Name: מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-20T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: למד שיטות מודרניות לזיהוי וכימות חלבונים באמצעות western blot פלואורסצנטי כמותי. הטכניקה משפרת רגישות ודיוק בניתוח דגימות ביולוגיות מורכבות מסוגים שונים של רקמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכל הבאים לתמיכה כספית: BBSRC המכון אסטרטגי תכנית מימון - CF וTMW; מימון BBSRC מזרח Bio DTP - LG; אמון דרווין של אדינבורו - MLH. כמו כן, אנו רוצים להודות לד&quot;ר בארי McColl רשות כוללת אופטימיזציה TREM2 בכתב היד הזה.

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Biotechnology. 1992 (24), 145-149 (1979).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22Protein+Protocols+on+CD-ROM%22">Protein Protocols on CD-ROM</a>. , Humana Press Inc. Totowa, NJ, USA. (1998).</li>
<li>Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblotting+and+immunodetection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Immunoblotting and immunodetection.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter. 10, 10(2008).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PLoS One. 8 (8), 72457(2013).</li>
<li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+Western+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative Western blots.</a> Exp. Anim. 60, 193-196 (2011).</li>
<li>Colella, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li>
<li>Zellner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+Western+blotting+for+quantitation+of+protein+biomarkers+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples.</a> Electrophoresis. 29, 3621-3627 (2008).</li>
<li>Kielar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+correlates+of+axonal+and+synaptic+pathology+in+mouse+models+of+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular correlates of axonal and synaptic pathology in mouse models of Batten disease.</a> Hum Mol Genet. 18, 4066-4080 (2009).</li>
<li>Mutsaers, C. A., Lamont, D. J., Hunter, G., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+proteomics+identifies+Calreticulin+and+GRP75%2FMortalin+as+peripherally+accessible+protein+biomarkers+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Label-free proteomics identifies Calreticulin and GRP75/Mortalin as peripherally accessible protein biomarkers for spinal muscular atrophy.</a> Genome Med. 5 (10), 95(2013).</li>
<li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+ubiquitin+homeostasis+and+%CE%B2-catenin+signaling+promote+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of ubiquitin homeostasis and β-catenin signaling promote spinal muscular atrophy.</a> J Clin Invest. 124 (4), 1821-1834 Forthcoming.</li>
<li>Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+systems+for+westerns%3A+chemiluminescence+vs.+infrared+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection.</a> Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).</li>
<li>Hawes, J. J., Brunzell, D. H., Wynick, D., Zachariou, V., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GalR1%2C+but+not+GalR2+or+GalR3%2C+levels+are+regulated+by+galanin+signalling+in+the+locus+coeruleus+through+a+cyclic+AMP-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">GalR1, but not GalR2 or GalR3, levels are regulated by galanin signalling in the locus coeruleus through a cyclic AMP-dependent mechanism.</a> J Neurochem. 93 (5), 1168-1176 (2006).</li>
<li>Bond, D., Primrose, D. A., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+signaling+events+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proceed+Online%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells.</a> Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).</li>
<li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+proteomics+analysis+of+synaptic+proteins+identifies+potential+cellular+targets+and+protein+mediators+of+synaptic+neuroprotection+conferred+by+the+slow+Wallerian+degeneration+%28Wlds%29+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).</li>
<li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fastest+western+in+town%3A+a+contemporary+twist+on+the+classic+western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis.</a> J. Vis. Exp. (84), 51149(2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שיקול ותכנון בשל חיוני לפני כל ניסוי וסופו של דבר יכול לקבוע את ההצלחה של הטכניקה המשמשת. ההתקדמות בזיהוי חלבון באמצעות WB יכול להציג שפע של מכשולים פוטנציאליים כאשר מנסה לבחור את הנוגדנים, ששיטות העברה וההדמיה המתאימות לשימוש. למרבה המזל, באמצעות רשימת בדיקה זהירה ואמצעי בקרה מתאים QFWB ניתן להשתמש באופן שיגרתי כדי לקבוע נוכחות חלבון והבדלי ביטוי עדינים יותר ויותר בין דגימות. פרוטוקול זה מספק מדריך מקיף לסופגים ניאון כמותיים מערבית, כמו גם כמה אסטרטגיות לפתרון בעיות, כדי למנוע ו / או להתגבר על חלק מהמכשולים נפוצים הרבים הקשורים אליו. השלבים הקריטיים המועסקים כדי לשמור על רגישות ולקבל באמת מדידות לכימות והשוואה כוללות: 1) מיצוי חלבון חזק מדגימות רקמה; 2) הכנת מדגם; 3) loadin חלבון מדויקז שנקבע על ידי סך הכל ניתוח חלבון; 4) העברה אופטימלית של חלבונים באמצעות I-כתם; 5 הכנה) של נוגדנים ראשוניים ומשניים בחסימת מאגר המכיל 0.1% Tween20, ו -6) להדמיה נכונה וניתוח באמצעות תרמי אינפרא-אדום ותוכנה נלווית. זיהוי ניאון אינפרא אדום הוא באמת כמותי ומספק רגישות רבה יותר בהשוואה לטכניקות מסורתיות יותר ECL זיהוי 3,11. מערכת זיהוי זה היא רב פנים, ובתור שכזו אינה מוגבלת לQFWB. מערכת זו היא מסוגלת הדמיה של תיוג immunohistological בהספק נמוך המאפשר הדמיה וכימות של חלקי רקמות שלמים 12. זה תחום אחד של פיתוח עתידי פוטנציאלי במונחים של רזולוציה שיכל לראות הדמיה רחוקה אדומה התחרתה לכידת immunofluorescence קונבנציונלי עם מיקרוסקופים קונבנציונליים במונחים של הערכה כמותית. עם זאת, עם רגישות רבה יותר לשינויים עדינים בעמ &#39;rotein ביטוי הוא חיוני כדי להבטיח שונות נשמר לאמצעים מינימליים ושליטה הם מחמירים עם פרוטוקולים חזקים. זה מתחיל בהפקת חלבון מחמירה מדגימת הרקמה ואחריו ייצור כולל ג&#39;לי חלבון מוכתם לספק ביטחון כי טעינת מדגם אחידה, אופטימיזציה של נוגדנים ראשוניים ומשניים, על מנת לקבוע אם זיהוי הוא אמיתי ובדיקת ההנחיות של היצרן בכל קשור להעברה פעמים כדי לקבל העברת חלבון יעילה. עם זאת, גם כאשר תנאים לWB מותאמים, ייתכן שעדיין בעיות הקשורות לניהול מערבונים שאולי לא נחקרו במלואו כאן. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים לגורמים, כולל solubilization חלבון ובחירה של חיץ חילוץ. מאגרים מסוימים יכולים להפריע למבחני ריכוז חלבון, וכמה רקמות קשות במיוחד לsolubilize, הדורש טכניקות חזקות יותר כגון השימוש בmacera האוטומטיטינג אטום מכולות כגון צינורות יחד M עם Dissociator מקינטוש. בנוסף, אמצעי בקרה פשוט לאחסון של חומר שחולץ ולא חולץ ב -80 מעלות צלזיוס יכול להיות ההבדל בין קבלת תיוג אופטימלי מייד לאחר חילוץ ויש להם שבועות תוצאות עניים מאוחר יותר. שיטות QFWB מודרניות הוכיחו להיות רגיש יותר ללכידת הבדלים דקים בביטוי חלבונים ויותר תכליתיים המאפשרות תיוג כפול בו זמנית 3 בהשוואה לטכניקות ישנות יותר כגון ECL. זה חיוני כי פרוטוקולים מערביים סופג הם חזקים וקלות שחזור לכימות מדויק וניתוח סטטיסטי. פרוטוקול זה הוא רגיש וחזק מספיק כדי לשמש באופן שגרתי לגילוי של חלבונים על פני מגוון רחב של דגימות רקמה שונות ומינים 3 ומאפשר כימות של חלבוני שפע נמוכים וגבוהים בתוך אותו QFWB לכן הפחתת שימוש מתכלה כמו גם זמן לניסוי 1. 1 בנוסף, הרגישות המוגברת של טכניקה זו מאפשרת אימות של יותר ויותר פופולרי - מחקרי omic 9,14 עם זאת דיוק הוא קריטי והכללת אמצעי בקרה המתאימה יש לדבוק בהימנעות רכישת נתונים שגויה כך.

מערבי סופג (WB) היא טכניקת ניתוח שפותחה במקור בסוף 1970s כדי לקבוע את נוכחותו או היעדריו של חלבון של עניין במדגם ביולוגי מורכב, כגון רקמת homogenate 1. המכונה גם immunoblot החלבון, כתוצאה מאינטראקצית הנוגדן-אנטיגן מפתח, המתודולוגיה כוללת 5 שלבים ברורים: 1) הפרדת electrophoretic של החלבונים על ידי נקודת isoelectric; העברה לdifluoride nitrocellulose או polyvinylidene (PVDF) קרום 2); 3) תיוג באמצעות נוגדן ראשוני ספציפי לחלבון של עניין; דגירה 4) עם נוגדנים משני המכוונים נגד הנוגדן הראשוני; ו -5) להדמיה. המתודולוגיה הדמיה התפתחה עם זמן לשיפור בטיחות ורגישות. חלק מWBS הראשון בוצע באמצעות תגי כותרת רדיו אשר לאחר מכן התקדמו לcolorimetric ולאחר מכן chemilluminescent יותר בשימוש נרחב בשיטות (ECL). Radioactivity תויג ישירות על גבי בדיקות לאנטיגנים ספציפיים ואילו שיטות colorimetric וECL להשתמש בטכניקת תיוג עקיפה עם כתב אנזים כגון peroxidase אלקליין חזרת phosphatase או streptavidin (HRP) 2. העצמה של תיוג של מוצר כרומגן או זורח נמדדת באמצעות צפיפות לפי עוצמת האות, חזקה או חלשה, מציינת פחות או יותר את נוכחותו של החלבון של עניין במדגם. ECL הוא מתודולוגיה רגישה יותר ולכן העדיפה 2 אבל כל 3 השיטות בתחילה פותחו על סרט X-ray עם טכניקות הדמיה דיגיטלית מתוחכמות יותר הוקמו 3 לאחר מכן. הקידום של הדמיה הדיגיטלית של WB אפשר לא רק חוקר על מנת לקבוע את נוכחותו או היעדריו של חלבון עניין שלהם, אלא גם אפשר היקש לרמת ביטוי של חלבון שנבחר בהשוואה נגד דוגמאות אחרות, ולכן יכול להיות המכונה &quot;חצי כמותית &amp; #8221 ;. לאחרונה, טכנולוגיה מערבית סופג באמת כמותי ורגישה יותר פותחה לפי רמת הקרינה שנמדדה קשורה באופן ישיר לכמות ולביטוי של חלבון בודד בתוך מדגם: כמותיים ניאון מערבי סופג (QFWB). כאשר משווה QFWB עם תיוג ECL, השימוש בנוגדנים משני ניאון יוצר פרופיל איתור ליניארי 4. זאת בניגוד לטכניקות ECL בי ליניאריות אות מתרחשת בדרך כלל עם המון חלבון נמוך מתחת מיקרוגרם 5 ואת הרוויה אות קשורה ישירות לביטוי חלבון, כלומר, עם גני המשק באו לידי ביטוי בכל המקום 5,6. פער זה בא ככל הנראה נגרם על ידי מספר גדול יותר של אתרי קישור זמינים עבור מצע ECL avidin להיקשר לbiotinylated משנית, וכתוצאה מכך סבירות גבוהה יותר של הרוויה אות פוטנציאלית. זה אחת הסיבות העיקריות לimmunoblotting בסיס ECL שהופנה לonl כ7 y &quot;חצי כמותית&quot;. הנקודה של אות רוויה היא בעל חשיבות קריטית כאשר מודדים הבדלים דקים ברמות ביטוי ויכול להוביל למדידה לא מדויקת. בשנים האחרונות הכניסה של טכניקות proteomic נרחבות המפרטות את הרגישות והזדהות של הפרשי ביטוי עדינים הולכת וגוברת הביאה הסתמכות הולכת וגוברת על מערבי סופג באמת כמותי לניסויי אימות 8,9. היישום של מתודולוגיה רגישה, חזקה ובאמת כמותי ולכן, חשוב. מתודולוגיות מערביות סופג &quot;אופטימיזציה&quot; רבות כבר מנוצלות על ידי מעבדות עצמאיות, אשר לעתים קרובות להוכיח קשה להגדיר או לשכפל בשל התאמות מתודולוגיים עדינות שלא יכול להיות ברור בפרוטוקולים מתועדים רשמיים. זהו פרוטוקול מבוסס וחזק לQFWB ובנוסף מספק אסטרטגיות חשובות לפתרון בעיות נפוצות thaלא יעלה במהלך ביצוע. פרוטוקול זה היה מותאם במקור לשימוש עם homogenates המוח עכברית, אך מאז נעשה שימוש יעיל במגוון רחב של דוגמאות ומינים 4,9,10 רקמה. וריאציות פרוטוקול פוטנציאל הנדרשות לפתרון בעיות ספציפיות כלולות.

<table><tbody><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10230544</td><td></td></tr><tr><td>M Tubes</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>iBlot Transfer Stack, PVDF Regular</td><td>Life Technologies, בריטניה</td><td>IB401001</td><td></td></tr><tr><td>MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)</td> <td>Life Technologies, UK</td><td>LC5602</td><td>שימוש בג'ל 1 לכתמים מערביים</td></tr><tr><td>SeeBlue חלבון מוכתם מראש תקן</td><td>Life Technologies, בריטניה</td><td>LC5625&nbsp;</td><td>שימוש בג'ל 2 סה"כ ג'ל מוכתם בחלבון</td></tr><tr><td>NuPAge LDS מאגר דגימה 4x</td><td>Life Technologies, בריטניה</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS מאגר ריצה (עבור Bis-Tris Gels בלבד) (20x)</td><td>Life Technologies, UK</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 מ"מ, 12 Well</td><td>Life Technologies, בריטניה</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>טבלית מלח פוספט חוצץ</td><td>Sigma-Aldrich, בריטניה</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו BCA, ערכת בדיקת חלבון</td><td>פישר סיינטיפיק בריטניה בע"מ</td><td>10249133</td><td></td></tr><tr><td>חוצץ חסימת אודיסיאה</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>P/N 927-40000</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD עז אנטי-ארנב IgG (H+L), 0.5 מ"ג</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD חמור אנטי-עכבר IgG (H+L), 0.5 מ"ג&nbsp;</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68072</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 מ"ג</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Donkey Anti-Goat IgG (H + L), 0.5 מ"ג</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32214</td><td></td></tr><tr><td>ODYSSEY CL מצלמת אינפרא אדום</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>התקשר להצעת מחיר</td></tr><tr><td>iBlot 7-Minute Blotting System</td><td>Life Technologies, בריטניה</td><td></td><td>דגם זה כבר לא בייצור</td></tr><tr><td>Expedeon</td><td>כתמי חלבון InstantBlue</td>, בריטניה <td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>Revitablot מאגר הפשטת כתמים מערביים&nbsp;</td><td>רוקלנד אימונוכימיקלים בע"מ</td><td>MB-085-0050</td><td></td></tr></tbody></table>

מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

סוף 1970s ראה השימוש דיווח בפומבי הראשון של הכתם המערבי, טכניקה להערכת הנוכחות ושפע יחסי של חלבונים ספציפיים בתוך דגימות ביולוגיות מורכבות. מאז, מתודולוגיה המערבית סופג הפכה למרכיב נפוץ ברפרטואר הניסיוני הביולוגים המולקולריים. חיפוש שטחי של PubMed שימוש במונח &quot;כתם מערבי&quot; עולה כי בעודף של 220,000 כתבי יד שפורסם עשו שימוש בטכניקה זו עד שנת 2014. חשוב לציין, בעשר השנים האחרונות ראו התקדמות הדמיה טכנית בשילוב עם הפיתוח תוויות ניאון של רגישות אשר שיפרו את הרגישות והניבה טווחים גדולים עוד יותר של גילוי ליניארי. התוצאה היא הקרינה עכשיו באמת לכימות מערבית כתם (QFWB) מבוססת המאפשרת לביולוגים לבצע ניתוח ביטוי השוואתי עם רגישות רבה יותר ודיוק מאשר אי פעם בעבר. מערבי סופג &quot;אופטימיזציה&quot; רבמתודולוגיות קיימות ונמצאות בשימוש במעבדות שונות. לעתים קרובות להוכיח אלה קשים ליישום בשל הדרישה של תיקונים פרוצדורליים עדינים אך מתועדים. פרוטוקול זה מספק תיאור מקיף של שיטת QFWB הוקמה וחזק, מלא באסטרטגיות לפתרון בעיות.

כרגישות QFWB והטווח ליניארי של גילוי גדול מזיהוי ECL קונבנציונלי, יש מספר אמצעי בקרה כי הם קריטיים כדי להבטיח שנתונים מדויקים שנאספו, ובכך מסייע לפרשנות יעילה. ראשית, הכללתו של דגימות בקרה חיוביות כפי שמוצגת באיור 1. שנית, אופטימיזציה של העברה כדי להבטיח תנועה שווה ערך של חלבוני משקל מולקולריים גבוהים ונמוכים מן הג&#39;ל על הקרום כהוצגה באיור 2. שלישית, אופטימיזציה של נוגדנים, משנית במיוחד נוגדנים שאופטימיזציה שהוא לעתים קרובות התעלם, אבל יכול לייצר שאינו ספציפי פסים מסוגלים להפריע לפרשנות נכונה של חלבון (ים) של עניין. ראה איור 3. רביעית, זה יכול להיות גם מקרה שכאשר חלבון מופיע בלתי ניתן לגילוי, אך הוא צפוי להיות נוכח, זה יכול להיות גם נושא נוגדנים משני שניתן לתקן על ידי שימוש פשוט הראיס המשניאד במארח מינים שונה. ראה איור 4. חמישית, תיוג חלבון כולל וניתוח הוא שיטה הרבה יותר חזקה וכמותיים בהשוואה לשימוש בחלבון מסורתי בודד (ים) שבאים לידי ביטוי בכל מקום להתייחסות לסטנדרטים פנימיים 3. רב של חלבונים בודדים אלה נמצאו להתבטא באופן דיפרנציאלי במודלים של מחלות ניווניות, כמו גם בין דגימות רקמה שונות והאחידות של ביטוי יכולה לשנות באותה הרקמה 3. לכן, ייצור של ג&#39;ל שליטת טעינה יהיה לאשר את האחידות של עומס מדגם בשילוב עם כולל ניתוח חלבון על ידי השוואה וכימותי עומס החלבון בנתיב אחד בטווחי משקל מולקולרי שונים נמדדו כנגד כל דגימה כדי לציין שגיאה סטנדרטית כפי שהודגם באיור 6 . חשוב לציין, כל טכניקות לפתרון בעיות ובקרות הם רק יעילים כמו הרגישות והעקביות של t הניתוחools מיושם על ידי המפעיל (איור 5). לבסוף טכניקה זו משאילה את עצמו להפשטה ומחדש חיטוט של קרומים עם גמישות רבה יותר מאשר ECL בשל גורמים כוללים אך לא מוגבלים לרגישות מוגברת, רקע מופחת, זיהוי צבע כפול ויציבות הממברנה בתנאי אחסון לטווח ארוך. ראה איור 7.

התקדמות הכתם המערבי באמצעות פלואורסצנטיות אפשרה זיהוי של שינויים עדינים בביטוי החלבון המאפשר ניתוחים כמותיים. כאן אנו מתארים מתודולוגיה חזקה לזיהוי מגוון חלבונים על פני מגוון מינים וסוגי רקמות. ניתנת גם אסטרטגיה להתגברות על בעיות טכניות נפוצות.

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

מטרת הליך זה היא לזהות ולכמת במדויק את השפע היחסי של חלבונים ספציפיים בתוך דגימה ביולוגית מורכבת באמצעות פיתול וכתמים כמותיים, פלואורסצנטיים. זה מושג על ידי תמציות חלבון מופרדות אלקטרו-פלואורסצנטיות ראשונות באמצעות ג'ל שיפוע טרומי. בשלב השני, עומס החלבון המקביל מאומת על פני כל נתיבי הדגימה באמצעות יישום כתם חלבון כולל, ולאחר מכן נעשה שימוש במערכת ההעברה המהירה של בלוק העין למחצה יבשה להעברת הדגימות על קרום A-P-V-D-F.לבסוף, החלבונים נבדקים עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים ואחריהם הנוגדן המשני המתויג פלואורסצנטי המתאים כדי להקל על גילויים הרגישים, החזקים והליניאריים באורכי גל אינפרא אדום ואדום רחוק. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בפריחה מערבית פלואורסצנטית כמותית כדי לזהות, לדמיין ולכמת במדויק מספר רב של חלבונים קשורים ומסיסים בממברנה על פני מגוון רחב של דגימות רקמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון הדמיה מבוססת ECL, הוא שהיא מאפשרת רגישות רבה יותר עם דיוק משופר בקנה מידה ליניארי רחב לקריאה כמותית באמת התחל על ידי השריה ידנית של דגימת הרקמה, ולאחר מכן הומוגניזציה במאגר מיצוי טרי שהוכן במשקל רקמה של כ-1 עד 10 לנפח חיץ עד ליצירת הומוגנט עקבי חלק.לאחר מכן, צנטריפוגה של התא ליזאט למשך 20 דקות ב 20, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו את ה-sate המכיל את החלבונים המסיסים לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה נקי ואחסנו גם את הגלולה וגם את חלקי ה-S בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לצורך. לאחר קביעת ריכוז החלבון של הספינאט, העבירו 15 מיקרוגרם חלבון לדגימה לצינורות מיקרו צנטריפוגה חדשים.לאחר מכן הביאו את הנפח הסופי של כל דגימה עד 10 מיקרוליטר עם מים מזוקקים והוסיפו חמישה מיקרוליטר של מאגר טעינת מט"ח. ערבבו היטב את תמיסות התאים על ידי מערבולת, ולאחר מכן חממו את הדגימות ב-98 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות כדי לנטרל את החלבונים. לאחר דנטורציה, הוסף שלושה מיקרוליטרים בתקן משקל מולקולרי מתאים לבאר הראשונה של כל אחד מג'לי בקרת הניסוי והטעינה.לאחר מכן, טען 10 מיקרוליטר מכל דגימה לבארות הבאות המתאימות לאחר אלקטרופורזה. השתמש בסכין ג'ל כדי לשחרר את הג'לים מהקסטה ולהסיר את הבארות ואת רגלי הג'ל. סמן את הג'ל כדי לסייע בהתמצאות מאוחרת יותר.לאחר מכן, כדי לקבוע את עומס החלבון המקביל, שפכו כ-30 מיליליטר של כתם חלבון לתוך צלחת פטרי מרובעת בגודל 12 על 12 סנטימטר והניחו את ג'ל בקרת ההעמסה לתוך הכתם, תוך הבטחה שהתמיסה מכסה את כל הג'ל. ערבבו בעדינות את הג'ל למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן השליכו את כתם החלבון ושטפו את הג'ל שלוש פעמים במים מזוקקים לפני הדמיה של חסימת העין. שני העברת חלבון מהירה חצי יבשה לאחר אלקטרופורזה, הכינו את ערימת ההעברה התחתונה על ידי הסרת מכסה נייר הכסף והרטבה מראש של הממברנה עם מאגר פועל ישירות ממיכל הג'ל.הרטיבו מחדש את נייר הסינון במים מזוקקים גם בשלב זה. לאחר מכן, שרכו את הג'ל הניסיוני על ערימת ההעברה התחתונה המוכנה, ולאחר מכן הניחו את נייר הסינון לפני העבודה על הג'ל וגלגלו את שניהם כדי להבטיח שלא יילכדו בועות בין השכבות. הנח את הערימה העליונה על גבי נייר הסינון והערימה התחתונה.לאחר מכן גלגל את כריך ערימת ההעברה כדי לחסל בועות אוויר. הכנס את הספוג מערכת ערימת ההעברה על כרית הסופגת והנח את כריך ערימת ההעברה בחלל הייעודי. לאחר מכן סגור את המכסה היטב והתחל את I block two, והעביר את החלבונים למשך שבע דקות בתוכנית השלישית.בסיום התוכנית, הסר את ערימת ההעברה ממכונת חסימת העיניים וקלף לאחור את ערימת ההעברה העליונה ואת שכבות נייר הסינון תוך חשיפת הג'ל בערימת ההעברה התחתונה. השתמש באזמל כדי לחתוך סביב הג'ל תוך הקפדה על ביצוע חתך משולש למטרות התמצאות על הממברנה לאחר חיתוך הממברנה כדי לבדוק את כתם החלבון של יעילות ההעברה, הג'ל כפי שהודגם זה עתה, ולאחר מכן העביר במהירות את הממברנה לתוך צינור נקי של 50 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר PBS לראשון מבין שלושה, חמש דקות שטיפות על רולר מכני. לאחר הכביסה השלישית, השליכו את מאגר הכביסה ודגרו את הממברנה במאגר חוסם לא מדולל למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, דגרו את הממברנה בנוגדנים ראשוניים מדוללים בחמישה מיליליטר של חיץ חוסם ו-0.1 בין 20 לילה בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה מתמדת. למחרת בבוקר לאחר השלכת תמיסת הנוגדנים העיקרית, שטפו את הממברנה שש פעמים במשך חמש דקות ב-PBS כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן דגרו את הממברנה בחושך עם נוגדן משני מתויג פלואורסצנטי, מורחב בחמישה מיליליטר של חיץ חוסם ו-0.1% בין 20 עם תסיסה מתמדת, ואחריו שש שטיפות PBS של חמש דקות לכל ההדמיה.ראשית, היכנס למחשב ולמצלם. לאחר מכן פתח את תוכנת ההדמיה כדי לדמות את הכתם המערבי. ראשית, פתח את מכסה ההדמיה ושפך כמות קטנה של PBS על הכוס.בפינה השמאלית התחתונה של ההדמיה, הנח את הממברנה על גבי ה-PBS וודא שהיא מרובעת עם הציר על ההדמיה, ושנותר רווח של סנטימטר אחד בין הממברנה לציר הרשת. גלגל את הממברנה כדי להבטיח שלא יילכדו בועות בין הזכוכית לממברנה, ולאחר מכן ספור את מספר הריבועים שהממברנה תופסת על ציר x ו-y. לאחר מכן, סגור את מכסה ההדמיה והזן את מספר הריבועים בתוכנת המחשב.בחר את ערוץ האינפרא אדום המתאים ואת העוצמה המתאימה, והתחל את הסריקה כדי לדמיין את כתם החלבון הכולל של ג'ל בקרת ההעמסה. תקן את הג'ל ואת ההדמיה כפי שהודגם זה עתה עבור הממברנה הניסיונית, ולאחר מכן בחר את ערוץ ה-700. הגדר את העוצמה לחמש והתחל את הסריקה.לכמת את נתוני הסריקה. התחילו בכוונון לחצני הבהירות והניגודיות של הקובץ הסרוק כדי להפיק את איכות התמונה הטובה ביותר, וסיבבו את התמונות הדרושות להשגת הכיוון הרצוי. לאחר מכן, בחר מלבן מתפריט הצורות והשתמש בו כדי לצייר מלבן סביב הנתיב כולו.בנתיב לדוגמה אחד. העתק והדבק את הצורה סביב נתיב אחד כדי לדגום נתיב שני. לאחר אישור שמדידת הרקע אינה משלבת אות בנתיב הבא, צייר מלבן סביב כל נתיב עבור שאר נתיבי הדגימה.לאחר מכן הצג את האות עבור טבלת הצורות עבור כל מלבן המצויר ביחידות פלואורסצנטיות שרירותיות ושמור את התמונה כמרה tiff. ישנם מספר אמצעי בקרה שהם חיוניים להבטחת איסוף נתונים מדויקים במהלך כתמים פלואורסצנטיים מערביים כמותיים. לדוגמה, רצוי לכלול דגימות בקרה חיוביות.שנית, חשוב לייעל את זמן ההעברה כדי להבטיח תנועה שווה ערך של חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה ונמוך מהג'ל לממברנה. שלישית, יש לקבוע את דילול הנוגדנים הראשוני והמשניים המתאימים כדי למנוע פרשנות שגויה של החלבונים המעניינים עקב רצועות לא ספציפיות כפי שמוצג בתמונות אלה. רביעית, חשוב לשקול האם ייתכן שיהיה צורך בנוגדנים משניים שגדלו במין מארח אחר, במיוחד במקרים בהם לא מזוהה רצועת חלבון צפויה.חמישית, ייצור ג'ל בקרת העמסה יכול לאשר את אחידות עומס הדגימה. בשילוב עם ניתוח חלבון כולל, ניתן להשתמש בג'ל כדי להשוות ולכמת את עומס החלבון בכל נתיב בטווחי משקל מולקולרי שונים כפי שנמדד מול כל דגימה. לבסוף, טכניקה זו מתאימה להפשטה ובדיקה מחדש של ממברנות עם גמישות רבה יותר מאשר זוהר קמי בשל גורמים הכוללים אך לא רק, רגישות מוגברת, רקע מופחת, זיהוי צבע כפול ויציבות הממברנה בתנאי אחסון ארוכי טווח.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בתרשים מערבי פלואורסצנטי כמותי כדי לזהות ולכמת במדויק חלבונים מעניינים, כמו גם כיצד לפתור בעיות נפוצות שעלולות להתרחש בעת ביצוע טכניקה זו.

a-guide-to-modern-quantitative-fluorescent-western-blotting-with

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר טכני הליך סטנדרטי המערבי סופג באמצעות אלקטרופורזה זמינים מסחרית NuPAGE מיני ג'ל המערכת Invitrogen.

המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels

המערבי סופג היא שיטה אנליטית לשמש כדי לזהות חלבונים ספציפיים בדגימה נתון homogenate רקמה או לחלץ.

המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

הסרטון מדגים טכניקת קרישה מערבית מבוססת נורמליזציה כוללת של חלבונים לכימות ביטוי חלבון המטרה בדגימה. על ידי ניצול צביעת החלבון הכוללת של הדגימה, מבוצע ניתוח יחסימטרי כדי לקבוע את רמת הביטוי היחסי של חלבון היעד.

כתם מערבי כמותי להערכת רמות ביטוי חלבונים

סרטון זה מתאר את הכתמים המערביים מבוססי הכימילומינסנציה של ליזטים מדוכאי חיסון. הטכניקה מסייעת לקבוע עיבוד והפעלה של חלבונים. האות הכימילומינסנטי שזוהה פרופורציונלי לרמת עיבוד החלבון במהלך הפעלתו.

בדיקת כתם מערבי Chemiluminescent לעיבוד חלבונים

זרימת עבודה V3 היא הליך כתם מערבי באמצעות ג'לים ללא כתמים. הטכנולוגיה נטולת הכתמים מאפשרת לחוקרים לדמיין את איכות הפרדת החלבון, לאמת את יעילות ההעברה, והכי חשוב, לאמת את השינוי בחלבון המעניין באמצעות כימות חלבונים כולל כבקרת טעינה אמינה.

זרימת עבודה ללא כתמים V3 לבקרת טעינת חלבונים מעשית, נוחה ואמינה ב-Blotting המערבי

פרוטוקול זה בוחן את הפיתוחים האחרונים בביצוע ניתוחי כתם מערבי. שינויים אלה רומן להעסיק מערכת ג'ל Bis-טריס עם אלקטרופורזה לרוץ זמן 35 דקות, מערכת העברה הסופג יבשה 7 דק ', וזיהוי אינפרא אדום חלבון פלואורסצנטי והדמיה שיוצר ברזולוציה גבוהה יותר, איכות, רגישות ודיוק משופר של נתונים מערביים.

המהיר ביותר במערב בעיר: טוויסט עכשווי על ניתוח הקלאסי הכתם המערבי

אנו מתארים את השימוש immunoblotting כמותיים כדי לאמת היסטולוגיה immunofluorescence בשילוב עם ניתוח תמונות כאמצעי לכימות חלבון עניין בפורמלין-קבוע, פרפין-מוטבע דגימות רקמה (FFPE). התוצאות שלנו להפגין את התועלת של היסטולוגיה immunofluorescence עבור ברור הכמות היחסית של חלבונים סמן דגימות ביופסיה שגרתית.

Immunoblotting כמותית של שורות תאים כסטנדרט לאימות Immunofluorescence לכימות תנועת סמן חלבונים בדגימות הרקמות שגרתיות

שיטה זו מתארת בגישה לשחזור ועמיד עבור ההשוואה של רמות החלבון ברקמות שונות, timepoints התפתחותיים שונים באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי blotting בגישה.

השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג

טכניקת סופג מערבית במהירות גבוהה במיוחד מפותחת על ידי שיפור הקינטיקה של אנטיגן-נוגדנים מחייב באמצעות ניקוז מחזורי וחידוש (CDR) טכנולוגיה בשילוב עם סוכן שיפור immunoreaction.

כתם מערבי במהירות גבוהה במיוחד באמצעות טכנולוגיית שיפור Immunoreaction

שימוש בטכנולוגית microsphere Xmap של Luminex החברה, פתחתי immunoassay Fluorometric Multiplexed (MFIA) לserosurveillance של מיני בעלי חיים שונים במעבדה. MFIA הוא microarray השעיה בי אנטיגן, בקרת רקמה או נוגדנים קשורות קוולנטית לקלקר microspheres צבעים. שיטת בדיקת MFIA כמו גם נושאים שונים לפתרון בעיות מטופלות.

מתודולוגיה multiplexed Fluorometric immunoassay בדיקה ופתרון בעיות

למד שיטות מודרניות לזיהוי וכימות חלבונים באמצעות western blot פלואורסצנטי כמותי. הטכניקה משפרת רגישות ודיוק בניתוח דגימות ביולוגיות מורכבות מסוגים שונים של רקמות.

מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות

גלה סרטונים נוספים