מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות

מטרת הליך זה היא לזהות ולכמת במדויק את השפע היחסי של חלבונים ספציפיים בתוך דגימה ביולוגית מורכבת באמצעות פיתול וכתמים כמותיים, פלואורסצנטיים. זה מושג על ידי תמציות חלבון מופרדות אלקטרו-פלואורסצנטיות ראשונות באמצעות ג'ל שיפוע טרומי. בשלב השני, עומס החלבון המקביל מאומת על פני כל נתיבי הדגימה באמצעות יישום כתם חלבון כולל, ולאחר מכן נעשה שימוש במערכת ההעברה המהירה של בלוק העין למחצה יבשה להעברת הדגימות על קרום A-P-V-D-F.

לבסוף, החלבונים נבדקים עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים ואחריהם הנוגדן המשני המתויג פלואורסצנטי המתאים כדי להקל על גילויים הרגישים, החזקים והליניאריים באורכי גל אינפרא אדום ואדום רחוק. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בפריחה מערבית פלואורסצנטית כמותית כדי לזהות, לדמיין ולכמת במדויק מספר רב של חלבונים קשורים ומסיסים בממברנה על פני מגוון רחב של דגימות רקמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון הדמיה מבוססת ECL, הוא שהיא מאפשרת רגישות רבה יותר עם דיוק משופר בקנה מידה ליניארי רחב לקריאה כמותית באמת התחל על ידי השריה ידנית של דגימת הרקמה, ולאחר מכן הומוגניזציה במאגר מיצוי טרי שהוכן במשקל רקמה של כ-1 עד 10 לנפח חיץ עד ליצירת הומוגנט עקבי חלק

לאחר מכן, צנטריפוגה של התא ליזאט למשך 20 דקות ב 20, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו את ה-sate המכיל את החלבונים המסיסים לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה נקי ואחסנו גם את הגלולה וגם את חלקי ה-S בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לצורך. לאחר קביעת ריכוז החלבון של הספינאט, העבירו 15 מיקרוגרם חלבון לדגימה לצינורות מיקרו צנטריפוגה חדשים.

לאחר מכן הביאו את הנפח הסופי של כל דגימה עד 10 מיקרוליטר עם מים מזוקקים והוסיפו חמישה מיקרוליטר של מאגר טעינת מט"ח. ערבבו היטב את תמיסות התאים על ידי מערבולת, ולאחר מכן חממו את הדגימות ב-98 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות כדי לנטרל את החלבונים. לאחר דנטורציה, הוסף שלושה מיקרוליטרים בתקן משקל מולקולרי מתאים לבאר הראשונה של כל אחד מג'לי בקרת הניסוי והטעינה.

לאחר מכן, טען 10 מיקרוליטר מכל דגימה לבארות הבאות המתאימות לאחר אלקטרופורזה. השתמש בסכין ג'ל כדי לשחרר את הג'לים מהקסטה ולהסיר את הבארות ואת רגלי הג'ל. סמן את הג'ל כדי לסייע בהתמצאות מאוחרת יותר.

לאחר מכן, כדי לקבוע את עומס החלבון המקביל, שפכו כ-30 מיליליטר של כתם חלבון לתוך צלחת פטרי מרובעת בגודל 12 על 12 סנטימטר והניחו את ג'ל בקרת ההעמסה לתוך הכתם, תוך הבטחה שהתמיסה מכסה את כל הג'ל. ערבבו בעדינות את הג'ל למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן השליכו את כתם החלבון ושטפו את הג'ל שלוש פעמים במים מזוקקים לפני הדמיה של חסימת העין. שני העברת חלבון מהירה חצי יבשה לאחר אלקטרופורזה, הכינו את ערימת ההעברה התחתונה על ידי הסרת מכסה נייר הכסף והרטבה מראש של הממברנה עם מאגר פועל ישירות ממיכל הג'ל.

הרטיבו מחדש את נייר הסינון במים מזוקקים גם בשלב זה. לאחר מכן, שרכו את הג'ל הניסיוני על ערימת ההעברה התחתונה המוכנה, ולאחר מכן הניחו את נייר הסינון לפני העבודה על הג'ל וגלגלו את שניהם כדי להבטיח שלא יילכדו בועות בין השכבות. הנח את הערימה העליונה על גבי נייר הסינון והערימה התחתונה.

לאחר מכן גלגל את כריך ערימת ההעברה כדי לחסל בועות אוויר. הכנס את הספוג מערכת ערימת ההעברה על כרית הסופגת והנח את כריך ערימת ההעברה בחלל הייעודי. לאחר מכן סגור את המכסה היטב והתחל את I block two, והעביר את החלבונים למשך שבע דקות בתוכנית השלישית.

בסיום התוכנית, הסר את ערימת ההעברה ממכונת חסימת העיניים וקלף לאחור את ערימת ההעברה העליונה ואת שכבות נייר הסינון תוך חשיפת הג'ל בערימת ההעברה התחתונה. השתמש באזמל כדי לחתוך סביב הג'ל תוך הקפדה על ביצוע חתך משולש למטרות התמצאות על הממברנה לאחר חיתוך הממברנה כדי לבדוק את כתם החלבון של יעילות ההעברה, הג'ל כפי שהודגם זה עתה, ולאחר מכן העביר במהירות את הממברנה לתוך צינור נקי של 50 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר PBS לראשון מבין שלושה, חמש דקות שטיפות על רולר מכני. לאחר הכביסה השלישית, השליכו את מאגר הכביסה ודגרו את הממברנה במאגר חוסם לא מדולל למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, דגרו את הממברנה בנוגדנים ראשוניים מדוללים בחמישה מיליליטר של חיץ חוסם ו-0.1 בין 20 לילה בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה מתמדת. למחרת בבוקר לאחר השלכת תמיסת הנוגדנים העיקרית, שטפו את הממברנה שש פעמים במשך חמש דקות ב-PBS כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן דגרו את הממברנה בחושך עם נוגדן משני מתויג פלואורסצנטי, מורחב בחמישה מיליליטר של חיץ חוסם ו-0.1% בין 20 עם תסיסה מתמדת, ואחריו שש שטיפות PBS של חמש דקות לכל ההדמיה.

ראשית, היכנס למחשב ולמצלם. לאחר מכן פתח את תוכנת ההדמיה כדי לדמות את הכתם המערבי. ראשית, פתח את מכסה ההדמיה ושפך כמות קטנה של PBS על הכוס.

בפינה השמאלית התחתונה של ההדמיה, הנח את הממברנה על גבי ה-PBS וודא שהיא מרובעת עם הציר על ההדמיה, ושנותר רווח של סנטימטר אחד בין הממברנה לציר הרשת. גלגל את הממברנה כדי להבטיח שלא יילכדו בועות בין הזכוכית לממברנה, ולאחר מכן ספור את מספר הריבועים שהממברנה תופסת על ציר x ו-y. לאחר מכן, סגור את מכסה ההדמיה והזן את מספר הריבועים בתוכנת המחשב.

בחר את ערוץ האינפרא אדום המתאים ואת העוצמה המתאימה, והתחל את הסריקה כדי לדמיין את כתם החלבון הכולל של ג'ל בקרת ההעמסה. תקן את הג'ל ואת ההדמיה כפי שהודגם זה עתה עבור הממברנה הניסיונית, ולאחר מכן בחר את ערוץ ה-700. הגדר את העוצמה לחמש והתחל את הסריקה.

לכמת את נתוני הסריקה. התחילו בכוונון לחצני הבהירות והניגודיות של הקובץ הסרוק כדי להפיק את איכות התמונה הטובה ביותר, וסיבבו את התמונות הדרושות להשגת הכיוון הרצוי. לאחר מכן, בחר מלבן מתפריט הצורות והשתמש בו כדי לצייר מלבן סביב הנתיב כולו.

בנתיב לדוגמה אחד. העתק והדבק את הצורה סביב נתיב אחד כדי לדגום נתיב שני. לאחר אישור שמדידת הרקע אינה משלבת אות בנתיב הבא, צייר מלבן סביב כל נתיב עבור שאר נתיבי הדגימה.

לאחר מכן הצג את האות עבור טבלת הצורות עבור כל מלבן המצויר ביחידות פלואורסצנטיות שרירותיות ושמור את התמונה כמרה tiff. ישנם מספר אמצעי בקרה שהם חיוניים להבטחת איסוף נתונים מדויקים במהלך כתמים פלואורסצנטיים מערביים כמותיים. לדוגמה, רצוי לכלול דגימות בקרה חיוביות.

שנית, חשוב לייעל את זמן ההעברה כדי להבטיח תנועה שווה ערך של חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה ונמוך מהג'ל לממברנה. שלישית, יש לקבוע את דילול הנוגדנים הראשוני והמשניים המתאימים כדי למנוע פרשנות שגויה של החלבונים המעניינים עקב רצועות לא ספציפיות כפי שמוצג בתמונות אלה. רביעית, חשוב לשקול האם ייתכן שיהיה צורך בנוגדנים משניים שגדלו במין מארח אחר, במיוחד במקרים בהם לא מזוהה רצועת חלבון צפויה.

חמישית, ייצור ג'ל בקרת העמסה יכול לאשר את אחידות עומס הדגימה. בשילוב עם ניתוח חלבון כולל, ניתן להשתמש בג'ל כדי להשוות ולכמת את עומס החלבון בכל נתיב בטווחי משקל מולקולרי שונים כפי שנמדד מול כל דגימה. לבסוף, טכניקה זו מתאימה להפשטה ובדיקה מחדש של ממברנות עם גמישות רבה יותר מאשר זוהר קמי בשל גורמים הכוללים אך לא רק, רגישות מוגברת, רקע מופחת, זיהוי צבע כפול ויציבות הממברנה בתנאי אחסון ארוכי טווח.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בתרשים מערבי פלואורסצנטי כמותי כדי לזהות ולכמת במדויק חלבונים מעניינים, כמו גם כיצד לפתור בעיות נפוצות שעלולות להתרחש בעת ביצוע טכניקה זו.