Name: ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: חקור השוואת ביטוי חלבון רקומביננטי אנושי בפלטפורמות ייצור שונות: תרביות מותססות ומערכות צמחיות. למד את היתרונות והמגבלות של כל שיטה לייעול תהליכי ייצור.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פעולת COST 'פארמינג מולקולרי: צמחים כפלטפורמת ייצור לחלבונים בעלי ערך גבוה' FA0804. המחברים מודים לד"ר אנטולי גיריץ' ולפרופ' יורי גלבה על שסיפקו את הווקטורים של MagnICON למטרות מחקר.

<ol><li>Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+of+K396R+of+the+65+kDa+glutamic+acid+decarboxylase+active+site+obliterates+enzyme+activity+but+not+antibody+binding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding.</a> FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+GAD65+accumulates+to+high+levels+in+transgenic+tobacco+plants+when+expressed+as+an+enzymatically+inactive+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Recombinant human GAD65 accumulates to high levels in transgenic tobacco plants when expressed as an enzymatically inactive mutant.</a> Plant Biotechnol. J. 9 (8), 862-872 (2010).</li>
<li>Sambrook, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+laboratory+manual.+Second+Edition%22">Molecular Cloning: A laboratory manual. Second Edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+biofactories+for+the+production+of+a+major+diabetes+autoantigen%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different biofactories for the production of a major diabetes autoantigen.</a> Transgenic Res. 23, 281-291 (2014).</li>
<li>Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+engineering+of+viral+RNA+replicons%3A+efficient+assembly+by+recombination+of+DNA+modules+delivered+by+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 101 (18), 6852-6857 (2004).</li>
<li>Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+the+expression+of+proteins+in+plants%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for the expression of proteins in plants).</a> Curr. Opin. Biotechnol. 18, 134-141 (2007).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), (2008).</li>
<li>Xu, R., Li, Q. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+streamline+cloning+of+genes+into+binary+vectors+in+Agrobacterium+via+the+Gateway+TOPO+vector+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway TOPO vector system.</a> Plant Methods. 4 (4), 1-7 (2008).</li>
<li>Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+analysis+of+the+major+polypeptides+of+the+human+erythrocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane.</a> Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).</li>
<li>Falorni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioimmunoassay+detects+the+frequent+occurrence+of+autoantibodies+to+the+Mr+65%2C000+isoform+of+glutamic+acid+decarboxylase+in+Japanese+insulin-dependent+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Radioimmunoassay detects the frequent occurrence of autoantibodies to the Mr 65,000 isoform of glutamic acid decarboxylase in Japanese insulin-dependent diabetes.</a> Autoimmunity. 19, 113-125 (1994).</li>
<li>Hunt, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+to+protein%3A+a+review+of+new+and+enabling+technologies+for+multi-parallel+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression.</a> Protein Expr. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).</li>
<li>Arzola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+co-expression+of+post-transcriptional+silencing+suppressor+for+increased+in+planta+expression+of+a+recombinant+anthrax+receptor+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Transient co-expression of post-transcriptional silencing suppressor for increased in planta expression of a recombinant anthrax receptor fusion protein.</a> Int. J. Mol. Sci. 12 (8), 4975-4990 (2011).</li>
<li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories%3A+the+green+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: the green perspective.</a> Biomed. Res. Int. 2014, 136419(2014).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+%28GAD65%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Res. 12 (2), 203-212 (2003).</li>
<li>Leuzinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+agroinfiltration+of+Plants+for+high-level+transient+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient agroinfiltration of Plants for high-level transient expression of recombinant proteins.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים בנוגע לפרסום מאמר זה.

במחקר זה שלוש פלטפורמות שונות הושוו לביטוי של חלבון אנושי רקומביננטי: תאי חיידקים, תאי baculovirus / חרקים וצמחים. הפלטפורמה הבוסס על הצמחים שנחקרה עוד יותר על ידי ניצול שלוש טכנולוגיות בשימוש נרחבת ביטוי (כלומר, חולף - MagnICON וpK7WG2 מבוססת - ויציב). חלבון המטרה שנבחר לניסוי זה, hGAD65mut, כבר הביע בעבר במערכות שונות 13, והייצור ואת הפונקציונליות שלו הם בקלות לזיהוי ומדידה 14. תא...

חלבונים רקומביננטיים מיוצרים באופן מסחרי במערכות ביטוי הטרולוגיות בעזרת כלים ביוטכנולוגיים מתפתחים. גורמי מפתח שיש לקחת בחשבון בעת בחירת מערכת הביטוי ההטרולוגית כוללים: איכות החלבון, פונקציונליות, מהירות תהליך, תפוקה ועלות.
בתחום החלבון הרקומביננטי, שוק התרופות מתרחב במהירות וכתוצאה מכך, רוב התרופות הביולוגיות המיוצרות כיום הן רקומביננטיות. חלבונים יכולים לבוא לידי ביטוי בתרביות תאים של חיידקים, שמרים, עובשים, יונקים, צמחים וחרקים, כמו גם במערכות צמחים (באמצעות טרנספורמציה יציבה או חולפת) ובעלי חיים טרנסגניים; לכל מערכת ביטוי יש את היתרונות והמגבלות הטבועים בה ועבור כל חלבון רקומביננטי מטרה יש להעריך בקפידה את מערכת הייצור האופטימלית.
פלטפורמות מבוססות צמחים צצות כחלופה חשובה למערכות מבוססות תסיסה מסורתיות לייצור חלבון רקומביננטי בטוח וחסכוני. למרות שעלויות העיבוד במורד הזרם דומות לאלו של תאים מיקרוביאליים ויונקים, ההשקעה הנמוכה יותר מראש הנדרשת לייצור מסחרי במפעלים והחיסכון הפוטנציאלי לגודל, המסופק על ידי גידול על פני שטחים גדולים, הם יתרונות מרכזיים.
הערכנו צמחים כביו-ריאקטורים לביטוי איזופורם של 65 kDa של חומצה גלוטמית אנושית דקרבוקסילאז (hGAD65), אחד האוטואנטיגנים העיקריים בסוכרת אוטואימונית מסוג 1 (T1D). hGAD65 מאומץ במידה רבה כסמן, הן לסיווג והן לניטור התקדמות המחלה ותפקידו במניעת T1D נחקר כעת בניסויים קליניים. אם ניסויים אלה יצליחו, הביקוש העולמי ל-hGAD65 רקומביננטי יגדל באופן דרמטי.
כאן, אנו מתמקדים בביטוי המקביל הלא פעיל מבחינה אנזימטית של hGAD65, hGAD65mut, מוטנט שנוצר על ידי החלפת שאריות הליזין הקושרות את הקו-פקטור PLP (פירידוקסל-5'-פוספט) בשאריות ארגינין (K396R)1. 
hGAD65mut שומר על החיסון שלו, ובתאי צמחים וחרקים, מצטבר עד פי עשרה יותר מ-hGAD65, מקבילו מסוג הבר. הועלתה השערה כי הפעילות האנזימטית של hGAD65 מפריעה לחילוף החומרים של תאי הצמח עד כדי כך שהיא מדכאת את הסינתזה שלו, בעוד ש-hGAD65mut, הצורה הלא פעילה מבחינה אנזימטית, יכולה להצטבר בתאי הצמח לרמות גבוהות יותר.
עבור הביטוי של hGAD65mut, השימוש בטכנולוגיות שונות, הנמצאות בשימוש נרחב בביוטכנולוגיה של צמחים, נחקר כאן והושווה לפלטפורמות ביטוי מסורתיות (Escherichia coli ו-Baculovirus/insect-cell-based).
בעבודה זו, הפלטפורמות הרקומביננטיות שפותחו לביטוי hGAD65mut המורכבות ממערכות מסורתיות ומבוססות צמחים נסקרו והושוו על בסיס מהירות התהליך והתפוקה, ואיכות המוצר הסופי והפונקציונליות.

<table><tbody><tr><td>תמצית שמרים</td><td>סיגמא</td><td>Y1333</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>למדיום</td><td>TRP03</td><td></td></tr><tr><td>אגר כיתה בקטריולוגית</td><td>Applichem</td><td>A0949</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM בינוני</td><td>Gibco</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>גרייס' s Insect Medium, ללא תוסף</td><td>Gibco</td><td>11595-030</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td></td></tr><tr><td>MS בינוני כולל ויטמינים</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>אגר צמחים</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin נתרן</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>A0104</td><td></td></tr><tr><td>גנטמיצין סולפט</td> רעיל <td>Duchefa Biochemie</td><td>G0124</td><td></td></tr><tr><td>גנציקלוביר</td><td>אינוויטרוגן</td><td>רעיל I2562-023</td><td></td></tr><tr><td>קרבניצילין דיסודיום</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0109</td><td>רעיל</td></tr><tr><td>קנמיצין סולפט</td><td>Sigma</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>ריפמפיצין</td> רעיל <td>Duchefa Biochemie</td><td>R0146</td><td>רעיל & ndash; מלאי 25 מ"ג/מ"ל ב-DMSO</td></tr><tr><td>סטרפטומיצין סולפט</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0148</td><td></td></tr><tr><td>ספקטינומיצין דיהידרוכלוריד</td><td>רעיל Duchefa Biochemie</td><td>S0188</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropil-&beta;-D-1-tiogalattopiranoside)</td> <td>Sigma</td><td>I5502</td><td>הידרט</td></tr><tr><td>MES</td> רעיל <td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2Biochemical</td><td></td><td>436994U</td><td></td></tr><tr><td>אצטוסירינגון</td><td>סיגמא</td><td>D134406</td><td>רעיל &ndash; מלאי 0.1 מ' במזרק DMSO</td></tr><tr><td>(1 מ"ל)</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>fluka</td><td>63136</td><td></td></tr><tr><td>BAP (6-Benzylaminopurine)</td><td>Sigma</td><td>B3408</td><td>NAA רעיל</td></tr><tr><td>(חומצה אצטית נפטלן)</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>N0903</td><td></td></tr><tr><td>מגרה Cefotaxime</td><td>Mylan Generics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בסיס Trizma</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>התאם את ה-pH עם 1 N HCl כדי להפוך את Tris-HCl buffer</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td>Corrosive</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>1 M מלאי</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td> אוריאה <td>קורוזיבית, רעילה</td></tr><tr><td></td><td></td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-מרקפטואתנול</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>רעיל</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol)</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td>Toxic &ndash; מלאי 1M, יש לאחסן ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C1374</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז צמחי</td> רעיל <td>Sigma</td><td>P9599</td><td>אין להקפיא/להפשיר יותר מדי פעמים</td></tr><tr><td>SDS (נתרן דודציל סולפט)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>דליק, רעיל, קורוזיבי &ndash; 10%</td></tr><tr><td>מלאי גליצרול</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>כחול מבריק R-250</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>סיגמא</td><td>24137</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td> דליקה <td>סיגמא</td><td>27221</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אנטי-גלוטמית קורוזיבית דקרבוקסילאז 65/67</td><td>סיגמא</td><td>G5163</td><td>אין להקפיא/להפשיר יותר מדי פעמים</td></tr> חזרת <tr><td>פרוקסידאז (HRP) - נוגדן מצומד נגד ארנב</td><td>סיגמא</td><td>A6154</td><td>אין להקפיא/להפשיר יותר מדי פעמים</td></tr><tr><td>חיי תאי Sf9</td><td> טכנולוגיות</td><td>11496</td><td></td></tr><tr><td>BL21 מוכשר E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2530H</td><td></td></tr><tr><td>חלבון A Sepharose</td><td>Sigma</td><td>P2545</td><td></td></tr><tr><td>לוחות תרבית תאים</td><td>Sigma</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקה חיסונית רדיו</td><td>Techno Genetics</td><td>12650805</td><td>חומר רדיואקטיבי</td></tr></tbody></table>

ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בbiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

מערכות המבוסס על צמח נחשבות פלטפורמה חשובה לייצור חלבונים רקומביננטיים כתוצאה מהפוטנציאל המתועד היטב שלהם לייצור בעלות נמוכה הגמישה, באיכות גבוהה, מוצרים ביו-אקטיביים. במחקר זה, השווינו את הביטוי של חלבון רקומביננטי אנושי יעד בתרבויות מסורתיות מבוסס פרמנטור תא (חיידקים וחרקים) עם מערכות ביטוי על בסיס צמחי, שני חולפות ויציבים. עבור כל פלטפורמה, שתארנו את הסט-אפ, הייעול ואורכו של תהליך הייצור, איכות המוצר הסופית ותשואות והערכנו את עלויות ייצור זמניות, ספציפיות לחלבון רקומביננטי היעד שנבחר. בסך הכל, התוצאות שלנו מצביעות על כך שחיידקים אינם מתאימים לייצור של חלבון המטרה בשל ההצטברות שלה בתוך גוף הכללה מסיס. מצד השני, מערכות המבוסס על צמח הם לא פלטפורמות רב-תכליתיותכובע מאפשר הייצור של החלבון שנבחר בעלויות נמוכות יותר מאשר baculovirus / מערכת תא חרק. בפרט, קווים מהונדסים יציבים מוצג הגבוהה ביותר התשואה של המוצר הסופי וצמחים להביע חולפים פיתוח התהליך המהיר ביותר. עם זאת, לא כל החלבונים רקומביננטי עשויים להפיק תועלת ממערכות המבוסס על צמח אבל פלטפורמת ההפקה הטובה ביותר צריכה להיקבע באופן אמפירי עם גישת מקרה ומקרה, כפי שמתוארת כאן.

עיצוב ניסיוני לביטוי Heterologous של חלבון רקומביננטי יעד במערכות ייצור שונים מתואר כאן. המוקד הראשון היה ההגדרה של הפלטפורמות השונות על ידי הקמת התנאים אופטימליים לביטוי של חלבון המטרה בכל מערכת. הביטוי של חלבון המטרה, hGAD65mut, היה מושרה בE. השלושה עותקים תרבויות coli. בעקבות 3 שעות של ביטוי על 37 מעלות צלזיוס, תאי חיידקיים נאספו על ידי צנטריפוגה ו lysed ידי sonication. לאחר צעד צנטריפוגה, חל...

במחקר זה הושווה ביטוי של חלבון רקומביננטי אנושי מטרה בפלטפורמות ייצור שונות. התמקדנו בתרבויות מסורתיות מבוססות תסיסה ובצמחים, תיארנו את ההגדרה של כל מערכת והדגשנו, על בסיס התוצאות המדווחות, את המגבלות והיתרונות הגלומים בכל פלטפורמה.

ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

a-comparative-analysis-recombinant-protein-expression-different

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בעידן שאחרי האדם הגנומיקה, הזמינות של חלבונים רקומביננטיים של תצורות המקומיים הוא חיוני למחקר מבנית, תפקודית טיפולית ופיתוח. כאן אנו מתארים מבחן רחב היקף של ביטוי חלבונים מערכת עובריים אנושיים לתאי כליה 293T, שניתן להשתמש בהם כדי לייצר מגוון של חלבונים רקומביננטיים.

פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

צמחים מציעים מערכת חדשנית לייצור של חלבוני תרופות בהיקף מסחרי, כי הוא יותר ניתן להרחבה, יעיל וחסכונית ובטוחה יותר מפרדיגמות ביטוי הנוכחיות. במחקר זה, אנו מדווחים גישה פשוטה ונוחה, אך ניתן להרחבה להציג את היעד של גן...

Agroinfiltration היעילה של צמחים לביטוי חולף ברמה גבוהה של חלבונים רקומביננטי

יש לפתח חלבוני היתוך biotinylatable יישומים פוטנציאליים רבים בתחומים שונים של מחקר. הנדסת חלבון רקומביננטי היא הליך ישר קדימה כי הוא חסכוני, המספק תשואות גבוהות של חלבונים מותאמים במיוחד.

ביטוי, בידוד וטיהור של מסיס ובלתי מסיסים חלבונים Biotinylated להתחדשות רקמת עצב

ביטוי חלבונים רקומביננטיים על ידי מערכות יונקים הופך לשיטה אטרקטיבית לייצור קומפלקסים של חלבונים לביולוגיה מבנית. כאן אנו מציגים מערכת ביטוי פשוטה אך יעילה ביותר המשתמשת בתאי יונקים שגדלו בתרחיף לטיהור קומפלקסים של חלבונים למחקרים מבניים.

ביטוי חלבון רקומביננטי לביולוגיה מבנית בתאי ההשעיה HEK 293F: רומן וגישה נגישה

ביטוי משותף של חלבונים הוא אלטרנטיבה רבת עוצמה לבנייה מחדש במבחנה של קומפלקסים של חלבונים, והוא מסייע בביצוע בדיקות ביוכימיות וגנטיות in vivo. כאן אנו מדווחים על השימוש בביטוי משותף של חלבונים ב-Escherichia coli כדי להשיג קומפלקסים של חלבונים, ולכוונן את תדירות המוטציות של התאים.

תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב<em&gt; Coli Escherichia</em

ייצור בקנה מידה מעבדתי של חלבונים אוקריוטיים עם שינוי מתאים לאחר התרגום מייצג מחסום משמעותי. להלן פרוטוקול חזק עם התבססות מהירה ותפנית לביטוי חלבון באמצעות מערכת ביטוי יונקים. מערכת זו תומכת בחומצות אמינו סלקטיביות, תיוג סלקטיבי של חלבונים ומודולטורים של מולקולות קטנות של הרכב הגליקן.

ביטוי תשואה גבוהה של חלבונים אנושיים רקומביננטי עם transfection חולף של תאי HEK293 בהשעיה

מערכות Nonlytic ביטוי תא חרקים הם מנוצלים לייצור, סחר / לוקליזציה הסלולר, וניתוח פונקציונלי חלבון רקומביננטי. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת וקטורי ביטוי והבעת חלבון חולפת עוקבת בשורות תא פרפראים זמינות מסחרי. שיתוף הלוקליזציה של aquaporins tabaci Bemisia עם חלבונים בסמן פלורסנטי התת-תאי מוצגת גם.

ביטוי חולף ואת סלולר לוקליזציה של חלבונים רקומביננטי תאים בתרבית חרקים

כתב יד זה מתאר גישה כללית לעיצוב בהתאמה אישית של טיפוח מיקרוביאלי מדיה. זה מופעל על-ידי זרימת עבודה איטרטיבי שילוב Kriging ניסיוני microbioreactor ועיצוב טכנולוגיה מבוססת על תפוקת טיפוח מספיקות, אשר נתמך על ידי מעבדת רובוטיקה כדי לשפר את האמינות ואת מהירות בנוזל טיפול מדיה הכנה.

פרוטוקול גנרי עבור אופטימיזציה של ייצור החלבון Heterologous באמצעות טכנולוגיית Microbioreactor אוטומטיות

פרוטוקול זה מתאר חום חלבון הנוצרות על-ידי הלם ביטוי מערכת (pDHsp/V5-שלו/sf9 תא מערכת), אשר יכול לשמש עבור המבטאים חלבונים זרים או הערכת אנטי-אפופטוטיים להיפגע הפעילות של חלבונים זרים פוטנציאליים ו שלהם קטום אמינו חומצות בתאי חרקים.

הביטוי ארעית של גנים זרים בתאי חרקים (sf9) עבור שיטת פונקציונלי

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים עבור ניצול של חרקים תא baculovirus חלבון ביטוי ומערכת לייצר כמויות גדולות של חלבונים צמח מופרש על התגבשות חלבון. וקטור ביטוי baculovirus השתנה עם GP67 או hemolin חרקים פפטיד אות לביטוי הפרשת חלבון צמחי בתאי חרקים.

שינוי Baculovirus וקטורים ביטוי לייצר מופרש צמח חלבונים בתאי חרקים

מערכת וקטור הביטוי של baculovirus (BEVS) היא פלטפורמה איתנה להקרנת ביטוי וייצור של חלבון ארגינין מתילטרנספראזים (PRMTs) שישמשו למחקרים ביוכימיים, ביופיזיים ומבניים. כמויות מיליגרם של חומר יכול להיות מיוצר עבור רוב PRMTs וחלבונים אחרים של עניין הדורש פלטפורמת ביטוי eukaryotic.

ייצור חלבוני PRMT רקומביננטיים באמצעות מערכת וקטור הביטוי של Baculovirus

חקור השוואת ביטוי חלבון רקומביננטי אנושי בפלטפורמות ייצור שונות: תרביות מותססות ומערכות צמחיות. למד את היתרונות והמגבלות של כל שיטה לייעול תהליכי ייצור.

ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות

גלה סרטונים נוספים