טעינת צבע לכל תערובת תגובה, ותחול על ג&#39;ל polyacrylamide ילידים המכיל 3.5 acrylamide% (acrylamide: bis 31), 1% גליצרול, TBE 0.5x, APS 0.01%, ו0.001% TEMED: 7.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות TBE 0.5x כחיץ פועל, הפעל את הג&#39;ל על 200 V ל2.5 שעה על 4 מעלות צלזיוס עם זרימת חיץ ולחשוף למסך זרחן האחסון. </li></ol> .3 דנ&quot;א והנוקלאוזום תלוי מבחני ATPase לבצע מבחני ATPase בתערובות תגובת 5 μl מכילות 20 מ&quot;מ טריס-HCl (pH 7.5), 60 mM NaCl, 6.6 מ&quot;מ MgCl 2, 0.8 mM EDTA, 0.015% Nonidet P-40, גליצרול 2.5%, 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל BSA, 1 מ&quot;מ DTT, 0.1 מ&quot;מ PMSF, 2 מ&quot;מ ATP, 2 μCi של [P 32 α-] ATP (3,000 Ci / mmol). עבור כל מורכב INO80 או כמות מורכבת INO80 להיות assayed הקים שלוש תגובות מקבילות, חיץ EB100 מכיל אחד למדוד דנ&quot;א או הנוקלאוזום עצמאי ATPase, אחד מכיל סגורות פלסמיד דנ&quot;א העגול (נ&quot;ב 5,000, ~ 30 ננומטר) כדי למדוד דנ&quot;א ATPase תלוי, ואחד המכיל oligonucleosomes הלה (~ 185 ננומטר) כדי למדוד ATPase הנוקלאוזום תלוי. הגדר את כל התגובות על קרח. <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תגובה, לשלב 10-50 ננומטר של subcomplexes INO80 או INO80 immunopurified עם סכום של חיץ EB100 מספיק כדי לתת נפח של 2.2 μl ב1.5 מ&quot;ל צינורות microcentrifuge משומן מראש צונן. מייד מחדש להקפיא כל שברים המכיל INO80 בקרח יבש אבקה או חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הקוקטייל שני. הסכום של כל מרכיב הנחוץ לתגובה יחידה מופיע בלוח 7. בהיקף של עד המתכון לפי קנה מידה על ידי גורם של 3 (X + 2) +1, כאשר X = מספר הכנות INO80 להיות assayed. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין מאגר המכיל &#39;משנה הקוקטיילים&#39; בלבד, DNA, או nucleosomes, לוותר 2.5 (X + 2) μl של קוקטייל האב לשלושה צינורות נפרדים. הוספת 0.3 (X + 2) μl של שתי EB100, DNA הסגור המעגלי פלסמיד (1.5 מיקרוגרם / μl), או (1.5 מיקרוגרם / μl) oligonucleosomes הלה ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 2.8 μl של תת הקוקטייל המתאים לצינורות תגובה המכיל אנזים שהוקמו בstep 3.1. פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לערבב; למנוע החדרת בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את תגובות, להעביר את צינורות תגובה לגוש חום C 30 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5, 15, 30, ו60 דקות של דגירה, לזהות 0.5 μl של כל תערובת תגובה על כרומטוגרפיה שכבה דקה polyethyleneimine תאית צלחת (TLC) (20 x 10 סנטימטר) בקו ישר לפחות 1.5 ס&quot;מ מהקצה התחתון . מייד לחזור צינורות תגובה לגוש חום C 30 מעלות ניתן לקחת נקודות זמן כל כך רבות מצינור אחד. אחרי שהבחנתי ב, לייבש את צלחות TLC באמצעות מכת מייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את צלחות TLC לתא זכוכית המכיל מספיק פוספט 0.375 M אשלגן (pH 3.5) כדי לאפשר 0.5 סנטימטר תחתית צלחת TLC להיות שקוע בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את התא, ולפתח עד החלק הקדמי של השלב הנוזלי מגיע העליון של צלחות TLC. מיידי לייבש את הצלחות באמצעות מכת מייבש ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את צלחות TLC המיובשים למסך זרחני אחסון ב RT.סרוק את המסך עם מערכת סורק הדמיה איזוטופ ולקבוע את סכום מצע ATP רדיואקטיבי לבין מוצר ADP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את הסכום של ATP הידרוליזה, להכפיל את ATP% הידרוליזה על ידי הכמות של הווה ATP בתערובת התגובה החל שימוש בנוסחה הבאה: ATP pmol הידרוליזה ATP pmol = 10 במתחילים x תגובה [ADP / (ATP + ADP)] </li></ol>

<ol><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The biology of chromatin remodeling complexes.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).</li>
<li>Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+ATP-dependent+chromatin-remodeling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes.</a> Cell. 154 (3), 490-503 (2013).</li>
<li>Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+purification+of+human+INO80+chromatin+remodeling+complexes+and+subcomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes.</a> , (2013).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).</li>
<li>Owen-Hughes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nucleosome+disruption+by+ATP-driven+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes.</a> Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).</li>
<li>Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+INO80+ATP-dependent+chromatin+remodeling+complex+is+a+nucleosome+spacing+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor.</a> Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).</li>
<li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+chromatin+remodeling+complex+with+similarities+to+the+yeast+INO80+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+organization+of+the+human+INO80+chromatin+remodeling+complex%3A+an+evolutionarily+conserved+core+complex+catalyzes+ATP-dependent+nucleosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).</li>
<li>Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+histone+octamer+sliding+mediated+by+the+chromatin+remodeling+complex+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF.</a> Cell. 97 (7), 833-842 (1999).</li>
<li>Polach, K. J., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+enzymes+as+probes+of+nucleosome+stability+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics.</a> Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).</li>
<li>Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+access+of+proteins+to+buried+nucleosomal+DNA+target+sites+occurs+via+a+mechanism+that+is+distinct+from+nucleosome+translocation%2C+Mol.Cell+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol.</a> 22 (20), 7147-7157 (2002).</li>
<li>Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+through+directional+DNA+translocation+from+an+internal+nucleosomal+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).</li>
<li>Gottschalk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribosyl%29ation+directs+recruitment+and+activation+of+an+ATP-dependent+chromatin+remodeler%2C+Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.</a> 106 (33), 13770-13774 (2009).</li>
<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Measurement+of+Rapid+Inorganic+Phosphate+Release+Using+a+Novel+Fluorescent+Probe+and+Its+Application+to+Actomyosin+Subfragment+1+ATPase%2C+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry.</a> 33 (27), 8262-8271 (1994).</li>
<li>Luk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+histone+replacement+by+SWR1+requires+dual+activation+with+histone+H2A.Z+and+canonical+nucleosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome.</a> Cell. 143 (5), 725-736 (2010).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

כדי להבטיח ששיפוץ הנוקלאוזום ופעילויות ATPase שאנו רואים במבחנים תלויים בפעילות הקטליטית של מתחמי INO80, ולא על זיהום ו / או אנזימי ATPase שיפוץ, אנו הנוקלאוזום באופן שגרתי assay שיפוץ ופעילות ATPase של גרסאות כקטליזאטור פעילים של מתחמי INO80, מטוהר ב במקביל עם הסוג בר INO80 תוך שימוש באותו ההליך. גם תגובת ביקורת שלילית חסרת ATP צריכה להתבצע כאשר מנסים לאמוד את פעילות שיפוץ הנוקלאוזום כדי לבדוק את קיומו של זיהום ATP ו / או פעולות שיפוץ ATP-עצמאיות, אשר עלול לסבך את הפרשנות של ניסו...

מתחמי שיפוץ הכרומטין משפחת SNF2 כוללים מקטע ATPase מרכזי כמו SNF2-1,2. פונקציה מסוימת כמו SNF2-ATPases כאנזימים למקטע אחד, בעוד שאחרים לתפקד כמקטע קטליטי של מתחמים רב למקטע גדולים יותר. הבהרת המנגנונים המולקולריים שבאמצעותו כל אחד מיחידות המשנה של הכרומטין מתחמי שיפוץ לתרום לפעילויות שלהם דורש את היכולת לבצע מבחני ביוכימיים שלנתח את תהליך שיפוץ. שיפוץ הנוקלאוזום תלוי ATP על ידי מורכב INO80 האנושי ואנזימי הכרומטין שיפוץ אחרים יכול להיות שחזה כתהליך רב שלבים שמתחיל בכריכה של אנזים שיפוץ לnucleosomes, ואחרי הפעלה של דנ&quot;א ו / או ATPase הנוקלאוזום תלוי, טרנסלוקציה של אנזים שיפוץ על DNA nucleosomal, ומיצוב מחדש סופו של הדבר nucleosomes 1,2. הבנת הפרטים המולקולריים של r תהליך שיפוץ הכרומטין תלוי ATPequires נתיחה של תגובת שיפוץ לשלבים הבודדים שלה והגדרתה של תרומתם של יחידות משנה נפרדות של מתחם שיפוץ הכרומטין לכל צעד של התגובה. ניתוח מסוג זה דורש היכולת לנתח שיפוץ הנוקלאוזום ופעילויות אחרות באמצעות מצעים מולקולריים מוגדרים במבחנה. בפרוטוקול יופיטר קודם, שתארנו תהליכים המשמשים ליצירת מתחמי INO80 שיפוץ הכרומטין וsubcomplexes עם יצירות למקטע מוגדרים 3. כאן, אנו מציגים שלושה מבחני ביוכימיים שיאפשר ניתוח כמותי של הנוקלאוזום המחייב, דנ&quot;א וATPase מופעל הנוקלאוזום, ופעילויות שיפוץ הנוקלאוזום הקשורים למתחמים כאלה.

<table><tbody><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>10x מאגר תגובת PCR&nbsp;</td><td>רוש מדע יישומי&nbsp;</td><td></td><td></td>11435094001</tr><tr><td>רוש טאק DNA פולימראז</td><td>רוש מדע יישומי&nbsp;</td><td></td><td></td>11435094001</tr><tr><td>NucAway עמודי ספין ללא נוקלאז'&nbsp;</td><td>חתול אמביון</td><td># AM10070</td><td></td></tr><tr><td>ATP אולטרה-טהור &nbsp;</td><td>USB/Affymetrix</td><td>77241 25 UM</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין &nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>A9418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>40% אקרילאמיד/ביס 37.5:1</td><td>אמרסקו</td><td>0254-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>DNA של זרע סלמון סוניק&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>27-4565-01</td><td></td></tr><tr><td>10% אמוניום פרסולפט (APS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>17874</td><td></td></tr><tr><td>בנזונאז&nbsp;</td><td>חתול נובגן</td><td>. מס' 70664</td><td></td></tr><tr><td>dCTP, [&alpha;-32P]- 6,000 Ci/mmol</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU013Z250UC</td><td></td></tr><tr><td>PCR מחזורי תרמי PTC 200</td><td>MJ Research</td><td>PTC 200</td><td></td></tr><tr><td>יחידת אלקטרופורזה אנכית Hoefer</td><td></td><td>SE600X-15-1.5</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה משומנים 1.5 מ"ל&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>מסך זרחן אחסון&nbsp;</td><td>דינמיקה מולקולרית</td><td>63-0034-79</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון 3 מ"מ</td><td>Whatman&nbsp;</td><td>28458-005</td><td>VWR</td></tr><tr><td>טייפון זרחןImager&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant תוכנה</td><td>GE Healthcare</td><td>ver2003.02</td><td></td></tr><tr><td>TLC לוחות זכוכית, PEI-Cellulose F</td><td>Millipore</td><td>5725-7</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL ממברנת העברה 7 x 8.4</td><td>Millipore</td><td>IPFL07810</td><td></td></tr><tr><td>מד סקר לשימוש כללי עם חלון קצה או פנקייק GM (Geiger-Mueller) בדיקה</td><td>Biodex</td><td>דגם 14C</td><td></td></tr></tbody></table>

מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של atp תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

חברים במשפחת SNF2 של ATPases מתפקדים לעתים קרובות כמרכיבים של קומפלקסים של שיפוץ כרומטין מרובי תת-יחידות המווסתים את הדינמיקה של הנוקלאוזומים ואת נגישות ה-DNA על ידי זירוז שיפוץ נוקלאוזומים תלוי ATP. ניתוח ביוכימי של התרומות של יחידות משנה בודדות של קומפלקסים כאלה לתגובת שיפוץ הכרומטין הרב-שלבית התלויה ב-ATP דורש שימוש במבחנים המנטרים את ייצור תוצרי התגובה ומודדים את היווצרותם של תוצרי ביניים לתגובה. פרוטוקול JOVE זה מתאר בדיקות המאפשרות למדוד את הפעילויות הביוכימיות של קומפלקסים או תת-קומפלקסים של שיפוץ כרומטין המכילים שילובים שונים של תת-יחידות. שיפוץ כרומטין נמדד באמצעות בדיקת הזזה של נוקלאוזום תלויה ב-ATP, המנטרת את תנועת הנוקלאוזום על מולקולת DNA בשיטה מבוססת בדיקת שינוי ניידות אלקטרופורטית (EMSA). פעילות קשירת נוקלאוזומים נמדדת על ידי ניטור היווצרות מחדש של מונונוקלאוזומים קשורים מורכבים בשיטה דומה מבוססת EMSA, ופעילות ATPase תלויה ב-DNA או נוקלאוזום נבדקת באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC) כדי למדוד את קצב ההמרה של ATP ל-ADP ופוספט בנוכחות DNA או נוקלאוזומים. באמצעות מבחנים אלה, ניתן לבחון את הפונקציות של יחידות משנה של קומפלקס שיפוץ כרומטין על ידי השוואת הפעילויות של הקומפלקס השלם לאלה שחסרות תת-יחידה אחת או יותר. קומפלקס שיפוץ הכרומטין האנושי INO80 משמש כדוגמה; עם זאת, ניתן להתאים את השיטות המתוארות כאן למחקר של מתחמי שיפוץ כרומטין אחרים.

הנתונים מראים תוצאות נציג של מבחני ביוכימיים משמשים כדי לאפיין פעילויות INO80, כוללים הנוקלאוזום הזזה (איור 1) ומחייב (איור 2) מבחני ודנ&quot;א או מבחני הנוקלאוזום תלוי ATPase (איור 3). הניסוי שמוצג באיור 1 משווה את היכולת של מתחמי INO80 שלמים מטוהר באמצעות FLAG-Ies2 או FLAG-INO80E ושל INO80 subcomplexes מטוהר או דרך FLAG-Ino80ΔN או Ino80ΔNΔHSA ל...

כאן אנו מתארים מבחנים ביוכימיים שניתן להשתמש בהם כדי לאפיין אנזימים לעיצוב מחדש של כרומטין תלויי ATP על יכולותיהם 1) לזרז החלקה של נוקלאוזום תלוי ATP, 2) לעסוק במצעי נוקלאוזום, ו-3) הידרוליזה של ATP באופן תלוי נוקלאוזום או DNA.

מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

מטרתו של ההליך הבא היא למדוד פעילויות ביוכימיות שונות של קומפלקסים לשכתוב כרומטין התלויים ב-TP. דבר זה מושג על ידי מדידת החלקה תלוית TP של נוקלאוזום ממוקם מקצה אחד של מולקולת DNA לעמדה מרכזית יותר על גבי ה-DNA, באמצעות בדיקת הזזה של ניידות אלקטרופורטית או emsa. שיטה דומה המבוססת על EMSA יכולה לשמש למעקב אחר היווצרות אזורי מונו-נוקלאוזומים הקשוריים לקומפלקס השכתוב, כדי להעריך את פעילות קישור הנוקלאוזומים של קומפלקסים לשכתוב כרומטין.בנוסף, ניתן להשתמש בכרומטוגרפיה בשכבה דקה כדי למדוד את פעילות ה-APAs של קומפלקסים של עיצוב מחדש של כרומטין התלויים ב-TP. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטות אלו כדי למדוד את עיצוב הכרומטין מחדש התלוי ב-TP של קומפלקסים של human in O 80. בסרטון זה, נדגים בדיקות ביוכימיות לחקר קומפלקסים של עיצוב כרומטין מחדש של NO 80.ניתן להחיל שיטה דומה גם כדי לחקור קומפלקסים אחרים של רמיקולציה של כרומטין, וכן כדי לבצע בדיקת רמיקולציה של נוקלאוזומים התלויה ב-TP. ראשית, הכין תתי-מנשרי נוקלאוזומים לאחר הגדרת תגובת PCR בנפח של 100 µL כפי שפורט בטבלה. בצע את תגובות ה-PCR בטרמיקלר ולאחר מכן העבר את תוצרי התגובה פעמיים דרך עמודי ספין נטולי נוקלאז כדי להסיר נוקלאוטידים שלא נשלבו.בשלב הבא, ערבבו שתי פמול של מקטעי DNA 6 0 1 המסומנים ב-P 32 עם שישה מיקרוגרם של נוקלאוזומים של hilar ב-50 µL של בופר, והדגירו את התערובת בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, בצעו דילול רצף של התערובת לריכוזים של 0.8 M, 0.6 M ו-0.4 M של sodium chloride על ידי הוספה של 12.5 µL, 20.8 µL ו-41.6 µL, בהתאמה, של תמיסת בופר tris HCL המועשרת ב-E-D-T-A-P-M-S-F ו-DTT; הדגירו למשך 30 דקות ב-30 °C לאחר כל הוספה. לאחר הדגאה האחרונה, הוסיפו 125 ולאחר מכן 250 µL של בופר tris hydrochloride המועשר ב-non indebt P 40 glycerol ו-PSA, בשני שלבי דילול נוספים למשך 30 דקות ב-30 °C, עד לריכוזים של 0.2 M ו-0.1 M של sodium chloride, בהתאמה.לאחר מכן, אחסנו את מצע המונו-נוקלאוזום בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך עד שלושה חודשים לפני הכנת הבדיקות ויציקת ג'לים של poly acrylamide במצב טבעי (native). לאחר מכן, עבור כל תגובה שיש לבצע, ערבבו כ-20 nanomolar של NO 80 עם כמות מתאימה של באפר EB 100 המספיקה להגעה לנפח של 4.75 microliters בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה סיליקונית מקוררת מראש בנפח 1.5 milliliter. הקפיאו מיד שוב את כל שאר הפראקציות המכילות NO 80 באמצעות קרח יבש גרוס.בשלב הבא, העבירו 5.25 µL של תערובת מאסטר (master cocktail) שהוכנה טרי לכל מבחנת תגובה, וערבבו היטב באמצעות פיפוט מעלה ומטה. לאחר מכן, דגרו את התגובות בבלוק חימום בטמפרטורה של 30 °C. בתום הדגירה, הוסיפו 1.5 µL של תערובת עצירה (removing mix) שהוכנה טרי לכל מבחנה כדי להפסיק את התגובות, ולאחר מכן ערבבו כל מבחנת תגובה.נסוב אותם בצנטריפוגה ונדגיר אותם בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות נוספות. בינתיים, נבצע הרצה מקדימה של ג'ל poly acrylamide נייטיבי ביחידת אלקטרופורזה אנכית במתח של 100 volts למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C, תוך שימוש ב-0.5 XTBE כבופר הרצה ועם מוט ערבוב מגנטי בתא התחתון כדי לשמור על סירקולציה קבועה של הבופר. בסיום הדגירה, נסיר את התערובת ונערבב 2.5 µL של צבע טעינה עם כל תגובה. לאחר סבוב קצר בצנטריפוגה, נשתמש בטיפים לטעינה כדי להטעין את הדגימות על הג'ל.הרץ את הג'ל במתח של 200 volts למשך 4.5 hours בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס עם סירקולציה של הבאפר. לאחר מכן, העבר את הג'ל לערימה של שני דפי נייר סינון וכסה את דפי הסינון עם הג'ל מעליהם באמצעות ניילון נצמד שקוף כדי לזהות את האות. חשוף את הג'ל למסך פוספור של אחסון בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי, ולאחר מכן סרוק את המסך באמצעות מערכת סריקה לדמיון איזוטופי ונתח את הנתונים באמצעות התוכנה המתאימה לביצוע בדיקות APAs תלויות DNA ונוקלאוזום.התחל בשילוב של 10 עד 50 nanomolar של תת-הקומפלקסים שעברו טיהור אימונולוגי עם כמות של באפר eeb 100 המספיקה להגעה לנפח של 2.2 µL בתוך מבחנה אחת של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL, משומנת ומקוררת מראש, עבור כל תגובה, ולאחר מכן הקפא מיד מחדש את כל הפראקציות המכילות NO 80 בתוך קרח יבש גרוס. לאחר מכן, ערבב בעדינות 2.8 µL של תת-קוקטייל שהוכן טרי ומכיל נוקלאוזומי DNA או ללא כאלה, אל תוך מבחנות התגובה המכילות את האנזים באמצעות פיפוט מעלה ומטה, והעבר את המבחנות לבלוק חימום בטמפרטורה של 30 °C. בשלב הבא, השתמש בעיפרון כדי לסמן קו קל מאוד במרחק של לפחות 1.5 cm מהקצה התחתון של פוליאתילן בגודל 20 על 10.כוונתי היא לכרומטוגרפיה בשכבה דקה או פלטת TLC. לאחר מכן, טפטפו 0.5 µL מכל תערובת תגובה על הקו בנקודות זמן של 5, 15, 30 ו-60 דקות לאחר ההדגרה, והחזירו מיד כל דגימה לבלוק החימום, כדי שניתן יהיה לקחת מספר נקודות זמן ממבחנה אחת. לאחר הנחת הדגימה האחרונה, השתמשו במייבש שיער כדי לייבש את הפלטה, ואז העבירו את הפלטה לתא זכוכית המכיל כמות מספקת.פוספט אשליב 0.375 מולארי כדי לאפשר ל-0.5 סנטימטרים התחתונים של לוח ה-TLC להיות טבולים בתמיסה. כסו את התא והמתינו לפיתוח התגובה עד שחזית השלב הנוזלי תגיע לקצה העליון של לוח ה-TLC, ובשלב זה יש לייבש את הלוח מיד על ידי נשיפת אוויר ולחשוף אותו למסך זחורלל (phospho screen) לאחסון בטמפרטורת החדר. לבסוף, סרקו את המסך באמצעות מערכת סריקה של דימות איזוטופים כדי לקבוע את הכמות של סובסטרט a TP רדיואקטיבי ומוצר a DP.ניסוי ראשון זה מדגים כי קומפלקסים שטוהרו באמצעות flag IES two flag, N-O-A-T-E ו-flag NO 80 delta N בעלי פעילויות דומות להחלקת נוקלאוזומים, מה שמעיד על כך שהקצה N של NO 80 ו/או תתי-היחידות המשויכות אליו אינם הכרחיים לשחזור נוקלאוזומים על ידי קומפלקס NO 80. לעומת זאת, קומפלקסים שטוהרו באמצעות flag NO 80 delta n delta HSA אינם פעילים במבחן זה, מה שמעיד על כך שפעילות השחזור תלויה בדומיין HSA של NO 80 APAs ו/או בתתי-היחידות המשויכות אליו. באמצעות שינוי של פרוצדורת מבחן החלקת הנוקלאוזומים, ניתן למדוד את פעילות הקישור לנוקלאוזומים של קומפלקסים לשחזור כרומטין.בניסוי זה, דגירה של הנוקלאוזומים עם כמויות גדלות של קומפלקסי NO 80 שלמים שzוזקקו באמצעות תת-היחידה NO 80 E הובילה להיעלמות תלוית-מינון של הפס המקביל למנוקלאוזומים חופשיים ולהופעה של מין מוסט חדש שנעל של השוליים העליונים של הג'ל. בניגוד לכך, כאשר הנוקלאוזומים דגרו עם קומפלקסים קטנים יותר שזוקקו באמצעות NO 80 delta N והיו חסרים קבוצה של תת-יחידות NO 80, המין המוסט נעל במהירות רבה יותר, מה שמרמז כי הניידות היחסית של הפס בעל ההסטה הגבוהה נקבעת על ידי גודל הקומפלקסים בניסוי. בניסוי סופי זה, מוצגות תוצאות של בדיקה המשווה בין פעילויות ה-APAs המופעלות על ידי DNA ועל ידי נוקלאוזומים של שני תת-קומפלקסים שונים של NO 80.הכתמים בעלי נדידתם האיטית יותר תואמים ל-TP המסומן ב-alpha 32 P, והמינים בעלי נדידתם המהירה יותר הם תוצרי התגובה A DP, כאשר השטחים מציינים את כיוון נדידת הממס. בעת שימוש בנהלים אלו, חשוב לזכור לבצע בדיקות המשתנות באורך הזמן ומכילות ריכוזים שונים של אנזים. דבר זה יבטיח שהמדידות יבוצעו כאשר עקומות התגובה לזמן ולמינון של התוצר הן ליניאריות.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו מנתחים את פעילות קישור הנוקלאוזומים ופעילות החלקת הנוקלאוזומים של קומפלקסים מנוקים של רמיסת כרומטין. זכרו שעבודה עם חומרים רדיואקטיביים עלולה להיות מסוכנת. יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת חלוק מעבדה והגנה על העיניים, ניטור זיהום רדיואקטיבי ופינוי נאות של פסולת רדיואקטיבית.

biochemical-assays-for-analyzing-activities-atp-dependent-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד הכרומטין immunoprecipitation (שבב) משמש ללימוד שינויים דינאמיים לתבנית הכרומטין המווסתים את שעתוק המושרה על ידי במסלול הולכת אותות.

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם

ניתוח הכרומטין אינטראקציה ידי מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) היא...

הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

אנו מתארים פרוטוקול בסיסי לכימות פעילות ATPase במבחנה. ניתן לבצע אופטימיזציה של פרוטוקול זה על סמך רמת הפעילות והדרישות עבור ATPase מטוהר נתון.

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות ATPase עבור אנזימתי אפיון

הפקת מלח רציפים של חלבוני כרומטין מאוגד הוא כלי שימושי לקביעת מאפייני האיגוד של מתחמי חלבון גדולה. שיטה זו יכולה להיות מועסק כדי להעריך את התפקיד של subunits בודדים או קבוצות מחשבים הנמצאות בזיקה הכוללת של חלבון מורכב בכמות גדולה כרומטין.

עקירות מלח רציפים לניתוח של כרומטין בצובר מחייב מאפיינים של כרומטין שינוי מתחמי

פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

מעכבי אצטילtransferases histone (HATs, המכונה גם ליסין אצטילטרנספראזים), כגון CBP/p300, הם טיפוליים פוטנציאליים לטיפול בסרטן. עם זאת, יש צורך בשיטות קפדניות לאימות מעכבים אלה. שלוש שיטות במבחנה לאימות כוללות ASSays HAT עם אצטילטרנספראזים רקומביננטי, immunoblotting עבור אצטילציה היסטון בתרבות התא, ו ChIP-qPCR.

תסרוקות לאימות מעכבי אצטילטרנספראז היסטון

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת כרומטין מרקמות קפואות והוא מתאים ל- Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ואחריו ניתוח PCR כמותי (X-ChIP-qPCR) או גישות ריצוף מהדור הבא (X-ChIP-seq).

מיצוי כרומטין מרקמת כבד כימרית קפואה לניתוח משקעים חיסוניים של כרומטין

האינטראקציה של שיפוץ כרומטין תלוי ATP עם ליגנד DNA מתוארת באמצעות ספקטרוסקופיה CD. ניתן להשתמש בשינויים הקונפורמציה המושרים על מקדם גנים שניתח על ידי הפסגות שנוצרו כדי להבין את מנגנון הרגולציה התמלולית.

ספקטרוסקופיה של תקליטור לחקר אינטראקציות בין DNA לחלבון

פרוטוקול זה מתאר סוללה של שיטות הכוללות כרומטוגרפיה אנליטית של אי-הכללת גודל כדי לחקור אוליגומריזציה ויציבות של מלווה היסטון, בדיקת משיכה למטה כדי לפענח אינטראקציות של מלווה היסטון-היסטון, AUC כדי לנתח את הסטויכיומטריה של קומפלקסי החלבונים, ומבחן מלווה היסטון כדי לאפיין באופן פונקציונלי מלווה היסטון במבחנה.

במבחנה אפיון מלווי היסטון באמצעות מבחני אנליטיקה, משיכה וליווי

מסך DNA, טכניקת הדמיה של מולקולות בודדות בתפוקה גבוהה, מספק פלטפורמה להדמיה בזמן אמת של אינטראקציות חלבון-דנ"א מגוונות. הפרוטוקול הנוכחי משתמש בטכניקת מסך הדנ"א כדי לחקור את התפקיד הביולוגי והמנגנון המולקולרי של Abo1, סכיזוסקרומיצס פומבה ברומודומיין המכיל AAA+ ATPase.

פענוח מנגנון מולקולרי של הרכבת היסטון בטכניקת מסך DNA

בדיקות כימיות מהירות ומדויקות לסינון מעכבים ספציפיים הן כלי חשוב בארסנל פיתוח התרופות. כאן, אנו מציגים בדיקה כימית מדרגית של קליק אצטיל-קליק כדי למדוד את העיכוב של פעילות אצטילציה HAT1.

בדיקת כימיה של צטיל קליק למדידת אצטילטרנספראז היסטון 1 אצטילציה

למדו מבחנים ביוכימיים לניתוח פעילויות אנזימי שיפוץ כרומטין תלויי ATP באמצעות EMSA וכרומטוגרפיית שכבה דקה. שיטות אלו מאפשרות מדידת החלקת נוקלאוזומים ופעילות ATPase במחקר ביוכימי.

מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

גלה סרטונים נוספים