פציעה דקירת פצע של דג הזברה telencephalon מבוגרים: שיטה לחקר המוח של בעלי החוליות Neurogenesis והתחדשות
August 4th, 2014
כדי לשפוך אור על המנגנונים התאיים והמולקולריים של נוירוגנזה והתחדשות בוגרים של דג הזברה, פיתחנו פרוטוקול לניתוח פולשני הגורם לפציעות מכניות בטלנצפלון הבוגר של דג הזברה וניטור לאחר מכן של שינויים בחצי הכדור הדקירה על ידי אימונוהיסטוכימיה או הכלאה באתר.
המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור את התגובה התאית ואת המנגנונים המולקולריים המעורבים בנוירוגנזה של מבוגרים ובהתחדשות ותיקון של מערכת העצבים המרכזית. בדגי זברה, זה מושג תחילה על ידי יצירת פציעה ידנית על ידי ניקוב חצי הכדור הצפלי הימני של דג זברה בוגר. לאחר מכן, חמישה ימים לאחר הפציעה, הדג מוקרב ומוחו מנותח ומוטמע בארוס לחיתוך באומה.
ואז חלקי המוח מוכתמים על ידי אימונוהיסטוכימיה או ב-C שתי הכלאות עם סמנים מתאימים. על מנת לצפות בהתפשטות התאים, מתקבלות תוצאות גליו, אגנזה ונוירוגנזה המראות ויסות מוגבר של סמן ההתפשטות, PCNA, סמן גליית הרדיו S 100 beta ו-oli שני תאי מבשר אוליגודנדרוציטים המסומנים ב-EGFP המסומנים באזור החדר בעת פציעת דקירה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת נוגע בגישה הטרנסגנית לייצור אבלציה ספציפית לרקמה או לסוג תא הוא הפשטות, המהירות והיעילות שלה, המאפשרת ייצור של מוחות פגועים רבים בזמן קצר.
לאחר הרדמת דגי זברה בוגרים, על פי פרוטוקול הטקסט, הניחו דגים בודדים לתוך חריץ בגוש נייר טישו ספוג טריקה תחת מיקרוסקופ מנתח עם אור מלמעלה. החזיקו בעדינות את הדג ביד אחת וכוונו אותו בצורה המאפשרת גישה לראש מלמעלה בעזרת מזרק המצויד במחט 30. מצד שני, דחפו את המחט אנכית דרך הגולגולת, לא יותר משני מילימטרים לתוך האזור המדיאלי של חצי כדור צפאלי אחד.
לאחר הכנסת הפגיעה הצפלית, הכניסו את הדג למי דגים טריים. בסיום, העבירו את הדגים בחזרה למערכת זרימת המים. לאחר שאפשרו לדגים להתאושש לפרק הזמן הרצוי והמתת חסד על פי פרוטוקול הטקסט, הקריבו אותם על קרח והשתמשו במספריים חדים כדי לחתוך מאחורי הזימים כדי להפריד את הראש מהגוף.
דגרו את הראשים ב-XPBS אחד למשך חמש דקות כדי לאפשר דימום. לאחר מכן העבירו את הראשים ל-4%para formaldehyde ב-PBS ודגרו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס או במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר לאחר הקיבוע. השתמש ב-XPBS אחד בצלחת פטרי כדי לשטוף את הראשים פעמיים.
ואז תחת מיקרוסקופ מנתח, נתח בזהירות את המוחות ב-PBS. השליכו כל מוח ללא נגע גלוי. העבירו את המוחות לשני צינורות תגובה של מיליליטר מלאים ב-1.5 מיליליטר של 100% מתנול והפכו את הצינורות חמש פעמים לפני הדגירה שלהם במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות לפחות.
כדי להחזיר לחות לרקמה לאימונוהיסטוכימיה, דגרו את המוחות למשך חמש דקות כל אחד בסדרת מתנול יורדת לפני שתשתמשו ב-PBS tween 20 או PTW כדי לשטוף את המוח חמש פעמים. במשך חמש דקות כל אחד. לאחר הטמעת המוח, השתמש בפיפטה העברה כדי למקם אותם בחללים של מגש יציקה מפוליאתילן להמיס 2% אגרוס ב-XPBS אחד על ידי חימום במיקרוגל ב-600 וואט.
הניחו לאגרוס להתקרר במשך שלוש דקות לפני השימוש. לאחר מכן הסר בזהירות את ה-PTW ממוח אחד לפני השימוש בארוס כדי למלא את התבנית לחלוטין. השתמש במחט הדיסקציה כדי לסובב את המוח בארוס כדי לשטוף את ה-PTW ולכוון את המוח כשהצד הגחוני כלפי מטה צד הגב כלפי מעלה ולמקם ישר לפני שתאפשר לאגרוס להתקרר.
בעזרת מחט חיתוך, הסר את גוש האגרוס מהתבנית. לאחר מכן, בעזרת סכין הגילוח החד, חותכים את האגרוס במקביל לטאלון צפלון בקצה האחורי של המוח. כעת חתכו את האגרוס בקצה הקדמי של המוח לפני שתהפכו את הבלוק כך שיעמוד על המישור האחורי.
הסר את עודפי האגרוס על ידי ביצוע חתכים במקביל לצד הגב והגחון של המוח. לאחר מכן הפוך את המוח לאחור כך שהוא מונח על הצד הגחוני שלו. לבסוף, חותכים את הבלוק למשולש קטום שבו הצפלון ממוקם במישור הקטן יותר.
לאחר הכנת ה-viome לפי הוראות היצרן, השתמש ב-XPBS אחד כדי למלא את אמבט החיץ כך שהוא פשוט יגיע לתחתית הלהב. לאחר מכן, הניחו נקודה קטנה של דבק-על על החלק העליון של דיסק הדגימה של הוויברטור. לאחר מכן הניחו בזהירות את מישור הבלוק שנמצא מאחורי המוח על דבק העל.
השתמש במניפולטור המיקרוטום כדי להכניס את דיסק הדגימה למגש החיץ ולסובב את דיסק הדגימה למצב הרצוי. לאחר מכן השתמש במפתח אלן של שלושה מילימטר כדי להדק את הבורג ולהסיר את המניפולטור. מקם את הבלוק באמבט החיץ כך שהקפלון נמצא ממש מתחת לפני השטח כאשר הצד הגבי של המוח פונה ללהב כדי לחתוך את המוח.
הכן צלחת של 24 בארות לאיסוף החלקים על ידי הוספת מיליליטר אחד של חיץ חוסם לכל מוח לבארות הצלחת עם המיקרוטום הרוטט. התחל לחתוך בעובי של 50 מיקרומטר, במהירות של מילימטר לשנייה ובתדר של 70 הרץ. בעזרת מברשת סינתטית מרימים את פרוסות הארוס הדקות כשהן יורדות מהלהב ואוספים אותן לצלחת 24 הבארות.
כדי לבצע אימונוהיסטוכימיה יש לחסום אתרים לא ספציפיים למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, הסר את המאגר והוסף 250 מיקרוליטר של נוגדנים מדוללים בדגירה חוסמת למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס או למשך שעתיים בטמפרטורת החדר לפני השימוש ב-PTW כדי לשטוף את הדגימות שלוש פעמים למשך דקה אחת כל אחת. לאחר דגירה ונוגדנים משניים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
שוטפים את החלקים שלוש פעמים. השתמש במדיום הרכבה שאינו פלואורסצנטי מסיס במים כדי להרכיב את החלקים. לאחר מכן נתח את הדגימות תחת מיקרוסקופ מורכב או קונפוקלי.
כאשר מבוצע כראוי, פצע מוביל לתעלת נגע המשתרעת מהגב לגחון דרך הפאלאם של האגדה צפלון שתתרפא לאחר 35 יום. זה הוצג בעבר באמצעות אימונוהיסטוכימיה. פציעה זו מעוררת ויסות מוגבר של PCNA, בטא S 100 ודפוס חופף שלושה עד שבעה ימים לאחר הנגע, מה שמעיד על התפשטות של תאי גליה רדיאליים.
איור זה מדגים הצטברות חולפת של תאי מבשר אוליגודנדרוציטים או OPCs בסמיכות לפצע דקירה המושרה באוליג טרנסגני שני דגי EEG FP שכבר לא נצפה ביום ה-35 לאחר הנגע. אם הנגע לא מוחדר כראוי, תעלת הנגע לא תהיה גלויה. לא ניתן לזהות ויסות מוגבר של PCNA ו-S 100 beta או הצטברות של OPCs.
כפי שמוצג כאן, מסך ביטוי מערכתי המשווה מווסתי שעתוק במוחם של דגים עם נגעים לעומת מוחות מסוג פרא זיהה מספר גורמים המתבטאים בטלפלון ואשר מווסתים בתגובה לפציעה. שיטת פצע הצעד בשילוב עם ריצוף עמוק של RNA ו/או הכלאה באתר, יכולה לסייע בזיהוי גנים חדשים המעורבים בנוירוגנזה, התחדשות ותיקון של דג הזברה.
סקירה כללית
מחקר זה חוקר את המנגנונים התאיים והמולקולריים של נוירוגנזה והתחדשות אצל דגי זברה בוגרים. פותח פרוטוקול לגרימת פציעות מכניות בטלנספלון של דג הזברה, המאפשר ניתוח עוקב באמצעות אימונוהיסטוכימיה והיברידציה in situ.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירומדע
- ביולוגיה התחדשותית
- ביולוגיה תאית
רקע
- דגי זברה הם אורגניזם מודלי לחקר נוירוגנזה.
- הבנת תגובת הפציעה במערכת העצבים המרכזית חיונית לרפואה התחדשותית.
- מחקרים קודמים הראו כי פציעה מעוררת התרבות תאים.
- אימונוהיסטוכימיה היא טכניקה מרכזית לניתוח תגובות תאיות.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול כירורגי לגרימת פציעת מוח בדגי זברה.
- לנטר תגובות תאיות לאחר פציעה.
- לנתח את העליה ברמות של מרכיבים ספציפיים הקשורים לנוירוגנזה.
שיטות ששימשו
- גרימת פציעה ידנית על ידי ניקוב מוח דג הזברה.
- ניתוח ושימור רקמת המוח לצורך ניתוח.
- טכניקות אימונוהיסטוכימיה והיברידציה in situ.
- ניתוח של התרבות תאים ותגובות גליאליות.
תוצאות עיקריות
- פציעה מובילה לעליה ברמות של מרכיבי התרבות כמו PCNA.
- נוכחות מוגברת של תאי גליה רדיאליים לאחר פציעה.
- ריפוי הנגע נצפה בתוך מסגרת זמן מוגדרת.
- הטכניקה מאפשרת ייצור יעיל של דגימות פצועות מרובות.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח יעיל לחקר נוירוגנזה בדגי זברה.
- הממצאים תורמים להבנת מנגנוני התחדשות מערכת העצבים המרכזית.
- מחקרים עתידיים יכולים לבנות על המתודולוגיה זו לתובנות נוספות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables mechanistic de-risking of neurogenic targets by providing a reproducible vertebrate model for CNS regeneration studies. It supports target validation through quantifiable proliferation and glial response readouts, facilitating early-stage hypothesis testing in discovery pipelines. The approach enhances predictive confidence for neurotherapeutic lead identification by linking injury response to molecular mechanisms in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses via quantifiable upregulation of PCNA and S100 beta markers post-injury.
- Operational Value: Provides a simple, rapid, and cost-efficient method to generate multiple injured models for target screening.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by linking lesion induction to observable neurogenic and gliogenic responses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated biological systems suitable for immunohistochemistry and in situ hybridization-based assay development.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized lesion depth and contralateral internal controls.
- Scientific Value: Enables quantitative readouts of cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers a disease-relevant system to study continuity from acute injury response to long-term regeneration and repair.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by enabling temporal profiling of marker expression (e.g., PCNA, S100 beta, OPCs) across post-injury days.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by identifying injury-induced transcriptional regulators via RNA deep sequencing integration.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, enabling iterative refinement of neurogenic leads based on regeneration phenotypes.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target validation through lesion-induced marker upregulation and cellular response profiling.
- Screening: Delivers assay-ready tissue sections with standardized injury models for reproducible compound screening.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (e.g., PCNA+ cell density, OPC accumulation) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical work by modeling temporal dynamics of regeneration relevant to human CNS repair.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized platform for cross-project neurogenesis and regeneration screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through lesion-correlated neurogenic and gliogenic responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and high-throughput sample generation via simple manual injury induction.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in neurogenic pathway modulation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of leads based on regeneration efficacy in a vertebrate disease-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish neuroanatomy and microsurgical techniques for consistent lesion placement.
- Dependent on instrumentation for sectioning (vibratome), immunohistochemistry, and imaging (confocal/compound microscopy).
- Necessitates cross-team standardization of injury depth, fixation, and sectioning protocols for reproducible results.
- Adaptation considerations include transgenic reporter lines (e.g., olig2:EGFP) for cell-type-specific tracking across model systems.
- Practical limitations include variability in lesion canal formation if injury depth exceeds two millimeters or is misdirected.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:32
Generating a Stab Wound in the Telencephalon
2:21
Analyzing the Effect of Telencephalic Injury
4:36
Trimming the Agarose Block and Sectioning the Brain
6:36
Immunohistochemistry on Vibratome Sections
7:28
Telencephalon Stab Wound Results
8:49
Conclusion
