מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד את התפקוד של אוכלוסיית תעלות CFTR במערכת משוחזרת, ולבחון את תגובת התעלות לנוכחות של מולקולות מווסתות (modulator molecules). זאת מושג תחילה על ידי ניקוי חלבון CFTR מסוג פראי (wild type) או מוטנטי מתאי SF nine באמצעות הליך ניקוי מהיר, המניב חלבון CFTR תפקודי בתמיסת דטרגנט. השלב השני הוא שחזור החלבון המנוקה אל תוך ליפוזומות חלבון המכילות ליפידים מוגדרים, כפי שייבחר על ידי הנסייני.

בשלב הבא, נוצר מפל ריכוזים כימי של יודיד לאורך הממברנה על ידי הסרת עודפי היודיד מהליפוזומים, כדי ליצור כוח מניע לתנועת יונים דרך תעלת ה-CFTR. השלב הסופי הוא הפעלת התעלה ויזום שחרור יודיד מהליפוזומים הפרוטאים בנוכחות מולקולת המודולטור הנבדקת. לבסוף, נעשה שימוש באלקטרודה סלקטיבית ליודיד כדי לנטר את תפקוד תעלת ה-CFTR בזמן אמת במערכת רקונוסטיטואית זו.

שיטה זו מאפשרת לחקור את פעילות תעלת הכלוריד של אוכלוסייה מנוקה של מולקולות CFTR לאחר שחזור לתוך ליפוזומים של פוספוליפידים. למרות ששיטה זו נועדה לספק תובנות לגבי התפקוד של תעלת CFTR והשפעתם של מודולטורים של מולקולות קטנות, ניתן להחיל שיטה זו גם על מערכות אחרות, כגון אפיון תפקודי של חלבוני ממברנה אחרים. כדי להצליח, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו צריכים לוודא כי ביצעו אופטימיזציה ליחסי החלבון-ליפיד עבור המערכת שלהם, שהם אינם עובדים עם חלבון בעל תפקוד לקוי או חלבון שאינו תפקודי, וכי יצרו גרדיאנט יוד מספיק על פני וסיקולות אטומות היטב.

כדי להכין את הליפיד, ייבשו תחילה 5 mg של egg phosphatidylcholine או egg PC בתוך מבחנה מזכוכית שאינה בורוסיליקט תחת זרם של גז ארגון למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חשבו את נפח buffer six הדרוש כפי שצוין בפרוטוקול הכתוב, והוסיפו את buffer six ישירות אל הליפיד. אטמו את מבחנת הזכוכית באמצעות perfil ולאחר מכן ערבבו את המבחנה במכשיר vortex למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר כדי להשעות את הליפיד בבופר.

בשלב הבא, השהה את הליפיד בטמפרטורת החדר באמצעות מחט בכיול 25 המחוברת למזרק של 1 ml, עד שלא תהיה נראית שכבת ליפיד על דפנות המבחנה. הבאפר יהיה עכור בשל הליפיד המושהה. בצע סוניקציה לליפיד שבמבחנה בפעימה ה-22 באמבט סוניקציה המכילה קרח, ולאחר מכן הנח את המבחנה על קרח למנוחה למשך דקה אחת.

בצע מחזור זה שלוש פעמים. לאחר מכן, הוסף את חלבון ה-CFTR לליפידים, עד לקבלת נפח סופי של 1 mL. ערבב את החלבון עם תרחיף הליפידים 10 פעמים באמצעות מחט בכיול 25 gauge.

הנח את הדגימה על קרח למשך 30 דקות, תוך סיבוב השפופרת חמש פעמים בכל חמש דקות כדי לערבב בזמן דגירה של הדגימה. שבור את הלשונית התחתונה של עמודת ספין לקישור דטרגנט לשימוש חד-פעמי וסבב את העמודה בצנטריפוגה למשך שתי דקות ב-2000 ×g. כדי להסיר את בופר האחסון, שטוף את העמודה עם 5 mL של בופר 7 וסבב את העמודה בצנטריפוגה למשך ארבע דקות ב-2000 ×g כדי לשטוף את בופר השטיפה.

שטפו את העמודה שלוש פעמים, העבירו את כל דגימת הפרוטאין-ליפיד בנפח של one milliliter לחלק העליון של שרף העמודה, ולאחר מכן דגרו את העמודה למשך two minutes בטמפרטורת החדר. סבבבו את העמודה בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך four minutes במהירות של 2000 ×g. לאחר מכן, העבירו את דגימת הליפוזום-פרוטאין העכורה למסורת מיקרו-פוגה נקייה והניחו את המסורת על קרח. השרו five grams של חרוזי cidex G 50 ב-50 milliliters של בופר nine למשך לפחות two hours בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, טענו ארבע עמודות סריקה קטנות בחרוזיים הרוויים עד שהן מלאות לפחות בשלושה רבעים. סובבו את העמודות בצנטריפוגה למשך ארבע דקות ב-2000 $\times$g כדי להסיר עודפי באפר מהשרף. לאחר הצנטריפוגה, בעמודה צריכים להימצא כ-2.25 milliliters של שרף דחוס.

חשוב מאוד שהשרף יהיה מהוהה כראוי עבור אלוציה עם הליפוזומים של הפרוטאו. לאחר מכן, העבירו 125 µL מדגימת הליפוזומי פרוטאו לראש כל עמודה וסבבו בצנטריפוגה במשך ארבע דקות ב-2000 ×g. אגרו את ה-EITs לשימוש בניסויי iodide FLX.

הכנס מגנט ערבוב קטן מסוג F fleece לבאר אחת של פלטת 96 בארות, ולאחר מכן הוסף לבאר 150 µL של VX seven 70 בריכוז של 20 µM בבופר nine. השתמש בקצה פפטה כדי להסיר בועות אוויר. לאחר מכן, הוסף לבאר 150 µL של דגימת ה-protea liposome לנפח כולל של 300 µL.

הנח את פלטת 96 הבארים על מערבל מגנטי במהירות של 130 סיבובים לדקה. הכנס את קצה האלקטרודה הרגישה ליוד לתוך התמיסה מבלי לגעת במגנט או בתחתית הבאר. כדי להקליט את עקומות אות האלקטרודה, סנן את האות באמצעות מסנן מעבס (low pass filter) בקצב דגימה של 2 Hz; הקלט את העקומות מהדגימה למשך חמש דקות כדי לאפשר לדגימה להגיע לשיווי משקל.

הדבר אמור להניב קו בסיס יציב וכמעט שטוח. לאחר מכן, יש להוסיף 3 µL של תמיסת סטוק בריכוז 100 mM של magnesium ATP ב-pH 7. כדי להפעיל את תעלולי ה-CFTR, יש לאפשר לדגימה להגיע לשיווי משקל במשך חמש דקות נוספות עד להשגת קו בסיס חדש.

בשלב הבא, הוסיפו 3 µL של תמיסת סטוק בריכוז 2 µM של valinomycin כדי לבטל את המדרג האלקטרוכימי שנוצר כתוצאה מפעילות CFTR. רשמו את הירידה במתח החשמלי הנובעת מפעילות iodide FLX המתווכת על ידי CFTR למשך חמש דקות לפחות.

לאחר מכן, הוסף שלוש µL של תמיסה של 10% Triton X 100 לדגימה כדי לשחרר יוד מהלומן של הליפוזום הפרוטאואידי כביקורת. שחרור משמעותי של יוד מעיד על כך שהיוד הכלוא בתוך הוזיקולות לא הגביל את פעילות ה-CFTR. לאחר מדידת הדגימה, הכן סדרת מהלולות של אשלגן יודיד בריכוזים שבין מיקרו-מולרי לננו-מולרי בבופר תשע.

החל מהתמיסה המדוללת ביותר, רשמו את תגובת האלקטרודה במילי-וולט עבור כל ריכוז של יוד כדי ליצור עקומת כיול. בוצע ניתוח של CFTR מסוג הפרא (wild type) עבור יוד. פעילות ה-F flux נמדדה בננו-מולים לשנייה לאחר רקונוסטיטוציה.

זרימת יודיד (Iodide F flux) מעוררת באופן משמעותי בנוכחות CFTR ו-TP בהשוואה לבקרה נטולת CFTR, וכן על ידי הוספת TP. כאשר CFTR עובר פוספורילציה על ידי פרוטאין קינאז התלוי ב-cyclic AMP, תת-יחידה קטליטית הידועה כ-PKA; לעומת זאת, טיפול מקדים במעכב החזק CFTR inhibitor 172 מפחית את קצב זרימת היודיד. היכולת של VX-770 להגביר את זרימת היודיד של CFTR מסוג פראי (wild type) נבדקה ללא ובנוכחות פוספורילציה על ידי PKA; VX-770 הגביר את זרימת היודיד היחסית רק בנוכחות CFTR מפוספורל. היעילות של VX-770 נבדקה באמצעות וריאנט של CFTR הנקרא Delta 508 CFTR, כאשר אנלוג לא פעיל, V091188, אינו מגביר את הפעילות של Delta 508 CFTR מפוספורל, בעוד ש-VX-770 מגביר את זרימת היודיד היחסית. לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן להשלים את התהליך מהטיהור ועד למדידות פעילות CFTR ביום עבודה טיפוסי של שמונה שעות; טיהור של CFTR אורך כארבע שעות והשחזור (reconstitution) אורך שעה נוספת לפני תחילת בדיקת ה-eFlux.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כולל בדיקת T PS ומדידה של מוליכות בערוץ בודד ב-para lipid S, תוך שימוש באותה הכנה של חלבון CFTR, כדי לאפיין עוד יותר את האינטראקציה עם המולקולות הקטנות. באמצעות שיטות אלו, חוקר של סיסטיק פיברוזיס יוכל לענות על שאלות מפתח בתחום המודולטורים של CFTR, ובייחוד, האם המודולטור מקיים אינטראקציה ישירה עם חלבון ה-CFTR ומהו מנגנון הפעולה של אותו מודולטור.