אינדוקציה ישירה של תאי גזע עצביים אדם מתאי הדם היקפי Hematopoietic אב

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום ישירות לתאי גזע עצביים מתאי הדם. זה מושג על ידי העשרה ראשונה של תאי אב המטופויאטיים חיוביים CD 34 מהדם. השלב השני הוא להעביר תאי CD 34 עם נגיף סנדי המכילים גורמי שעתוק.

לאחר מכן, תאי הגזע העצביים נגזרים באמצעות מדיום סלקטיבי. השלב האחרון הוא להבדיל את תאי הגזע העצביים המושרים לנוירונים, אסטרוגליה ואוליגודנדרוציטים. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית משמשת לאפיון התאים המתקבלים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטה הקיימת, כגון משך הנוירונים ישירות מפיברובלסטים, גם יצירת IPS, הוא ששיטה זו עוקפת את התהליך המייגע של יצירת וחישוב IPS, אך עדיין מספקת כמות גדולה של תאים עצביים שיכולים להתייחס, להתמיין לנוירונים. הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כששמתי לב שתאי CT 34 מחוברים למעשה נראים דומים מאוד לתאים נוירו-פרוגניים מתורבתים ראשוניים, מה שמדגים שההליך יהיה נחתים, טכנאי מחיי. לאחר בידוד תאי CD 34 מתאים חד-גרעיניים בדם היקפי על פי ההוראות בפרוטוקול הטקסט, התחל בתהליך של תרבית תאי CD 34 על ידי Resus, השעיית תאי CD 34 במדיה CD 34 ואז זרע את התאים לצלחת של 24 בארות בשלוש כפול 10 עד חמישית תאים לבאר במיליליטר אחד של תווך.

לאחר דגירה של 24 שעות בחממת תרבית רקמות של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני, אסוף את התאים הצפים וצנטריפוגה את תרחיף התאים ב-110 פעמים G בטמפרטורת החדר. לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים במדיום תחזוקה טרי CD 34. ראה צלחת חדשה של 24 בארות בפעם אחת 10 עד חמישית תאים לבאר במיליליטר אחד של מדיום, דגירה ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני של 5% למשך חמישה ימים נוספים, והחלפת מחצית מהמדיום כל יומיים.

על ידי שאיבה זהירה של החצי העליון של הסופרנטנט בזמן שתאי CD 34 נמצאים בתחתית הבארות כפי שמוצג כאן ביום החמישי. לאחר הציפוי, אספו תאי CD 34 וצנטריפוגה את התאים ב-170 פעמים G למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים כמו קודם וזרעו צלחת טרייה של 24 בארות בבת אחת 10 עד חמישית תאים לבאר במיליליטר אחד של מדיה. לאחר מכן, הפשירו ערכת תכנות מחדש של IPS Sendi של cyto tune.

על ידי טבילה ראשונה של תחתית הצינורות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות ולאחר מכן הפשרה מלאה בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה קצרה של הצינורות והניח אותם על קרח. הכן את תערובת וירוס סנדאי על ידי ערבוב הנפח המומלץ של כל וירוס הרשום בתעודת הניתוח עבור המנה המתאימה.

מומלץ ריבוי זיהומים של 15. הוסף את תערובת נגיף סנדאי לכל באר של תאי CD 34. לאחר מכן מערבבים את הבארות על ידי ניעור עדין של הצלחת.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני לאחר 24 שעות. שימו לב ליעילות ההתמרה. שימו לב שאגרגטים וכדורים של תאים כמו אלה המוצגים כאן הם אינדיקטורים להתמרה מוצלחת.

לאחר מכן דגרו על התאים בחממת תרבית הרקמה למשך חמישה עד שבעה ימים עד שתאים מחוברים מופיעים ומגיעים למפגש של 30 עד 50% כפי שמוצג כאן כל יומיים. החלף מחצית מהמדיום על ידי העברת בזהירות את המחצית העליונה של המדיום לבאר אחרת. אם כדורי תא מועברים לחדש, הוסף כמות שווה של מדיום טרי.

בדוק את שטף התאים באמצעות המיקרוסקופ ההפוך. כאשר התאים מתכנסים ב-30 עד 50%, שאפו את הסופרנטנט והרזרבה ואז הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום אב עצבי לכל באר כדי ליצור לוחית גיבוי באמצעות הכדורים בצנטריפוגה העל-טבעית, הסופרנטנט הרזרבה ב-170 פעמים G למשך 10 דקות. לאחר מכן שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה בצלחת בינונית של אב עצבי בצלחת מצופה מטריג'ל 24 בארות.

כמו קודם, החלף את המדיום בכל צלחת תאים כל יומיים עד שהתאים מגיעים למפגש של 60 עד 80%. בדרך כלל לאחר שבוע. לאחר שהתאים מגיעים למפגש הנדרש, שאבו את הסופרנטנט והוסיפו מיליליטר אחד של מדיום תאי גזע עצביים לכל אחד.

ובכן, לאחר מכן נתקו את התאים באמצעות מגרד תאים, ואחריו פיפטינג עדין מאוד. לאחר מכן, העבירו את התאים מבאר אחת של צלחת 24 הבארות לבאר אחת מתוך שש. ובכן צלחת.

הוסף עוד מיליליטר מדיום לבאר ולאחר חזרה על ההליך עבור כל הבארות, הנח את צלחת שש הבארות לחממת הפחמן הדו חמצני של 37 מעלות צלזיוס 5%. שנה את הנפח המלא של המדיום כל יומיים עד שהתאים מגיעים למפגש של 60%, ולאחר מכן להתנתק ולהחזיר את התאים ביחס של אחד לשלושה כפי שהוכח זה עתה כדי להקפיא חלק מתאי גזע עצביים לא ממויינים. ראשית, הכינו את מדיום הקפאת תאי הגזע על ידי הוספת 20% תחמוצת דימתיל סולף או DMSO למדיום תאי הגזע העצביים והניחו על קרח.

לאחר מכן נתק את התאים בצלחת שש הבארות. שימוש במגרד תאים ופיפטינג עדין. שמור אליקוט של התרחיף לספירת תאים ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב-170 פעמים G למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בזמן שהתאים מסתובבים, ספר את התאים ב-aliquot של ההשעיה באמצעות המו, ציטומטר או מונה תאים אוטומטי וחשב את נפח המדיום הנדרש כדי לתת ריכוז תאים של אחד כפול 10 לששת התאים למיליליטר.

לאחר סיום הסיבוב, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה בתווך תאי גזע עצביים בכמות של 10 פעמים 10 לששת התאים למיליליטר. לאחר מכן הוסיפו נפח שווה של פיפטה בינונית מקפיאה חמש פעמים 10 לתאים החמישיים בנפח של מיליליטר אחד לבקבוקון קריו והקפיאו את התאים במיכל הקפאה לפי הוראות היצרן. כאשר תאי הגזע העצביים בצלחת שש הבארות מגיעים למפגש של 80%, נתק אותם באמצעות שוטר גומי ולאחר מכן התנתק על ידי פיפטינג עדין.

חבר את מתלה התא לצינור סטרילי. ספרו את התאים באמצעות המו, ציטומטר או מונה תאים אוטומטי והתאימו את ריכוז תרחיף התאים לאחד כפול 10 עד חמישי תאים למיליליטר עם מדיום תאי גזע עצביים. לאחר מכן פיפטה מיליליטר אחד של מתלה התא על ליזין פולי D וכיסוי מצופה למינציה להחליק בבאר אחת של צלחת 24 בארות לאחר חזרה על ההליך למספר הבארות הרצוי.

דגירה כמו קודם למשך 24 שעות. לאחר שחלף זמן הדגירה, שאפו את המדיה והחליפו בבידול עצבי. מדיום דגירה במשך שבועיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני מחליף את המדיום פעמיים בשבוע לאחר שבועיים.

תאי הגזע העצביים צריכים להיות מובחנים לחלוטין כפי שמוצג כאן ומוכנים ליישומים במורד הזרם כגון צביעה אימונופלואורסצנטית. שתי התמונות הראשונות מראות שתאי גזע עצביים מבטאים קן ו-SOX שתיים. בעוד שהתמונה השלישית מדגימה ש-OCT 4 אינו בא לידי ביטוי, DPI משמש כסמן גרעיני וסרגל קנה המידה מייצג 200 מיקרון.

לאחר ביצוע פרוטוקול ההתמיינות המתואר בסרטון, הנוירונים הממוינים מבטאים את הסמן העצבי בטא שלוש טובולין. תאי הגזע העצביים האנושיים יכולים גם להתמיין לתאי גליה. כאשר הם מתמיינים לאסטרוציטים, התאים מבטאים את הסמן האסטרוציטי GFAP.

לבסוף, בתמונה זו, התאים התמיינו לאוליגודנדרוציטים ומבטאים את סמן האוליגודנדרוציטים. הו ארבע. לאחר השליטה ביצירת תאי גזע עצביים אנושיים מושרים מדם היקפי ניתן לבצע תוך כשלושה שבועות.

אם מבוצעים כראוי, תאי הגזע העצביים יכולים להיות נוירונים מובחנים עוד יותר ולא ברורים את השיטה על ידי תהליכי יצירת IPS ארוכים ומסובכים ויכולים להיות אופציה קלה ליצירת תרביות עצביות ספציפיות למטופל לאחר התפתחותו. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור מודלים של תרביות תאים בודדות להפרעות נוירולוגיות שונות, שעשויים לייצג טוב יותר את ההבדלים הגנטיים בהפרעות ספציפיות, במיוחד מדגימות של מטופלים בודדים.