Name: רתימת ביקוש Bioorthogonal הפוך אלקטרונים דילס-Alder cycloaddition לPretargeted PET הדמיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-03T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: למדו שיטת הדמיית PET מטרגטת מראש לגילוי סרטן באמצעות תגובה ביואורתוגונלית בין נוגדן TCO לרדיוליגנד טטרזין. השיטה מספקת ניגודיות גבוהה ומינון קרינה נמוך יותר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לפרופ' ראלף וייסלדר, ד"ר פט זנזוניקו וד"ר נגה-וארה-קישורי פילארסטי על השיחות המועילות ול-NIH על המימון (BMZ: 1K99CA178205-01A1)

מסר של אתיקה: כל הניסויים בבעלי החיים in vivo תיארו בוצעו על פי פרוטוקול שאושר ולפי ההנחיות האתיות של Memorial Sloan Kettering Cancer Center המוסדי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC). 1. סינתזה של TZ-BN-NOTA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכלי תגובה קטנים, לפזר 7 מ&quot;ג NH 2 -Bn-NOTA (1.25 x 10 -2 mmol) ב600 NaHCO 3 חיץ μl (0.1 מ &#39;, pH 8.1). בדוק את ה- pH של התמיסה. במידת צורך, להתאים את ה- pH של התמיסה ל -8.1 באמצעות aliquots הקטן של 0.1 M Na 2 CO 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את פתרון -Bn-NOTA NH 2 ל -0.5 מ&quot;ג TZ-NHS (1.25 x 10 -3 mmol) בצינור 1.7 מיליליטר microcentrifuge. הערה: אם אפשר לשקול TZ-NHS החוצה יבש או הגיע מפתרון מניות של DMF היבש או DMSO (&lt;50 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון התגובה וכתוצאה מכך להגיב למשך 30 דקות ב RTעם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, לטהר את המוצר באמצעות הפוך-שלב כרומטוגרפיה 18 HPLC C כדי להסיר NH unreacted 2 -Bn-נוטה. ניתן לנטר NH 2 -Bn-NOTA באורך גל של 254 ננומטר, ואילו TZ-NHS וTZ-BN-NOTA נמצאים תחת פיקוח הטוב ביותר באורך גל של 525 ננומטר. הערה: זמני שייר הם כמובן תלויות מאוד בהגדרת ציוד HPLC של כל מעבדה (משאבות, עמודות, צינורות, וכו &#39;). עם זאת, להציג דוגמא, אם שיפוע של 0: 100 MeCN / H 2 O (שניהם עם 0.1% TFA) 100: 0 MeCN / H 2 O מעל 25 דקות ועמודת 4.6 x 250 מ&quot;מ C 18 אנליטיות משמש , הפעמים השמירה של TZ-BN-נוטה, TZ-NHS, וNH 2 -Bn-NOTA יהיו סביב 15 דקות, 16.5 דקות, 10 דקות ו, בהתאמה. המוצר יכול להיות מטוהר ממרכיבי תגובה האחרים באו ריצה אחת או ריצות מרובות באמצעות טור HPLC למחצה preparative או preparative C 18. 1 H-NMR, אנאליytical HPLC, וESI-MS כל השיטות שניתן להשתמש בהם כדי לאמת את טוהר של מבשר TZ-BN-NOTA הושלם. 11 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את eluent HPLC נאסף באמצעות חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף את צינור האיסוף הקפוא ברדיד אלומיניום אטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור איסוף הקפוא בO כלי lyophilizing / N כדי להסיר את השלב הנייד HPLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את המוצר המטוהר (ורוד בהיר מוצקה) בחושך ב -80 ° C. הערה: זו נקודת עצירה מקובלת בהליך. מבשר TZ-BN-NOTA הושלם הוא יציב במשך לפחות 1 שנה בתנאים אלה. </li></ol> 2. הכנת huA33-TCO Immunoconjugate <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור microcentrifuge 1.7 מיליליטר, להכין 1 מ&quot;ג / מיליליטר (2.7 מ&quot;מ) פתרון של TCO-NHS בDMF היבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור 1.7 מיליליטר microcentrifuge, להכין 2 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון (13.3 מיקרומטר) של huA33 ב 1 מיליליטר של בופר פוספט, pH 7.4 (0.01 M 4 PO 3, </sub&gt; 0.154 M NaCl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות aliquots הקטן (&lt;μl 5) של 0.1 M Na 2 CO 3, להתאים את ה- pH של תמיסת הנוגדן ל8.8-9.0. השתמש באחת נייר pH או מטר pH עם microelectrode לפקח pH, ולהיזהר שלא לאפשר את ה- pH להתעלות מעל pH 9.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פתרון הנוגדן הוא בpH הנכון, להוסיף נפח של פתרון TCO-NHS המקביל ל 8 שווה טוחנת של אסתר הופעלה. לדוגמא, להוסיף 7.9 μl של 1 מ&quot;ג הפתרון / מיליליטר TCO-NHS (1.07 x 10 -7 mol TCO-NHS) למ&quot;ל 1 של פתרון 2 מ&quot;ג / מיליליטר נוגדן huA33 (1.33 x 10 -8 mol huA33). לא יעלה על 5% DMF לפי נפח בפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב בעדינות את הפתרון על ידי צינור היפוך microcentrifuge מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעטוף את צינור microcentrifuge ברדיד אלומיניום אטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הפתרון לדגירה עבור שעה 1 ב RT עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי השעה 1 בRT, לטהר את immunoconjugate וכתוצאה מכך באמצעות siz חד פעמי מראש ארזהדרת דואר טור desalting. ראשית, יש לשטוף את עמודת הדרת גודל כפי שתואר על ידי הספק כדי להסיר כל חומרים משמרים נוכחי בעמודה במהלך האחסון. לאחר מכן, מוסיף את תערובת התגובה לטור הדרת גודל, לשטוף את הטור עם 1.5 מיליליטר 0.9% תמיסת מלח סטרילית, ולאחר מכן לאסוף את המוצר באמצעות 2 מיליליטר של 0.9% תמיסת מלח סטרילית כeluent. הערה: שלב זה יניב huA33-TCO הושלם כפתרון 2 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את הריכוז של התוצאה huA33-TCO על UV-Vis ספקטרופוטומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ריכוז גבוה יותר הוא רצוי, לרכז את פתרון huA33-TCO באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי עם חתוך 50,000 משקל מולקולרי. הערה: חשוב לציין כי בעוד huA33 ומגוון של נוגדנים אחרים ידועים (למשל, bevacizumab, trastuzumab, cetuximab, וJ591) הם סובלניים מאוד להיות מרוכז, וצבירת משקעים יכולים להתרחש על ריכוז במקרים אחרים. חוקרים מנסים זה procedיור עם נוגדן חדש צריך לסמוך על הספרות או הידע שלהם של הנוגדנים בשאלה בנוגע לשאלה האם לא להתרכז הנוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את immunoconjugate huA33-TCO הושלם על 4 מעלות צלזיוס בחושך. הערה: זו נקודת עצירה מקובלת בהליך. המצומד מב-TCO השלים צריכה להיות יציב במשך לפחות 3 חודשים בתנאי האחסון הללו. </li></ol> 3. 64 Cu Radiolabeling של TZ-BN-NOTA הערה: שלב זה של הפרוטוקול כרוך הטיפול ומניפולציה של רדיואקטיביות. לפני ביצוע השלבים הבאים - או ביצוע כל עבודה אחרת עם רדיואקטיביות - חוקרים צריכים להתייעץ עם מוסד ביתם קרינת מחלקת בטיחות. קח את כל הצעדים האפשריים כדי לצמצם את החשיפה לקרינה מייננת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור microcentrifuge 1.7 מיליליטר, להכין 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר (723 מיקרומטר) פתרון של TZ-BN-נוטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בmicroc 1.7 מיליליטרצינור entrifuge, להוסיף 10 μl של פתרון TZ-BN-NOTA (5 מיקרוגרם) 400 μl של 0.2 M NH 4 OAC pH 5.5 חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעניין של פתק שמירת radiochemical הנכונה, למדוד ולתעד את כמות הרדיואקטיביות במדגם באמצעות כיל מנה לפני ואחרי הצעדים שהתפתחו בפרוטוקול בהמשך (3.4-3.8). זה יעזור לך עם הקביעה מדויקת של תשואות radiochemical. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2,000 μCi (74 MBq) של 64 Cu לפתרון TZ-BN-נוטה. הערה: בדרך כלל, [64 Cu] CuCl 2 מסופקת בנפח קטן (&lt;30 μl) של 0.1 N HCl, ובכך רק בנפחים קטנים (&lt;10 μl) של פתרון מניות זו נדרשות לתגובת radiolabeling. אם בכמויות גדולות של המניות [64 Cu] CuCl 2 יש צורך, תגובת radiolabeling היא סובלנית של הגדלת נפח התגובה הכוללת. עם זאת, ה- pH של תמיסת תגובת radiolabeling צריך להיות במעקב צמוד כדי להבטיחשזה לא יפחת מ pH 4.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הפתרון לדגירה של 10 דקות ב RT עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 10 דקות של דגירה, לטהר את המוצר באמצעות C 18 כרומטוגרפיה HPLC ההפוך-שלב. פעמים שמירה הן כמובן תלויות מאוד בהגדרת ציוד HPLC של כל מעבדה (משאבות, עמודות, צינורות, וכו &#39;). עם זאת, להציג דוגמא, אם שיפוע של 5:95 MeCN / H 2 O (שניהם עם 0.1% TFA) 95: 5 MeCN / H 2 O מעל 15 דקות משמש, זמן השמירה של 64 Cu-Tz- BN-NOTA צריך להיות סביב 9.8 דקות בזמן חופשי, 64 Cu uncomplexed יהיה elute עם חזית הממס בסביבות 2-4 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מאייד סיבובי, להסיר את eluent HPLC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Redissolve מוצר 64 Cu-טז-BN-NOTA בשיעור של 0.9% תמיסת מלח סטרילית. הערה: בהתחשב 12.7 שעות זמן מחצית החיים הפיזיים של 64 Cu, זה לא נקודת עצירה מקובלת בהליך. לבצע הסינתזה של 64 Cu-טז-BN-לאמייד לפני ההזרקה של radioligand, ובצעו את שלב 3.7 מייד אחר צעד 4.5. </li></ol> 4. בVivo Pretargeted PET הדמיה הערה: כמו בסעיף 3 לפרוטוקול, צעד זה של הפרוטוקול כרוך טיפול ומניפולציה של רדיואקטיביות. לפני ביצוע השלבים הבאים חוקרים צריכים להתייעץ עם מוסד ביתם קרינת מחלקת בטיחות. קח את כל הצעדים האפשריים כדי לצמצם את החשיפה לקרינה מייננת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעכבר נקבת athymic בעירום, שתל תת עורי 1 x 10 תאי סרטן מעי גס 6 SW1222 ולאפשר לגדול אלה לתוך xenograft 100-150 מ&quot;מ 3 (9-12 ימים לאחר חיסון). 11 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל aliquot של פתרון huA33-TCO מפרוטוקול סעיף 2 לריכוז של 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר בשיעור של 0.9% תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 200 μl של פתרון huA33-TCO (100 מיקרוגרם) לוריד הזנב של עכבר xenograft נושאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר 24 שעות לצבירת huA33-TCO בגידול של העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את radioligand Cu-טז-BN-NOTA 64 לריכוז של 1.5 מיליליטר / MCI בשיעור של 0.9% תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 200 μl של פתרון 64 Cu-טז-BN-NOTA radioligand (300 μCi; 11.1 MBq; 1.6 nmol של 64 Cu-טז-BN-נוטה, בהנחת פעילות ספציפית של 6.7 MBq / nmol) לוריד הזנב של עכברי נושאי xenograft. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודת זמן ההדמיה הרצויה (למשל, 2, 6, 12, או 24 שעות לאחר הזרקה), להרדים את העכבר עם 2% isoflurane: תערובת גז חמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על המיטה של ​​סורק PET בעלי החיים הקטן. לשמור על הרדמה במהלך הסריקה באמצעות isoflurane 1%: תערובת גז חמצן. לפני הצבת בעלי החיים על מיטת הסורק, ודא הרדמה בשיטת הבוהן הקמצוץ ולהחיל משחה וטרינרים לעיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות במהלך הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש נתונים PET לעכבר באמצעות סטטילסרוק עם מינימום של 20 מיליון אירועים חופפים באמצעות חלון אנרגיה של 350-700 קאב וחלון תזמון מקרי של 6 NSEC. לאחר השלים הרכישה של התמונה, לא עוזב את העכבר ללא השגחה ולא למקם אותו בכלוב עם עכברים אחרים עד שהוא חזר להכרה. </li></ol>

<ol><li>Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+and+antimatter%3A+The+resurgence+of+immuno-PET%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 50, 2-5 (2009).</li>
<li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+construction+of+radiometallated+bioconjugates+for+positron+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Transactions%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography.</a> Dalton Transactions. 40, 6168-6195 (2011).</li>
<li>Hollander, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+antibodies+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Bispecific antibodies for cancer therapy.</a> Immunotherapy. 1, 211-222 (2009).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+pretargeting+in+mice+using+99mTc-labeled+morpholino%2C+a+DNA+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor pretargeting in mice using 99mTc-labeled morpholino, a DNA analog.</a> Journal of Nuclear Medicine. 43, 384-391 (2002).</li>
<li>Boerman, O. C., van Schaijk, F. G., Oyen, W. J. G., Corstens, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretargeted+radioimmunotherapy+of+cancer%3A+Progress+step+by+step%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pretargeted radioimmunotherapy of cancer: Progress step by step.</a> Journal of Nuclear Medicine. 44, 400-411 (2003).</li>
<li>Goldenberg, D. M., Sharkey, R. M., Paganelli, G., Barbet, J., Chatal, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+pretargeting+advances+cancer+radioimmunodetection+and+radioimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Antibody pretargeting advances cancer radioimmunodetection and radioimmunotherapy.</a> Journal of Clinical Oncology. 24, 823-834 (2006).</li>
<li>Sharkey, R. M., Chang, C. H., Rossi, E. A., McBride, W. J., Goldenberg, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretargeting%3A+taking+an+alternate+route+for+localizing+radionuclides%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor+Biology%22%5BJournal%5D)">Pretargeting: taking an alternate route for localizing radionuclides.</a> Tumor Biology. 33, 591-600 (2012).</li>
<li>Sharkey, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+delivery+of+radionuclides+for+imaging+and+therapy+of+cancer+using+pretargeting+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Improving the delivery of radionuclides for imaging and therapy of cancer using pretargeting methods.</a> Clinical Cancer Research. 11, 7109-7121 (2005).</li>
<li>Schultz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tetravalent+single-chain+antibody-streptavidin+fusion+protein+for+pretargeted+lymphoma+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A tetravalent single-chain antibody-streptavidin fusion protein for pretargeted lymphoma therapy.</a> Cancer Research. 60, 6663-6669 (2000).</li>
<li>Lewis, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evaluation+of+pretargeted+64Cu+for+tumor+imaging+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy.</a> Journal of Nuclear Medicine. 44, 1284-1292 (2003).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pretargeted+PET+imaging+strategy+based+on+bioorthgonal+Diels-Alder+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">A pretargeted PET imaging strategy based on bioorthgonal Diels-Alder click chemistry.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013).</li>
<li>Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine+ligation%3A+fast+bioconjugation+based+on+inverse+electron+demand+Diels-Alder+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Tetrazine ligation: fast bioconjugation based on inverse electron demand Diels-Alder reactivity.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 13518-13519 (2008).</li>
<li>Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Hatin, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+pretargeted+labeling+of+cancer+cells+through+a+tetrazine%2Ftrans-cyclooctene+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 48, 7013-7016 (2009).</li>
<li>Devaraj, N. K., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+tetrazine+cycloadditions%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of tetrazine cycloadditions.</a> Accounts of Chemical Research. 44, 816-827 (2011).</li>
<li>Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-based+cycloadditions%3A+application+to+pretargeted+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-based cycloadditions: application to pretargeted live cell imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 19, 2297-2299 (2008).</li>
<li>Keliher, E. J., Reiner, T., Turetsky, A., Hilderbrand, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yielding%2C+two-step+18F+labeling+strategy+for+18F-PARP1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">High-yielding, two-step 18F labeling strategy for 18F-PARP1 inhibitors.</a> ChemMedChem. 6, 424-427 (2011).</li>
<li>Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+small-molecule+ligands+for+PARP1+imaging+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells.</a> ChemBioChem. 11, 2375-2377 (2010).</li>
<li>Reiner, T., Keliher, E. J., Earley, S., Marinelli, B., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+in+vivo+imaging+of+a+18F-labeled+PARP1+inhibitor+using+a+chemically+orthogonal+scavenger-assisted+high-performance+method%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Synthesis and in vivo imaging of a 18F-labeled PARP1 inhibitor using a chemically orthogonal scavenger-assisted high-performance method.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 1922-1925 (2011).</li>
<li>Taylor, M. T., Blackman, M., Dmitrenko, O., Fox, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+synthesis+of+highly+reactive+dienophiles+for+the+tetrazine-trans-cyclooctene+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Design and synthesis of highly reactive dienophiles for the tetrazine-trans-cyclooctene ligation.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 9646-9649 (2011).</li>
<li>Selvaraj, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-trans-cyclooctene+ligation+for+the+rapid+construction+of+integrin+alpha%28v%29beta%283%29+targeted+PET+tracer+based+on+a+cyclic+RGD+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of integrin alpha(v)beta(3) targeted PET tracer based on a cyclic RGD peptide.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 21 (3), 5011-5014 (2011).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+18F+labeling+of+cysteine-containing+peptides+and+proteins+using+tetrazine-trans-cyclooctene+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Efficient 18F labeling of cysteine-containing peptides and proteins using tetrazine-trans-cyclooctene ligation.</a> Molecular Imaging. 12, 121-128 (2013).</li>
<li>Han, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+bioorthogonal+and+highly+efficient+conjugation+method+for+quantum+dots+using+tetrazine-norbornene+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Development of a bioorthogonal and highly efficient conjugation method for quantum dots using tetrazine-norbornene cycloaddition.</a> Journal of the American Chemical Society. 132, 7838-7839 (2010).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+strategy+for+the+construction+of+radiometalated+antibodies+for+positron+emission+tomography+based+on+inverse+electron+demand+Diels-Alder+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 22, 2048-2059 (2011).</li>
<li>Zeng, D., Zeglis, B. M., Lewis, J. S., Anderson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+impact+of+bioorthogonal+click+chemistry+on+the+development+of+radiopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">The growing impact of bioorthogonal click chemistry on the development of radiopharmaceuticals.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 829-832 (2013).</li>
<li>Reiner, T., Zeglis, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inverse+electron+demand+Diels-Alder+reaction+in+radiochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Labeled+Compounds+and+Radiopharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">The inverse electron demand Diels-Alder reaction in radiochemistry.</a> Journal of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals. 57, 285-290 (2014).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazine-trans-cyclooctene+ligation+for+the+rapid+construction+of+18-F+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of 18-F labeled probes.</a> Chemical Communications. 46, 8043-8045 (2010).</li>
<li>Karver, M. R., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+evaluation+of+a+series+of+1%2C2%2C4%2C5-tetrazines+for+bioorthogonal+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis and evaluation of a series of 1,2,4,5-tetrazines for bioorthogonal conjugation.</a> Bioconjugate Chemistry. 22, 2263-2270 (2011).</li>
<li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+chemistry%3A+fishing+for+selectivity+in+a+sea+of+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 6973-6998 (2009).</li>
<li>Bosch, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+strained+alkynes+for+Cu-free+click+reaction+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of strained alkynes for Cu-free click reaction in live mice.</a> Nuclear Medicine and Biology. 40, 415-423 (2013).</li>
<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+chemisry+for+pretargeted+tumor+imaging+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">In vivo chemisry for pretargeted tumor imaging in live mice.</a> Angewandte Chemie International Edition. 49, 3375-3378 (2010).</li>
<li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A33+antigen+displays+persistent+surface+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+and+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">A33 antigen displays persistent surface expression.</a> Cancer Immunology and Immunotherapy. 57, 1017-1027 (2008).</li>
<li>Carrasquillo, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((124I-huA33+antibody+PET+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).</li>
<li>Sakamoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+radioimmunolocalization+trial+of+humanized+monoclonal+antibody+huA33+in+patients+with+gastric+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma.</a> Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).</li>
<li>Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diels-Alder+reaction+for+tumor+pretargeting%3A+In+vivo+chemistry+can+boost+tumor+radiation+dose+compared+with+directly+labeled+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody.</a> Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).</li>
<li>Rossin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+reactive+trans-cyclooctene+tags+with+improved+stability+for+Diels-Alder+chemistry+in+living+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems.</a> Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).</li>
<li>Emmetiere, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((18F-labeled-bioorthogonal+liposomes+for+in+vivo+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting.</a> Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

היתרון העיקרי של אסטרטגית ההדמיה PET pretargeted הזה הוא שהוא מסוגל התוויית גידולים עם ניגודיות תמונת יעד לרקע בחלק קטן בלבד של מינון קרינת רקע המיוצר על ידי נוגדנים שכותרתו ישירות. לדוגמא, במערכת ההדמיה סרטן המעי הגס שתוארה כאן, נתונים מניסויי biodistribution חריפים הועסקו כדי לבצע חישובי dosimetry לאסטרטגית pretargeting מבוסס Cu 64 יחד עם ישירות שכותרתו 64 Cu-NOTA-huA33 ו -89 ZR-DFO-huA33. החישובים האלה מראים בבירור את היתרונות מדי מינון של מערכת...

בשלושים השנים האחרונות, טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET) הפכה לכלי הכרחי קליני באבחון ובטיפול בסרטן. נוגדנים כבר מזמן נחשבים וקטורים מבטיחים עבור המשלוח של רדיואיזוטופים פולטות פוזיטרונים לגידולים בשל זיקתם המעודנת והספציפיות לסמנים לסרטן. 1,2 הפרמקוקינטיקה עם זאת, איטית יחסית in vivo של נוגדנים מחייבת שימוש ברדיואיזוטופים עם multi-יום מחצית חיים פיזיים. שילוב זה יכול להניב מינוני קרינה גבוהה לאיברים שאינם היעד של חולים, סיבוך חשוב שיש משמעות קלינית בפרט מאז radioimmunoconjugates מוזרק לוריד ולכן - בניגוד סריקות CT הגוף חלקיים - תוצאה במינונים שקועים בכל חלק של הגוף, ללא קשר לרקמות נחקרו. כדי לעקוף בעיה זו, מאמץ משמעותי הוקדשה לdevelopment של אסטרטגיות ההדמיה PET שלנתק את הרדיו-איזוטופי ומחצית המיקוד, וכך למנף את מאפייני יתרון של נוגדנים תוך עוקפים בו-זמנית מגבלות pharmacokinetic הפנימיות שלהם. אסטרטגיות אלה - לרוב מכונות pretargeting או מיקוד רב שלבי - בדרך כלל להעסיק ארבעה שלבים: (1) מתן נוגדן מסוגל להיקשר גם אנטיגן וradioligand; ההצטברות של הנוגדן ברקמת המטרה והפינוי שלה מהדם (2); (3) הניהול של radioligand מולקולה קטנה; ו- (4) קשירת in vivo של radioligand לנוגדן ואחרי הפינוי המהיר של radioligand העודף. 3-8 בחלק מהמקרים, סולק נוסף מוזרקת בין השלבים 2 ו -3 כדי להאיץ את ההפרשה של כל נוגדן שעדיין לא מחייבים את הגידול ונשאר בדם. 5 באופן כללי, twסוגי o אסטרטגיות pretargeting הם נפוצים ביותר בספרות. בעוד שני הוכיחו מוצלחים במודלים פרה, הם גם בעלי מגבלות עיקריות שמנעו היישום הקליני שלהם. האסטרטגיה הראשונה מסתמכת על הזיקה הגבוהה בין נוגדני streptavidin מצומדות- וradiolabels-שונה ביוטין; עם זאת, immunogenicity של הנוגדנים-שונה streptavidin הוכיח להיות בעיה מדאיגה בכל קשור לתרגום. 5,6,9,10 האסטרטגיה השנייה, לעומת זאת, מעסיקה נוגדני bispecific כי כבר-מהונדס גנטי כדי לאגד את שני סרטן אנטיגן הסמן הביולוגי וhapten radiolabeled מולקולה קטנה. 3,11-14 בעוד המסלול אחרון זה בהחלט יצירתי, תחולתו הרחבה הוא מוגבלים על ידי מורכבות, חשבון, וחוסר המודולריות של המערכת. לאחרונה, פיתחנו ופרסמנו מתודולוגיה ההדמיה PET pretargeted מבוססים על ביקוש האלקטרון ההפוך דילס-Alder (אניאדה) תגובת cycloaddition בין -cyclooctene טרנס (TCO) וtetrazine (טז;. איור 1) 11 בעוד התגובה עצמו כבר ידוע במשך עשרות שנים, הכימיה IEDDA חוותה רנסנס בשנים האחרונות כטכניקת bioconjugation כימיה לחץ, כפי שמודגם על ידי העבודה המרתקת של הקבוצות של ראלף Weissleder, יוסף פוקס, ופיטר Conti בין יתר. 12-15 cycloaddition IEDDA יושם במגוון רחב של הגדרות, כולל הדמיה הקרינה עם פפטידים, נוגדנים, וחלקיקים, כמו גם הדמיה גרעינית . עם שני radiohalogens וradiometals 16-26 קשירה היא גבוהה מניב, נקייה, מהירה (k 1&gt; 30,000 M -1 שניות -1), סלקטיבי, ו-- ביקורתי -. Bioorthogonal 27 ובעוד מספר סוגים של כימיה לחץ - כולל cycloadditions-זרז Cu-אזיד alkyne, cycloadditions אזיד-alkyne-קידם מתח, וStaudinger ligations -. גם הוא bioorthogonal, זה שילוב הייחודי של קינטיקה מהירה תגובה וbioorthogonality שעושה כימיה IEDDA גם כך מתאים לpretargeting יישומים בכל האורגניזמים 28,29 לאורך שורות אלה, חשוב לשים לב כי לאחרונה דווח משלנו מעבדות לא היו הראשונה ליישם כימיה IEDDA לpretargeting: הדו&quot;ח הראשון של הדמיה pretargeted עם IEDDA נבעו מהעבודה של Rossin, et al והשתתפות מתודולוגיה SPECT העסקת 111 tetrazine שכותרתו ב- 30.. כפי שהזכרנו לעיל, יש מתודולוגיה pretargeting ארבעה צעדים פשוטים למדי (איור 2). בפרוטוקול ביד, אסטרטגית pretargeted להדמית PET של סרטן מעי גס שמעסיקה radioligand 64 שכותרתו Cu-NOTA tetrazine והמצומד שונה-TCO של נוגדן huA33 תתואר. עם זאת, בסופו של המודולריות של מתודולוגיה זו היא אחת מגרנכסי eatest, כמחצית -cyclooctene טרנס יכולים להיות מצורפים לכל נוגדן שאינה הפנמה, וtetrazine יכול להיות מחובר למגוון רחב של כתבים רדיואקטיביים.

<table><tbody><tr><td>טטרזין NHS Ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>חנות 764701</td><td>ב-80 מעלות; C</td></tr><tr><td>טרנס-ציקלואוקטן NHS Ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764523</td><td>חנות ב -80 מעלות; C</td></tr><tr><td>p-NH2-BN-NOTA</td><td>Macrocyclics</td><td>B-601</td><td>חנות ב-80 מעלות; ג</td></tr></tbody></table>

רתימת ביקוש bioorthogonal הפוך אלקטרונים דילס-alder cycloaddition לpretargeted pet הדמיה

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

בשל הזיקה והספציפיות המעודנת שלהם, הנוגדנים הפכו לווקטורים מבטיחים ביותר להעברת רדיואיזוטופים לתאים סרטניים להדמיית PET. עם זאת, הצורך לתייג נוגדנים עם רדיונוקלידים עם זמן מחצית חיים פיזיקלי ארוך מביא לעתים קרובות לשיעורי מינון קרינת רקע גבוהים לרקמות שאינן מטרה. על מנת לעקוף בעיה זו, השתמשנו באסטרטגיית הדמיית PET ממוקדת מראש המבוססת על תגובת ציקלותוספת האלקטרונים ההפוכה של Diels-Alder. המתודולוגיה מנתקת את הנוגדן מהרדיואקטיביות ובכך מנצלת את המאפיינים החיוביים של הנוגדנים, תוך הימנעות מהחסרונות הפרמקוקינטיים שלהם. המערכת מורכבת מארבעה שלבים: (1) הזרקת מצומד mAb-טרנס-ציקלוקטן (TCO); (2) פרק זמן לוקליזציה שבמהלכו הנוגדן מצטבר בגידול ומתפנה מהדם; (3) הזרקת הטטרזין המסומן ברדיו; ו-(4) קשירת הקליק in vivo של הרכיבים ואחריה פינוי עודף רדיוליגנד בדוגמה שהוצגה בעבודה שלפנינו, רדיוליגנד טטרזין 64עם תווית Cu-NOTA ונוגדנים אנושיים מצומדים טרנס-ציקלוקטן (huA33) שימשו בהצלחה לתיחום גידולי סרטן המעי הגס SW1222 עם ניגודיות גבוהה בין גידול לרקע. יתר על כן, מתודולוגיית הטרום-מיקוד מייצרת תמונות באיכות גבוהה רק בשבריר ממנת הקרינה לרקמה שאינה מטרה שנוצרה על ידי מצומדים רדיואימונו-אימוניים המסומנים ישירות ב-64Cu או 89Zr. בסופו של דבר, המודולריות של פרוטוקול זה היא אחד הנכסים הגדולים ביותר שלו, שכן ניתן לצרף את החלק הטרנס-ציקלואוקטן לכל נוגדן שאינו מופנם, וניתן לחבר את הטטרזין למגוון רחב של רדיואיזוטופים.

שלושה שלבים הראשוניים של הניסוי - הסינתזה של TZ-BN-נוטה, נטיה של TCO לhuA33, וradiolabeling של TZ-BN-NOTA לבנות (איורים 3 ו -4) - הם אמין ביותר. במקרה של ההליך הנ&quot;ל, מבנה TZ-BN-NOTA היה מסונתז בתשואה גבוהה וטוהר. נוגדן huA33 היה שונה עם 4.2 ± 0.6 TCO / מב, וTZ-BN-NOTA היה radiolabeled עם 64 Cu להניב radioligand המטוהר ב&gt; 99% טוהר radiochemical, 85% תשואה&gt; מתוקן ריקבון, ופעילות ספציפית של ~ 6.7 MBq / nmol (איור 5).</st...

הביקוש לאלקטרונים הפוכים ביואורתוגונליים Diels-Alder נרתמה ליצירת אסטרטגיית הדמיית PET יעילה ומודולרית לסרטן. בפרוטוקול זה, השלבים של מתודולוגיה זו מתוארים בהקשר של מערכת מודל המשתמשת בנוגדנים ממוקדים לסרטן המעי הגס huA33 ורדיוליגנד 64Cu.

רתימת ביקוש Bioorthogonal הפוך אלקטרונים דילס-Alder cycloaddition לPretargeted PET הדמיה

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא ביצוע סימון מוקדם של רקמה סרטנית באמצעות תגובה ביו-אורתוגונלית בין Tetrazine ל-trans-cyclooctine לצורך דימוי PET. דבר זה מושג על ידי הזרקה לעכבר הנושא גידול של נוגדן המסומן ב-trans-cyclooctine, ולאחר תקופת המתנה שבה הנוגדן מצטבר באיטיות בגידול ומנוקה מהדם, מוזרק לאותה חיה רדיוליגנד של tetrazine.הליגנד הרדיואקטיבי נקשר בשיטת "קליק" לנוגדן המסומן ב-TCO בגידול, ומכיוון שמדובר במולקולה קטנה, הוא מפונה מהדם במהירות. הדמיות ה-PET בבעלי חיים קטנים שמתקבלות מראות תיחום ברור של הגידול עם ניגודיות גבוהה ויחסי פעילות גבוהים בין הגידול לרקע. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הדמיות PET עם נוגדנים המסומנים באופן ישיר, הוא שהיא מספקת תמונות בניגודיות גבוהה תוך שימוש בחלק קטן בלבד ממנת הקרינה המועברת למטופל.להשלכות של טכניקה זו יש משמעות טיפולית, מכיוון שטכניקות של טרגוט מוקדם (pre-targeting) יכולות להוביל כמויות גבוהות מאוד של קרינה לגידולים, בעוד שבמקביל המינונים המועברים לאיברים ורקמות בריאות יהיו נמוכים מאוד. אני אדגים טכניקה זו יחד עם קתרין קאזה, טכנאית במעבדה שלנו. תגובת הסינתזה מתחילה בהמסה של 7 mg של NH2-BN-Notta ב-600 µL של נתרן ביקרבונט 0.1 M ב-pH 8.1.בדקו את ה-pH והשתמשו במנות קטנות של נתרבן פחמה 0.1 molar כדי לכוון את ה-pH ל-8.1 במידת הצורך. לאחר מכן, הוסיפו תמיסה זו ל-0.5 milligrams של TZ NHS בשפופרת מיקרו-צנטריפוגה. השאירו את התגובה להדגירה למשך חצי שעה בטמפרטורת החדר עם ערבול עדין.ניתן להמיס את מלאי ה-TZ NHS ב-DMF או ב-DMSO לאחר חצי שעה. יש לטהר את המוצר באמצעות HPLC פאזה הפוכה C 18 כדי להסיר את ה-NH two BN notta שאינו תגובתי, אשר יירשם ב-254 nanometers. את ה-TZ NHS וה-TZ BN Notta מומלץ לנטר ב-525 nanometers.זמן השהייה של הדגימה ישתנה בהתאם לציוד, אך בשימוש במדרג (gradient) של אצטוניטריל למים מ-0 ל-100 ואז חזרה ל-0 לאורך 25 דקות, ובעמודה אנליטית מסוג C 18 בגודל 4.6 על 250 מילימטרים, זמני השהייה עבור שלושת התרכובות יהיו 16.5, 15 ו-10 דקות בהתאמה. הקפיאו את תסמיך ה-HPLC שנאסף בחנקן נוזלי ולאחר מכן עטפו את המבחנה בנייר אלומיניום אטום. כעת, הניחו את המבחנה הקפואה בכלי לייופיליזציה והניחו אותה במקפיא לייופיליזטור למשך הלילה.כדי להסיר את הפאזה הניידת של ה-HPLC לצורך אימות טוהר ה-TZ bn no top precursor המושלם, השתמשו ב-proton NMR, ב-analytical HPLC ו/או ב-ESI mass spectrometry. התחילו את התגובה על ידי הכנת תמיסה בריכוז 2.7 millimolar של T-C-O-N-H-S ב-DMF בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה, ובמבחנת מיקרו-צנטריפוגה שנייה הכינו תמיסה בריכוז שני milligrams per milliliter של HUA 33 בתוך 1 milliliter של PBS pH 7.4.לאחר מכן, באמצעות תוספות קטנות של נתרבן פחמה (sodium carbonate) בריכוז 0.1 מולרי, כווננו את ה-pH של התמיסה לערך שבין 8.8 ל-9.0, אך לא מעבר לכך. בשלב הבא, הוסיפו נפח של T-C-O-N-H-S התואם לשמונה שוולנטים מולריים של האסטר הפעיל. ערבבו בעדינות את התמיסה באמצעות מספר הפיכות ועטפו אותה בנייר אלומיניום.לאחר מכן, הניחו למבחנה לדגירה בטמפרטורת החדר למשך כשעה עם ערבול עדין. לאחר שעה, השתמשו בעמודת הסרת מלחים (desalting) חד-פעמית מובנית המבוססת על הפרדה לפי גודל (size exclusion) כדי לטהר את האימונו-קונג'וגט מהתגובה. הוסיפו 1 mL של תערובת התגובה לעמודה, ולאחר מכן הוסיפו 1.5 mL של תמיסת saline סטרילית בריכוז 0.9%.לאחר מכן, בצעו אלוציה של תוצר ה-HUA 33 TCO האנושי באמצעות שני מיליליטר של 0.9%saline. מדדו את ריכוז התוצר באמצעות ספקטרומטר UV vis. אם הריכוז נמוך מהרצוי, רכזו את התוצר באמצעות מסנן צנטריפוגלי בעל משקל מולקולרי של 50, 000.התחל בהכנת תמיסה של TZ BN notta בריכוז 0.5 milligrams per milliliter בתוך מבחנת מיקרו-צנטריפוגה. במבחנת מיקרו-צנטריפוגה שנייה, הוסף 10 microliters מתמיסת ה-TZ BN Notta שהוכנה ל-400 microliters של באפר ammonium acetate בריכוז 0.2 molar ב-pH 5.5. הקפד למדוד ולתעד את רמת הרדיואקטיביות של הדגימה לפני ואחרי כל אחד מהשלבים הבאים.דבר זה חיוני לחישוב מדויק של ניצול רדיוכמיקלי ולניהול רישומים. כעת, הוסיפו 2000 micro curies של נחושת 64 לתמיסת ה-TZ BN Notta. דגרו תערובת זו בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות עם ערבוב קל.כדי לטהר את המוצר, השתמש ב-HPLC פאזה הפוכה C 18; דלל את המוצרים באמצעות גרדיאנט של אצטוניטריל למים ביחס של 5 עד 95 ו-95 עד 5 לאורך 15 דקות עם 0.1% TFA. ה-tz, BN nota המסומן רדיואקטיבית יבוא באלוציה בדקה 9.8, בעוד שנחושת 64 החופשית תבוא באלוציה עם חזית הממס בין דקה 2 לדקה 4. לאחר הסרת ממס ה-HPLC באמצעות מאדה סיבובי, המס את המוצר המסומן רדיואקטיבית במי מלח סטריליים 0.9%, ולאחר מכן השתמש במוצר בהקדם האפשרי. הליך זה מתחיל בדילול של אליקוות מתמיסת HEA 33 TCO המוכנה לריכוז של 0.5 milligrams per milliliter במי מלח סטריליים 0.9%.לאחר מכן, הזרק 200 µL מהתמיסה לווריד הזנב של העכבר הנושא את הקסנוגרפט. הנח ל-humanized a 33 TCO להקיף את הגוף ולהצטבר בגידול במשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, הכן copper 64 labeled TZ BN Notta בריכוז של 1.5 mCi למילליליטר בסליין סטרילי 0.9%.לאחר מכן, השתמש בהזרקה לווריד הזנב כדי להחדיר 200 µL של תמיסת הרדיוליגנד שהוכנה לעכבר בזמן הרצוי. הרדם את העכבר והנח אותו על מיטת סורק PET לבעלי חיים קטנים. יש לשמור על ההרדמה באמצעות הגשה דרך חרוט אף, ויש לאשר את מצב ההרדמה באמצעות צביטה בבהונות.כדי למנוע התייבשות, יש למרוח שכבה דקה של משחה עינית. כעת, רכשו נתוני חיות מחlaboratory באמצעות סריקה סטטית עם 60 מיליון אירועי התאמה ב-350 עד 700 kilo electron volts, ובזמן התאמה של שש nanoseconds. לאחר ההדמיה, המתינו עד שהעכבר יתעורר לפני השבתו לכלוב, ייתכן יחד עם עכברים אחרים. עכברי nude thymic הנושאים תאי סרטן דופן מעביה של המעי הגס SW 1222 המבטאים אנטיגן 33.הקסנוגרפטים נבחנו באמצעות הפרוטוקול המתואר. הן ניסויי ההפצה הביולוגית החריפה והן ניסויי ה-PET imaging מגלים כי אסטרטגיית ה-pre-targeting מסוגלת להגדיר את הקסנוגרפט של סרטן המעי הגס בניגודיות תמונה מצוינת, וביחסים גבוהים של פעילות גידול לרקע. במהלך מספר שעות, הרדיוליגנד מפונה בצואה ויחסי הפעילות של הגידול לרקע הופכים לגבוהים מאוד.מספר משתנים בגישה זו של טרום-סימון (pre-targeting) דרשו אופטימיזציה, כפי שקורה בכל אסטרטגיית דימות. מתן 300 micrograms של קונג'וגט של נוגדן ו-TCO במקום 100 micrograms הוביל לעלייה ברדיואקטיביות הנראית בלב העכבר, וכך גם קיצור המרווח מ-24 ל-12 שעות. בשני המקרים, תגובת ה-click עדיין התרחשה בגידול, כפי שמעיד בבירור הספיגה הגידולית בנקודות זמן מוקדמות.עם זאת, תגובת ה-click מתרחשת בבירור גם בדם, דבר שאינו רצוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, יש להשיג איזון עדין בין כל משתני ה-pre-targeting. חשוב מאוד שכל אחד ממסות ה-TCO Immunoconjugate וכן מרווח הזמן בין ההזרקות יעברו אופטימיזציה.אל תשכחו שעבודה עם רדיואקטיביות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות במהלך הניסוי, כגון לבישת ציוד מגן אישי (PPE) מתאים ווידוא שהקרינה ממוגנת בכל עת.

harnessing-bioorthogonal-inverse-electron-demand-diels-alder

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מתאר את הטכניקה של רדיואימונותרפיה ממוקדת מראש או PRIT, שבה חיסונים מצומדים ואחריו רדיוליגנדים ניתנים לטיפול בגידולים. רדיואימונותרפיה זו מפחיתה את מנות הקרינה לרקמות בריאות ומשתמשת ברדיונוקלידים בעלי זמן מחצית חיים נמוך מאוד שאינם תואמים לווקטורים מבוססי נוגדנים.

רדיואימונותרפיה ממוקדת מראש: שיטה להעברה ממוקדת של רדיונוקלידים טיפוליים לגידולים

אנו מציגים שיטה לקיבוע מהיר, הפיך של מולקולות קטנות והרכבות nanoparticle פונקציונליות ללימודי Surface Plasmon התהודה (SPR), תוך שימוש רציף לכידת הכימיה cycloaddition bioorthogonal ונוגדן אנטיגן על השבב.

Microfluidic תגובת Capture-חיי בן אשר על השבב כדי לשתק הפיך מולקולות קטנות או מבני Multi-רכיב עבור יישומי Biosensor

בשל זמן מחצית החיים הרדיואקטיבי הרב-יומי שלו ותכונות הדעיכה החיוביות, הרדיו-מתכת פולטת הפוזיטרונים 89Zr מתאימה מאוד לשימוש בתרופות רדיו-פרמצבטיות מבוססות נוגדנים להדמיית PET. בפרוטוקול זה יתוארו הביו-קונגוגציה, הרדיוסינתזה והיישום הפרה-קליני של 89נוגדנים המסומנים ב-Zr.

Bioconjugation וRadiosynthesis של<sup&gt; 89</sup&gt; נוגדנים שכותרתו ZR-DFO

נוהל מפורט לסינתזה של אזיד 125 I-שכותרתו ואת radiolabeling של dibenzocyclooctyne (DBCO) -group מצומדות, 13 ננומטר בגודל ננו-חלקיקי זהב באמצעות תגובת לחץ ללא נחושת מתואר.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור Radiolabeling היעיל של חלקיקי זהב על ידי שימוש<sup&gt; 125</sup&gt; שכותרתו לי אזיד תותבת קבוצה

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לתיוג רדיו ובדיקות in vivo של נגזרות כלאט-טטרזין תלת-שיניים 99mTc(I) לכימיה מוקדמת וביו-אורתוגונלית.

הכנה והערכה של<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc שכותרתו Tridentate chelates לחינוך קדם-מיקוד שימוש Bioorthogonal לכימיה

אנו מדגימים את הסינתזה הרדיו-כימית האוטומטית למחצה של [ 18 F] 3F4AP ונהלי בקרת איכות.

אוטומטי סינתזה Radiochemical של [<sup22</sup&gt; F] 3F4AP: עוקב PET חדשנית עבור הדמיה מחלות Demyelinating

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) אתרים הדמיה המעורבים בניסויים מחקר קליני מוקדם מרובים צריך יכולות הייצור radiotracer חזקים ופסיביות. שימוש radiotracer את [18נ] Clofarabine כדוגמה, אנחנו להמחיש כיצד להפוך לאוטומטית את הסינתזה של radiotracer באמצעות radiosynthesizer גמיש, מבוססי קלטת ולאמת את הסינתזה לשימוש קליני.

אוטומציה של טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) Radiotracer סינתזה פרוטוקול לייצור קליני

פרוטוקול זה מתאר את סינתזה של אפיון טרנס- cyclooctene (TCO)-שונה נוגדן, radioligand tetrazine התווית על-ידי Lu (ט ז) 177עבור pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). בנוסף, זה מפרט את השימוש אלה בונה שני עבור ויוו biodistribution ומחקרים טיפול האורך במודל מאתר של סרטן המעי הגס.

Radioimmunotherapy pretargeted התגובה תגובת דילס-אלדר דרישה אלקטרון הופכי

אנו מציגים פרוטוקול להדמיה ישירה של פעילויות מטבוליות בתאים המווסתים על ידי חומצות אמינו באמצעות מיקרוסקופ פיזור ראמאן מגורה (DO-SRS) המשולב במיקרוסקופ פלואורסצנטי עירור של שני פוטונים (2PEF).

הדמיה כימית ביו-אורתוגונלית של מטבוליזם בתאים המווסתת על ידי חומצות אמינו ארומטיות

פרוטוקול זה מציג הליך מפורט להכנת ארבעה רדיוטרייסרים פחמן-11 באמצעות "שיטת הלולאה" [11C]מתילציה. אנו מתארים את הליך הסינתזה [11C]ER-176, עם נתונים עבור שלושה רדיוטרייסרים נוספים: [11C]MRB, [11C]mHED ו-[11C]PiB. שיטת הלולאה מספקת סינתזה יעילה עם תפוקות רדיוכימיות מוגברות כנגד כלי התגובה המסורתיים [11C]methylation.

שיפור היעילות ותפוקות התיוג הרדיואקטיבי של רדיוליגנדים פחמן-11 למחקר קליני בשיטת לולאה

למדו שיטת הדמיית PET מטרגטת מראש לגילוי סרטן באמצעות תגובה ביואורתוגונלית בין נוגדן TCO לרדיוליגנד טטרזין. השיטה מספקת ניגודיות גבוהה ומינון קרינה נמוך יותר.

רתימת ביקוש Bioorthogonal הפוך אלקטרונים דילס-Alder cycloaddition לPretargeted PET הדמיה

גלה סרטונים נוספים