Name: הדמיה שני פוטונים של תאיים Ca 2 + תאי טיפול ותחמוצת חנקן ייצור בהאנדותל ושריר חלק של עכברוש אב העורקים מבודדים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: למדו מדידת רמות סידן וחנקן חד-חמצני בתאי אנדותל ושריר חלק של כלי דם מבודדים בעכברוש באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תגובות תאיות לגירויים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד&quot;ר ויליאם Cashdollar, ומרכז קרן ההדמיה נורת&#39;ווסטרן ההדדית בדם מכון המחקר של ויסקונסין לעזרה עם בדיקות ההדמיה. כמו כן, אנו מודים לד&quot;ר דריה Ilatovskaya לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה ודיון מועיל. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומי לבריאות מענקי HL108880 (לAS) וDP2-OD008396 (לAMG).

הפרוצדורות המתוארות להלן אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) בבית הספר לרפואה של ויסקונסין והיו בהתאם למכונים הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. 1. בידוד של אב העורקים העכברוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חולדות עם isoflurane (אינדוקציה 5%, 1.5 עד 2.5% אחזקה) או אחר IACUC אושר שיטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החולדה במצב שכיבה. על מנת לחשוף את אברי הבטן, לעשות חתך קו האמצע הגחון קטן דרך העור והרקמה התת עורית הבטן. פדה גזת שימוש בעדינות להסיט את המעיים לחשוף את הווריד נבוב אב העורקים וכפי שמוצג באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, בוטה לנתח את אב העורקים מרקמת חיבור ומהווריד הנבוב. באמצעות תפר, לקשור את אב העורקים הקרובים ככל האפשר לכליות. לנתח על 1 - 2 סנטימטר של אב העורקים ולמקם אותו בחרוטי 15 מיליליטר ט&quot;ולהיות מכילים פיזיולוגית נורמלי תמיסת מלח (PSS; מ&quot;מ: 140 NaCl, 1.2 MgCl 2, 2 CaCl 2, 4.5 KCl, 6 גלוקוז, 10 HEPES) על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהאב העורקים מבודדים, להרדימו על פי פרוטוקולי IACUC אושרו. בסיום כל הלא-הישרדות נהלים להרדים בעלי חיים עמוקים מורדמים על ידי פתיחת בית החזה וגורם pneumothorax כדי להבטיח את מותו האנושי של בעלי החיים. 3 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה, הטה בסדר-מלקחיים, וmicroscissors לנתח את השומן ורקמת חיבור משל אב העורקים. ברגע שהאב העורקים הוא נקי, לחתוך את אב העורקים longitudinally ולמקם אותו בPSS על קרח לשימוש מאוחר יותר. </li></ol> 2. טעינת צבע ודגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 7 μl של 1 מ&quot;מ צבע AM Fluo-4, אשר מסופק בפתרון המבוסס על DMSO, לתוך צינורות בודדים μl 500 שכבר מכוסים בנייר אלומיניום. אחסן במקפיא ב -20 מעלות כדי לשמר את מאפייני הצבע לאורך זמן. הערה: אלה aliquoted כךlutions צריך להיות יציב במשך לפחות שישה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש, מאפשר פתרונות הצבע להתחמם לRT לפני הפתיחה. הכן את הפתרונות לעבוד מייד לפני השימוש. אין לאחסן מגיב המדולל לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 7 μl של Fluo-4 צבע מוכן 1 מ&quot;מ AM המומס בתמיסת DMSO 450 ul של PSS המכיל סידן לא. הוסף 40 μl של 10% פתרון pluronic חומצה שאינה מבוסס DMSO לקוקטייל הטעינה כדי לעזור לפזר את acetoxymethyl אסטרים (בבוקר) ולשפר את הטעינה של צבע סידן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את aortas גזור לתוך 500 צינורות μl מכילים קוקטייל הטעינה (כמתואר ב2.3) עבור h 1. לכסות את כל הצינורות בנייר כסף ומניחים על שייקר מסתובב בRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח על ייצור NO בכלי הדם, להשתמש צבע diacetate DAF-FM. דגירה אב העורקים בתמיסה המכילה 450 PSS μl, חומצת pluronic 40 μl ו -5 μl של 10 מ&quot;מ diacetate DAF-FM. בדומה לפרוטוקול הדגירה סידן (שתואר ב2.3), למקם את אב העורקיםבצינור 500 μl מכיל את פתרון NO-הצבע מכוסה בנייר הכסף ומניחים על שייקר מסתובב במשך 30 דקות ב 4 C ואחרי 30 דקות הבאות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אין ייצור נמדד, להשתמש באנדותל אין חוסם synthase, L-שם, כדי לחסום ייצור NO כשליטה כפי שמוצג באיור 4. להליך זה, להוסיף לקוקטייל (כפי שתואר על 2.5) L-שם 100 ננומטר במשך 30 דקות האחרונות של דגירה (ב RT). </li></ol> 3. פרוטוקול מיקרוסקופית פוטון סריקת לייזר שני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 1 שעות, לשטוף את אב העורקים 2 - 3 פעמים בPSS הנקי כדי להסיר צבע תאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את אב העורקים לצלחת מצופה סיליקון המכילה גם PSS הרגיל או 2 + חיץ Ca -חינם (תלוי בפרוטוקול הניסוי). הצמד את אב העורקים מטה אל ציפוי סיליקון עם adventitia במגע עם סיליקון (כלומר, לומן האנדותל נחשף לפתיחת המנה) באמצעות סיכות בצורת μ. לחלופין, להשתמש בעוגן Sliceרשת או דבק כדי לתקן את הרקמה. הערה: כדי להפחית את הלחץ וחפצים מכאניים אפשריים, העברה ולתקן אב העורקים בCa 2 + -חינם פתרון ולחכות 5-10 דקות לפני תחילת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר משאבת peristaltic או מזרק לצלחת מצופה סיליקון ליישום אוטומטי או ידני של תרופות או לשינוי הפתרון תאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת מתחת לפיסת מיקרוסקופ שני הפוטונים הזקוף האף, ולהתקין ולמקם 25 × (NA 1.05 ומרחק 2 מ&quot;מ עובד) עדשה אובייקטיבית מים טבילה מעל הדגימה. הערה: אם עדשה ספציפית זה אינה זמינה, להשתמש אובייקטיבי במיוחד מיוצר עבור שתי הדמיה פוטון, כי זה יכול להגדיל באופן דרמטי את הרזולוציה אות לעומת אובייקטיבי רגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את לייזר שני פוטונים באמצעות התוכנה (הלייזר מתחיל לשאוב ולהדליק). מנגינת עירור הלייזר 820 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות epifluorescence, לאתר את אב העורקים ולהתמקד במטרה במשטח האנדותל באמצעות התאמה גסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור מיקרוסקופ למצב סריקת לייזר שני פוטונים, על מנת להבטיח כי לייזר עירור מצב נעול, הגלאים-descanned אינם עוסקים ומסנני הפליטה מתאימים לספקטרום הפליטה הצפוי מותקנים. שים לב: כאן, FV10-MRL / R (495-540 ננומטר) היו בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל סריקה חי באמצעות כ 5% כוח לייזר ודק למקד את המטרה כדי להמחיש את תאי האנדותל. הערה: תאי האנדותל יציגו אות ניאון חזקה כאשר מודגרות בPSS הנורמלי. זה יהיה ניכר חלש כאשר כלי מודגרת במאגר ללא סידן. תאי האנדותל יהיו נוכחים בחלק העליון של אב העורקים נפתחו וניתן לראות את תאי שריר חלק, ממש מתחת לתאי האנדותל (ראה איור 2). בגלל כלי דם הם לא חלקים ואפילו לא, יהיו מקומות שבם שני תאי שריר חלק ותאי האנדותל קיימים. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהתאים הם בפוקוס, תכנית תוכנת מיקרוסקופ כדי לאסוף תמונות רציפות במצב סריקה מהיר (סריקת סריקה, 512 x 512 פיקסלים עם חלון תדירות אוסף מסגרת של 1.1 ים). במקביל לFluo-4 הקרינה בבוקר, לאסוף מועבר תמונות אור כדי לזהות שינויים בהתכווצות כלי דם וטוב יותר לחזות את תנאי הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי האוסף של תמונות אות בסיסיות, לשנות את ריכוז יון Ca 2 + בפתרון החיצוני או לאט תחול סוכני גירוי תרופתיים באמצעות משאבת peristaltic תוך הדמיה. שים לב לעליית אות הניאון בתוך התאים הטעונים. הערה: תאי האנדותל להגיב לשינויים בזרימה, ובכך מומלץ להשתמש ביישומים למינרית נמוכים ובדיקת רכב לפני היישום של מפעילים תרופתיים של Ca 2 + או אין איתות. כדי לחשב מחדש סידן תוך תאי לערכי ריכוז ננומטר בכלי עמוסים Fluo-4 (קבוע דיסוציאציה לFluo-4 אנישל 345 ננומטר), עוצמת הקרינה יכולה להיות מוקלטת בתחילת מחקר ולאחר תוספת של ionomycin וMnCl 2. 4 </li></ol> 4. עיבוד תמונה וחישובים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוריד ולהתקין את חבילת פיג&#39;י עיבוד תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ התמונה בפיג&#39;י. על יבוא הקובץ, לפצל את הערוצים (אור מועבר ואות ניאון) כאשר תתבקשו לעשות זאת. השתמש באות הניאון רק לניתוח נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במסגרת תכנית פיג&#39;י, לחץ על הכרטיסייה לנתח ולגלול למטה לאפשרות הכלים. תחת אפשרות הכלים, למצוא את הכרטיסייה שאומרת מנהל החזר על השקעה ולחץ עליו; חלון חדש יופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי זה, לחץ על מדידות סט תחת הלשונית לנתח. בחר את המדידות הספציפיות של עניין. למדידות חולפות סידן, להשתמש באפשרות הערך האפור הממוצעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם כלי העקבות המעגלי, מתחיל לעקוב אחר האזורים של עניין (ROI) ולחץ על &quot;הוסף&quot; על מסך מנהל החזר על השקעה עבור כל ROI. ברגע שכל התאים של עניין כבר איתרו, בחלון מנהל ROI, בחר מדוד רב תחת הלשונית &quot;יותר&quot;. זכור גם לשמור את המדידות ישירות או להעתיק ולהדביק את כל מדידות אלה לגיליון אלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> * להרחיב קובץ txt או גיליון אלקטרוני Excel מפיג&#39;י ולהעביר את המספרים לגיליון מקור חדש. הערה: לחלופין, להשתמש בכל תכנית כמו מגרש סיגמא או פריזמה לניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במסגרת תכנית מקור, השתמש מגרש → תפריט הקו + סמל להתבונן סקירה של כל התגובות חולפות. בטל את התאים מגיבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב מחדש מספר עקבות להיקף זמן (ציר X), להשתמש בערכי עמודת טור → הגדר ולהכפיל את מספר עמודת עקבות לתדר אוסף תמונה (במקרה שלנו 1.1s). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סטטיסטיקת → ניתוח בשורות לכל הקלטות שנבחרו לחישוב ממוצע (ציר Y) ועקבות שגיאת תקן. מגרש גרף סופי לקבוצה הנוכחית של תאי מגרש → קו + הסמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאהn חישוב חולף סידן מתואר כאחריו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרור סידן הכולל בתוך תכנית מקור, לחץ על גרף, ולאחר מכן להשתמש בתפריט ניתוח → חדו&quot;א → שלב. נפרד כולל של אזור תחת עקומה מופיע בתוצאה התחבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקינטיקה החולפת, לחץ על גרף, ולאחר מכן להשתמש בתפריט: Curve ניתוח → ללא יניארי Fit → בחר נתונים סט (לבחור ציר X נע בין מקסימום לסוף תגובת מעבר). התחל התאמת → בחר פונקצית → מעריכי Decay 1 → בוצע. הערה: מתאים מעריכי מופיע בחלון גרף ותוצאה התחבר. הנתונים שהתקבלו (ערכים) מייצגים סכום כולל של סידן שוחרר, וקינטיקה של ערוצי תיווך תגובת המעבר. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+2-photon+microscopy+to+understand+albuminuria%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Am.+Clin.+Climatol.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Using 2-photon microscopy to understand albuminuria.</a> Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).</li>
<li>Burford, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+podocyte+calcium+in+glomerular+injury+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease.</a> J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).</li>
<li>Palygin, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+electrochemical+detection+of+ATP+and+H%282%29O%282%29+release+in+freshly+isolated+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).</li>
<li>Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIlatovskaya%2C+DV+%22J+Vis.+Exp%22">J Vis. Exp</a>. In Press, (2015).</li>
<li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+superoxide+and+angiotensin+II+suppression+in+salt-induced+changes+in+endothelial+Ca2%2B+signaling+and+NO+production+in+rat+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).</li>
<li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+Plekha7+attenuates+salt-sensitive+hypertension+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).</li>
<li>Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+gradients+in+single+smooth+muscle+cells+revealed+by+the+digital+imaging+microscope+using+Fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2.</a> Nature. 318, 558-561 (1985).</li>
<li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elastin+network%3A+its+relationship+with+collagen+and+cells+in+articular+cartilage+as+visualized+by+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy.</a> J. Anat. 215, 682-691 (2009).</li>
<li>Sathanoori, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+modulates+endothelial+KLF2+through+activation+of+P2X4%5BTitle%5D)+AND+%22Purinergic+Signal%22%5BJournal%5D)">Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4.</a> Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).</li>
<li>Hall, A. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Multiphoton+Microscopy%3A+Focusing+Light+on+Acute+Kidney+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury.</a> Physiology. 29, 334-342 (2014).</li>
<li>Campese, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt+sensitivity+in+hypertension.+Renal+and+cardiovascular+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications.</a> Hypertension. 23, 531-550 (1994).</li>
<li>Cowley, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+nongenetic+determinants+of+salt+sensitivity+and+blood+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure.</a> Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).</li>
<li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hypertension+susceptibility+loci+on+rat+chromosome+12%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12.</a> Hypertension. 60, 942-948 (2012).</li>
<li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+multiple+causative+genes+at+a+single+GWAS+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus.</a> Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).</li>
<li>Mattson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mutation+of+recombination+activating+gene+1+in+Dahl+salt-sensitive+rats+attenuates+hypertension+and+renal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).</li>
<li>Rudemiller, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD247+modulates+blood+pressure+by+altering+T-lymphocyte+infiltration+in+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney.</a> Hypertension. 63, 559-564 (2014).</li>
<li>Flister, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXM+-+a+new+tool+for+mapping+breast+cancer+risk+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment.</a> Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).</li>
</ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הסקירה ניסיונית. כדי להבין טובה יותר את התרומה של סידן ולא לפיזיולוגיה של כלי דם, שיטה חדשה שפותחה למדידה [Ca 2 +] אני ולא בתוך שריר חלק ותאי האנדותל של aortas שלם המבודד. יחד, פרוטוקול זה מורכב משלבים הבאים קריטיים: 1) בידוד והכנה מכאני (עיכול לא האנזימטית) של כלי השיט. חשוב לשמור על הרקמה בריאה ושלמים ככל האפשר כדי להשיג הקלטות פיסיולוגיות אופטימליות. 2) דגירה בצבע סידן תיוג או NO-תיוג צבע עם חומצת pluronic הוא קריטי, לעומת זאת, עבור סוגים מסוימים ...

סידן הוא שליח שני יסודי בתוך תאי כלי דם כגון אנדותל ותאי שריר חלק. זה הגירוי העיקרי להתכווצות כלי דם ומשחק תפקיד מרכזי בהתרחבות כלי דם, כולל ההשפעות שלה שלא בדור בתוך האנדותל. בשל מגבלות של טכנולוגיות הדמיה, זה כבר כמעט בלתי אפשרי להתבונן טיפול סידן בתוך הכלי שלם. הפיתוח של שתי מערכות הדמיה פוטון ויצירת סידן חדש או NO צבעי תיוג, מאפשר תמונה בעומק ורזולוציה מספיק כדי להתחיל להבין את דינמיקת סידן וייצור NO בתוך כלי הדם. לאחרונה מיקרוסקופ שני פוטונים יושם ברקמות, איברים ומחקרים בבעלי חיים גם כל בגלל היכולת מעולה שלו לחדור לעומק רקמות עם הקרינה רקע נמוכה ורגישות גבוהה אות. 1,2 הספקטרום הצר של שני עירור הפוטון בIlluminatמוקד היון והשימוש בגלאים-descanned הלא הם הסיבות מדוע שתי מיקרוסקופיה הפוטון היא מעולה למיקרוסקופיה confocal המסורתית. מיקרוסקופיה confocal לא יכולה לייצר תמונות באיכות גבוהה בעומק הרקמה ההכרחי בשל אוטומטי הקרינה והפיזור של אור מחוץ למוקד לחריר confocal. כתוצאה מכך, פיתחנו שיטה באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים למדוד [Ca 2 +] אני איתות וייצור NO בתאים שלמים, פרט כלי דם עם רזולוציה גבוהה ויחס אות לרעש נמוך.

<table><tbody><tr><td>DAF-FM</td><td>Life Technologies</td><td>D-23842</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F14217</td><td>500 ומיקרו; l בתמיסת DMSO</td></tr><tr><td>Pluronic F-68</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556</td><td></td></tr><tr><td>L-NAME</td><td>Tocris</td><td>0665</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ זקוף אולימפוס</td><td></td><td>Olympus Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai HP DeepSee-OL&nbsp;</td><td>ספקטרה פיזיקה</td><td></td><td>Ti: לייזר ספיר 690 ננומטר &mdash; מסנני 1040 ננומטר</td></tr><tr><td></td><td>אולימפוס</td><td>FV10-MRL/R&nbsp;</td><td>495 עד 540 ננומטר&nbsp;</td></tr><tr><td>25&times; עדשת אובייקטיבית טבילה במים</td><td>אולימפוס</td><td>XLPL25XWMP</td><td>NA 1.05 ומרחק עבודה 2 מ"מ</td></tr><tr><td>רשת עוגן פרוסה&nbsp;</td><td>וורנר אינסטרומנט&nbsp;</td><td>SHD-27LH</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנטים בסיסיים אחרים&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה שני פוטונים של תאיים ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; תאי טיפול ותחמוצת חנקן ייצור בהאנדותל ושריר חלק של עכברוש אב העורקים מבודדים

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

סידן הוא רגולטור חשוב מאוד של תהליכים פיסיולוגיים רבים ברקמות כלי דם. רוב פונקציות אנדותל ושריר החלק תלויות במידה רבה בשינויים בסידן תוך תאי ([Ca 2 +] i) ותחמוצת חנקן (NO). על מנת להבין כיצד [Ca 2 +] אני, לא ומולקולות במורד הזרם מטופלות על ידי כלי דם בתגובה לvasoconstrictors ומרחיבי כלי דם, שפיתחנו שיטה חדשנית שחלה בסידן תיוג (או אי-תיוג) צובע עם שתי מיקרוסקופיה הפוטון כדי למדוד טיפול סידן (או ייצור NO) בכלי דם בודדים. שתואר כאן הוא הליך צעד-אחר-צעד מפורט המדגים איך לבודד את אב העורקים מעכברוש, סידן תווית או NO בתאי האנדותל או שריר חלק, וסידן תמונה ארעיים (או ייצור NO) באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים הבאים פיסיולוגי או גירויים תרופתיים. היתרונות של שימוש בשיטה הנן רב-פי: 1) זה אפשרי בו זמניתly למדוד ארעיים סידן בשני תאים אנדותל ותאי שריר חלק בתגובה לגירויים שונים; 2) זה מאפשר לתאי האנדותל תמונה ותאי שריר חלק בהגדרה האם שלהם; 3) בשיטה זו היא רגישה מאוד לסידן תוך תאי או ללא שינויים ומייצר תמונות ברזולוציה גבוהות למדידות מדויקות; ו -4 גישה מתוארת) יכולה להיות מיושמת למדידה של מולקולות אחרות, כגון מיני חמצן תגובתי. לסיכום, יישום של מיקרוסקופיה פליטת לייזר שני פוטונים כדי לפקח ארעיים סידן ואין ייצור בתאי האנדותל ושריר החלק של כלי דם בודדים סיפק נתונים כמותיים באיכות גבוהה וקידם את ההבנה של מנגנוני ויסות תפקוד כלי דם שלנו.

על מנת להעריך את התרומה של סידן לפיזיולוגיה של כלי דם (התרחבות והתכווצות כלי דם) בצורה מדויקת, פרוטוקול נועד לטעון צבעי סידן לשני תאי האנדותל ותאי שריר חלק בaortae שלם המבודד. הניסיוני הכללי להגדיר מתואר באיור 1, מציג את האסטרטגיה הבסיסית לבידוד והכנה של כלי השיט לפני ההדמיה. בקצרה, לאחר הבידוד של אב העורקים מהחולדה, יש לנקות שומן ורקמת חיבור ושיסף את אורכים. אב העורקים נפתחו אז צריכים להיות ממוקם ב500 צינור μl המכוסה בנייר כסף המכיל קוקטייל הטעינה מוכן לפני כמתוא...

תפקוד תאי כלי הדם תלוי בפעילות של שליחים תוך-תאיים. מתוארת כאן שיטת הדמיית שני פוטונים ex vivo המאפשרת מדידה של רמות סידן ותחמוצת החנקן התוך תאיות בתגובה לגירויים פיזיולוגיים ופרמקולוגיים בתאי אנדותל ושריר חלק בודדים של אבי העורקים המבודד.

הדמיה שני פוטונים של תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; תאי טיפול ותחמוצת חנקן ייצור בהאנדותל ושריר חלק של עכברוש אב העורקים מבודדים

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד סידן או חנקן חמצני בכלי דם שבודד זה עתה באמצעות מיקרוסקופיית פוטונים כפולה. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד מכני והכנה של כלי הדם. לאחר מכן, כלי הדם מדגיר בצבע לסימון סידן או בצבע לסימון O עם onic acid.לאחר מכן, הכלי מקובע למנה coated בסיליקון באמצעות רשת וסיכות כדי להבטיח תצפית יציבה במהלך הדמיית דו-פוטון. לבסוף, מבוצעת הדמיית דו-פוטון והתוצאות נמדדות כמותית. סרטון זה מראה עלייה באותות סיגנלינג של סידן תוך-תאי בתאי אנדותל של כלי דם מבודדים בתגובה לשינויים בריכוז הסידן החוץ-תאי.בסופו של דבר, שיטה זו תאפשר לחוקרים לנטר שינויים בריכוז הסידן או בחנקן תחמוצת בתאי אנדותל או בתאי שריר חלק של כלי דם שבודד acabado. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מספקת רזולוציית אות טובה יותר ומדידות מדויקות של תהליכים תוך-תאיים ברקמות כלי דם. כאן, טכנולוגיה זו יושמה בשילוב עם קוביות קלאסיות, ולא גיאומטריות, כדי למדוד תנודות בסידן וייצור חנקן תחמוצת בתאים בודדים על גבי איבר חלול מבודד.אנו מאמינים שטכניקה זו תסייע בקידום הידע שלנו לגבי המנגנון המווסת את רמות הסידן והחמצן התוך-תאיים בתוך סוגי תאי כלי דם שונים. דימות במיקרוסקופיית עירור פוטון כפול של תאים חיים, במיוחד ברקמות שלמות כגון כלי דם, מספק את היתרונות של אות ברזולוציה גבוהה ופלואורסצנציית רקע נמוכה מחוץ למיקוד. הלוקליזציה הצרה של עירור הפוטון הכפול מאירה נפח מוקד בודד ברקמה, מפחיתה משמעותית את הבליעה מחוץ למיקוד ומקטינה את פיזור האור, מה שמאפשר לנו לדמות דינמיקה של פלואורופורים ברקמות בעלות אוטופלואורסצנציה גבוהה המכילות סיבי קולגן ואלסטין.לאחר בידוד אורטה של חולדה, בהתאם לפרוטוקול הטקסט תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמשו בפינצטה בעלת קצה דק ובמספרי מיקרו כדי להסיר את השומן ורקמת החיבור מהאורטה. לאחר ניקוי האיבר, חתכו אותו לאורכו והעבירו אותו לתמיסת מלח פיזיולוגית לשימוש מאוחר יותר. להכנת תמיסת הטעינה, הוסיפו 7 µL של תמיסת צבע Fluo-4 AM בריכוז 1 mM ב-DMSO ל-450 µL של PSS ללא סידן.לאחר מכן, הוסיפו 40 µL של תמיסת 10%onic acid שאינה מבוססת DMSO לתערובת הטעינה כדי לסייע בפיזור האסטרים של אצטיל מתיל ולשפר את טעינת צבע הסידן. העבירו את אביונים המבודדים לתוך מבחנות של 500 µL המכילות את תערובת הטעינה. כסו את המבחנות בנייר אלומיניום והניחו אותן על שייקר מסתובב בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.לאחר ביצוע הפרוטוקול הכתוב לקיבוע רקמת האורטה למשטח של צלחת מצופה סיליקון, הניחו את הצלחת תחת ראש המיקרוסקופ של מיקרוסקופ דו-פוטוני אנכי, והתקינו ומיקמו עדשה אובייקטיבית עם הגדלה של 25x לטבילה במים מעל הדגימה. התקינו מסנן פליטה תואם בפתח המיקרוסקופ. באמצעות התוכנה, הפעילו את לייזר האינפרא-אדום הדו-פוטוני וכוונו את עירור הלייזר ל-820 ננומטר תחת אור תמסור. באמצעות כיוונון גס של האובייקטיב, אתרו את האורטה ומקדו את האובייקטיב על פני השטח של האנדותל.העבירו את המיקרוסקופ למצב סריקה בלייזר פוטונים כפולים (two photon laser scanning), וודאו שלייזר העירור נמצא במצב נעילה של המוד (mode locked). הגדירו את הגלאים הסורקים שאינם DS בעוצמת לייזר של כ-5% עד 10%. התחילו בסריקה חיה.ולבסוף, כוון את העדשה כדי להביא את תאי האנדותל או תאי השריר החלק למיקוד. אסוף תמונות רצופות בהתאם לטקסט של הפרוטוקול הניסויי. שמור את התמונות בפורמט הכולל את המטא-דאטה לצורך ביצוע עיבוד תמונות וחישובים; הורד והתקן את חבילת עיבוד התמונות Fiji, המשוחררת תחת רישיון GPL.בעזרת התוכנה, פתחו קובץ תמונה. לאחר מכן, כאשר תתבקשו לכך, הפרידו בין הערוץ של האור המועבר לערוצים הפלואורסצנטיים, כדי להשתמש בערוצים הפלואורסצנטיים בלבד לצורך ניתוח הנתונים בתוכנת Fiji. לחצו על לשונית הניתוח (analyze) וגללו מטה לאפשרות הכלים (tools).לאחר מכן לחצו על לשונית ROI manager, וחלון חדש יופיע. בשלב הבא, תחת לשונית analyze, לחצו על set measurements ובחרו את המדידות הספציפיות הרלוונטיות. עבור מדידות ה-calcium transient.השתמש באפשרות mean gray value. לאחר מכן, באמצעות כלי ה-circular trace, התחל לסמן את אזורי העניין (ROI), ובמנהל ה-ROI (ROI manager) לחץ על add עבור כל ROI שנבחר. לאחר שכל התאים הרלוונטיים סומנו, בחר ב-multi mesure תחת לשונית more במנהל ה-ROI.לבסוף, שמרו את המדידות ישירות או העתיקו והדביקו אותן לגיליון אלקטרוני ובצעו את החישובים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. בשימוש בפרוטוקול המתואר בסרטון זה, קל לאתר את התאים האנדותלליים של האאורטה בשל צורתם והאות הפלואורסצנטית החזקה שלהם. תאי שריר חלק יהיו גלויים גם הם באותו שדה יחד עם התאים האנדותלליים, מה שיוביל להבנה טובה יותר של האופן שבו שני סוגי התאים מגיבים במשותף אך באופן עצמאי לאגוניסטים ולגירויים שונים, ובכך ידגים את התועלת בשיטה זו.מדידות של התגובה לאצטילכולין או ל-CHA, מרחיב כלי דם תלוי סידן חזק של האנדותל, נקבעו כפי שמוצג כאן; לאחר הוספת CH, פלואורסצנציית תאי האנדותל עולה בהשוואה לתאים ב-PSS לבדו, מה שמעיד על עלייה מהירה בתוכן הסידן התוך-תאי אשר חוזר לאט לרמת הבסיס. פרוטוקול זה מתאים גם לזיהוי ייצור חנקן חמצני (nitric oxide) אנדותליאלי. בניסוי זה, תאי אנדותל של אבי העורקים נטענו ב-DAF FM D acetate.ייצור Dye ENO עלה באופן תלוי סידן בתגובה לגירוי CH, ותגובה זו נחסמה על ידי מעכב endothelial OCH synthase בשם L. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה של כלי הדם והלב. שימוש בהליך הניסויי המתואר כאן, יחד עם מספר מודלים של בעלי חיים שעברו שינוי גנטי הזמינים כיום, מספק פרספקטיבות חדשות ליישום FAR FSA של two photo microscopy במחקר בסיסי וטרנסלציונלי.שימוש בגישה זו עשוי לספק לך הבנה מעמיקה ותובנה מכניסטית לגבי מסלולי איתות תוך-תאיים ספציפיים בתוך תאי כלי הדם. לאחר צפייה בסרטון זה, תלמד כיצד ליישם טכניקה זו לניטור בזמן אמת של רמות הסידן והחנקן החד-חמצני בתוך תאים בודדים של כלי דם שבודדו acabado.

two-photon-imaging-intracellular-ca2-handling-nitric-oxide-production

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרטים שיטות ברזולוציה גבוהה...

מיקוד Ca 2 + איתור חלוף של שריר חלק

הנה אזור רומן של פרוטוקול ניתוח ריבית המבוססת על מיון אליפסות מיטבית הוקצו לאזורים של אות חיובית בתוך רצפי זמן לשגות תמונה דו ממדי מודגם. אלגוריתם זה עשוי לאפשר לחוקרים לנתח באופן מקיף אותות פיסיולוגיים + Ca 2 עם קלט משתמש מינימאלי ומשוא פנים.

ניתוח האוטומטי של דינמי Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות ברצפי תמונות

במאמר זה נתאר שיטה קלה מותאמת יחסית באמצעות צבע פלואורסצנטי diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2da) ו dihydroethidium (DHE) לגילוי סימולטני אן-פאס וויזואליזציה של תחמוצת חנקן תאית (NO) אניון סופראוקסיד (O 2 .- ) בהתאמה, טרי מבודד aortas השלם של מודל עכבר להשמנה.

צמודים זיהוי פנים של Nitric Oxide ו Superoxide ב שכבת האנדותל של העורקים Intact

נכון לעכשיו, רוב מדדי הסידן הזמינים משמשים לכימות מעברי סידן ציטופלזמיים כמדדים עקיפים של סידן המשתחרר מהרטיקולום הסרקופלזמי בתאי שריר חלק מתורבתים. פרוטוקול זה מתאר את השימוש באינדיקטור ספציפי מבוסס FRET המאפשר מדידה ישירה של אותות סידן בתוך לומן הרטיקולום הסרקופלזמי.

מדידת תנודות סידן בתוך הרטיקולום sarcoplasmic של בתאי שריר חלק בתרבית באמצעות מבוססי סריג הדמיה Confocal

תאי אנדותל וריד טבורי אנושיים ראשוניים (HUVECs) גודלו למפגש בתוך מכשיר רשת מיקרופלואידי. צומת תאי האנדותל והתפלגות ה-F-actin הודגמו והשינויים בריכוז הסידן התוך-תאי וייצור תחמוצת החנקן בתגובה לאדנוזין טריפוספט (ATP) כומתו בזמן אמת ברמות תאים בודדים.

פיתוח ואפיון של<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי דם קטן רשת מדידות כמותיות של האנדותל [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; וייצור Nitric Oxide

הסתיידות כלי הדם היא מנבא חשוב ותורם למחלות לב וכלי דם בבני אדם. פרוטוקול זה מתאר שיטות להשראת הסתיידות של תאי שריר חלק בכלי הדם הראשוניים המתורבתים ולכימות הסתיידות ועומס מקרופאגים באבי העורקים של בעלי חיים באמצעות הדמיה פלואורסצנטית קרובה לאינפרא אדום.

הסתיידות של לתאי השריר החלק בכלי הדם והדמיה של אבי העורקים הסתיידות ודלקת

כתב יד זה מתאר במבחנה מיקרוסקופ וידאו פרוטוקולים להערכת הפונקציה כלי הדם בעכברוש מוחי התנגדות העורקים. כתב היד מתאר גם טכניקות להערכת צפיפות microvessel עם fluorescently שכותרתו זלוף לקטין ורקמות באמצעות לייזר Flowmetry דופלר.

הערכה של מנגנוני הבקרה וסקולרית ניצול מיקרוסקופ וידאו מבודד התנגדות העורקים של חולדות

כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוטה עבור בידודו של רבים מן הרשתית עכברוש יכול לשמש אלקטרופיזיולוגיות, סידן הדמיה ואת הלחץ myography מחקרים.

בידוד של רבים ברשתית ללימודי פיזיולוגיה של התא Vivo לשעבר

המודגמות כאן הם פרוטוקולים לבידוד (1) טרי שלם מוחי אנדותל "צינורות" ומדידות (2) בו זמנית הסידן אנדותל של קרומית אפשרית במהלך אנדותל, נגזר hyperpolarization. עוד, שיטות אלה מאפשרים כוונון תרופתי של תאי אנדותל סידן, איתות חשמלי כמשתנים ניסיוני בודדים או אינטראקטיביות.

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

מוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור את microcirculation כלילית ברקמת לב מורין חי על ידי ניטור ex vivo של לחץ זלוף העורקים וזרימה השומרת על הלחץ, כמו גם רכיבי עץ כלי דם כולל מיטות נימי pericytes, כמו עורק הספל הוא משומר ולחץ.

מדידה והדמיה דינמיות של נימים, עורקים ופריציטים בלב העכבר

למדו מדידת רמות סידן וחנקן חד-חמצני בתאי אנדותל ושריר חלק של כלי דם מבודדים בעכברוש באמצעות מיקרוסקופיית שני פוטונים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תגובות תאיות לגירויים שונים.

הדמיה שני פוטונים של תאיים Ca

גלה סרטונים נוספים