מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

מטרתו של ההליך הבא היא למדוד פעילויות ביוכימיות שונות של קומפלקסים לשכתוב כרומטין התלויים ב-TP. דבר זה מושג על ידי מדידת החלקה תלוית TP של נוקלאוזום ממוקם מקצה אחד של מולקולת DNA לעמדה מרכזית יותר על גבי ה-DNA, באמצעות בדיקת הזזה של ניידות אלקטרופורטית או emsa. שיטה דומה המבוססת על EMSA יכולה לשמש למעקב אחר היווצרות אזורי מונו-נוקלאוזומים הקשוריים לקומפלקס השכתוב, כדי להעריך את פעילות קישור הנוקלאוזומים של קומפלקסים לשכתוב כרומטין.

בנוסף, ניתן להשתמש בכרומטוגרפיה בשכבה דקה כדי למדוד את פעילות ה-APAs של קומפלקסים של עיצוב מחדש של כרומטין התלויים ב-TP. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטות אלו כדי למדוד את עיצוב הכרומטין מחדש התלוי ב-TP של קומפלקסים של human in O 80. בסרטון זה, נדגים בדיקות ביוכימיות לחקר קומפלקסים של עיצוב כרומטין מחדש של NO 80.

ניתן להחיל שיטה דומה גם כדי לחקור קומפלקסים אחרים של רמיקולציה של כרומטין, וכן כדי לבצע בדיקת רמיקולציה של נוקלאוזומים התלויה ב-TP. ראשית, הכין תתי-מנשרי נוקלאוזומים לאחר הגדרת תגובת PCR בנפח של 100 µL כפי שפורט בטבלה. בצע את תגובות ה-PCR בטרמיקלר ולאחר מכן העבר את תוצרי התגובה פעמיים דרך עמודי ספין נטולי נוקלאז כדי להסיר נוקלאוטידים שלא נשלבו.

בשלב הבא, ערבבו שתי פמול של מקטעי DNA 6 0 1 המסומנים ב-P 32 עם שישה מיקרוגרם של נוקלאוזומים של hilar ב-50 µL של בופר, והדגירו את התערובת בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, בצעו דילול רצף של התערובת לריכוזים של 0.8 M, 0.6 M ו-0.4 M של sodium chloride על ידי הוספה של 12.5 µL, 20.8 µL ו-41.6 µL, בהתאמה, של תמיסת בופר tris HCL המועשרת ב-E-D-T-A-P-M-S-F ו-DTT; הדגירו למשך 30 דקות ב-30 °C לאחר כל הוספה. לאחר הדגאה האחרונה, הוסיפו 125 ולאחר מכן 250 µL של בופר tris hydrochloride המועשר ב-non indebt P 40 glycerol ו-PSA, בשני שלבי דילול נוספים למשך 30 דקות ב-30 °C, עד לריכוזים של 0.2 M ו-0.1 M של sodium chloride, בהתאמה.

לאחר מכן, אחסנו את מצע המונו-נוקלאוזום בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך עד שלושה חודשים לפני הכנת הבדיקות ויציקת ג'לים של poly acrylamide במצב טבעי (native). לאחר מכן, עבור כל תגובה שיש לבצע, ערבבו כ-20 nanomolar של NO 80 עם כמות מתאימה של באפר EB 100 המספיקה להגעה לנפח של 4.75 microliters בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה סיליקונית מקוררת מראש בנפח 1.5 milliliter. הקפיאו מיד שוב את כל שאר הפראקציות המכילות NO 80 באמצעות קרח יבש גרוס.

בשלב הבא, העבירו 5.25 µL של תערובת מאסטר (master cocktail) שהוכנה טרי לכל מבחנת תגובה, וערבבו היטב באמצעות פיפוט מעלה ומטה. לאחר מכן, דגרו את התגובות בבלוק חימום בטמפרטורה של 30 °C. בתום הדגירה, הוסיפו 1.5 µL של תערובת עצירה (removing mix) שהוכנה טרי לכל מבחנה כדי להפסיק את התגובות, ולאחר מכן ערבבו כל מבחנת תגובה.

נסוב אותם בצנטריפוגה ונדגיר אותם בטמפרטורה של 30 °C למשך 30 דקות נוספות. בינתיים, נבצע הרצה מקדימה של ג'ל poly acrylamide נייטיבי ביחידת אלקטרופורזה אנכית במתח של 100 volts למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C, תוך שימוש ב-0.5 XTBE כבופר הרצה ועם מוט ערבוב מגנטי בתא התחתון כדי לשמור על סירקולציה קבועה של הבופר. בסיום הדגירה, נסיר את התערובת ונערבב 2.5 µL של צבע טעינה עם כל תגובה. לאחר סבוב קצר בצנטריפוגה, נשתמש בטיפים לטעינה כדי להטעין את הדגימות על הג'ל.

הרץ את הג'ל במתח של 200 volts למשך 4.5 hours בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס עם סירקולציה של הבאפר. לאחר מכן, העבר את הג'ל לערימה של שני דפי נייר סינון וכסה את דפי הסינון עם הג'ל מעליהם באמצעות ניילון נצמד שקוף כדי לזהות את האות. חשוף את הג'ל למסך פוספור של אחסון בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי, ולאחר מכן סרוק את המסך באמצעות מערכת סריקה לדמיון איזוטופי ונתח את הנתונים באמצעות התוכנה המתאימה לביצוע בדיקות APAs תלויות DNA ונוקלאוזום.

התחל בשילוב של 10 עד 50 nanomolar של תת-הקומפלקסים שעברו טיהור אימונולוגי עם כמות של באפר eeb 100 המספיקה להגעה לנפח של 2.2 µL בתוך מבחנה אחת של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL, משומנת ומקוררת מראש, עבור כל תגובה, ולאחר מכן הקפא מיד מחדש את כל הפראקציות המכילות NO 80 בתוך קרח יבש גרוס. לאחר מכן, ערבב בעדינות 2.8 µL של תת-קוקטייל שהוכן טרי ומכיל נוקלאוזומי DNA או ללא כאלה, אל תוך מבחנות התגובה המכילות את האנזים באמצעות פיפוט מעלה ומטה, והעבר את המבחנות לבלוק חימום בטמפרטורה של 30 °C. בשלב הבא, השתמש בעיפרון כדי לסמן קו קל מאוד במרחק של לפחות 1.5 cm מהקצה התחתון של פוליאתילן בגודל 20 על 10.

כוונתי היא לכרומטוגרפיה בשכבה דקה או פלטת TLC. לאחר מכן, טפטפו 0.5 µL מכל תערובת תגובה על הקו בנקודות זמן של 5, 15, 30 ו-60 דקות לאחר ההדגרה, והחזירו מיד כל דגימה לבלוק החימום, כדי שניתן יהיה לקחת מספר נקודות זמן ממבחנה אחת. לאחר הנחת הדגימה האחרונה, השתמשו במייבש שיער כדי לייבש את הפלטה, ואז העבירו את הפלטה לתא זכוכית המכיל כמות מספקת.

פוספט אשליב 0.375 מולארי כדי לאפשר ל-0.5 סנטימטרים התחתונים של לוח ה-TLC להיות טבולים בתמיסה. כסו את התא והמתינו לפיתוח התגובה עד שחזית השלב הנוזלי תגיע לקצה העליון של לוח ה-TLC, ובשלב זה יש לייבש את הלוח מיד על ידי נשיפת אוויר ולחשוף אותו למסך זחורלל (phospho screen) לאחסון בטמפרטורת החדר. לבסוף, סרקו את המסך באמצעות מערכת סריקה של דימות איזוטופים כדי לקבוע את הכמות של סובסטרט a TP רדיואקטיבי ומוצר a DP.

ניסוי ראשון זה מדגים כי קומפלקסים שטוהרו באמצעות flag IES two flag, N-O-A-T-E ו-flag NO 80 delta N בעלי פעילויות דומות להחלקת נוקלאוזומים, מה שמעיד על כך שהקצה N של NO 80 ו/או תתי-היחידות המשויכות אליו אינם הכרחיים לשחזור נוקלאוזומים על ידי קומפלקס NO 80. לעומת זאת, קומפלקסים שטוהרו באמצעות flag NO 80 delta n delta HSA אינם פעילים במבחן זה, מה שמעיד על כך שפעילות השחזור תלויה בדומיין HSA של NO 80 APAs ו/או בתתי-היחידות המשויכות אליו. באמצעות שינוי של פרוצדורת מבחן החלקת הנוקלאוזומים, ניתן למדוד את פעילות הקישור לנוקלאוזומים של קומפלקסים לשחזור כרומטין.

בניסוי זה, דגירה של הנוקלאוזומים עם כמויות גדלות של קומפלקסי NO 80 שלמים שzוזקקו באמצעות תת-היחידה NO 80 E הובילה להיעלמות תלוית-מינון של הפס המקביל למנוקלאוזומים חופשיים ולהופעה של מין מוסט חדש שנעל של השוליים העליונים של הג'ל. בניגוד לכך, כאשר הנוקלאוזומים דגרו עם קומפלקסים קטנים יותר שזוקקו באמצעות NO 80 delta N והיו חסרים קבוצה של תת-יחידות NO 80, המין המוסט נעל במהירות רבה יותר, מה שמרמז כי הניידות היחסית של הפס בעל ההסטה הגבוהה נקבעת על ידי גודל הקומפלקסים בניסוי. בניסוי סופי זה, מוצגות תוצאות של בדיקה המשווה בין פעילויות ה-APAs המופעלות על ידי DNA ועל ידי נוקלאוזומים של שני תת-קומפלקסים שונים של NO 80.

הכתמים בעלי נדידתם האיטית יותר תואמים ל-TP המסומן ב-alpha 32 P, והמינים בעלי נדידתם המהירה יותר הם תוצרי התגובה A DP, כאשר השטחים מציינים את כיוון נדידת הממס. בעת שימוש בנהלים אלו, חשוב לזכור לבצע בדיקות המשתנות באורך הזמן ומכילות ריכוזים שונים של אנזים. דבר זה יבטיח שהמדידות יבוצעו כאשר עקומות התגובה לזמן ולמינון של התוצר הן ליניאריות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו מנתחים את פעילות קישור הנוקלאוזומים ופעילות החלקת הנוקלאוזומים של קומפלקסים מנוקים של רמיסת כרומטין. זכרו שעבודה עם חומרים רדיואקטיביים עלולה להיות מסוכנת. יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת חלוק מעבדה והגנה על העיניים, ניטור זיהום רדיואקטיבי ופינוי נאות של פסולת רדיואקטיבית.