Name: יישום הצמד תיקון והחי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפקח על מאפיינים פונקציונליים של מבודד טרי PKD האפיתל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: חקור פעילות תעלות יונים ורמות סידן תוך-תאיות באפיתל כיסי כליות מבודד ממודלים מכרסמים של PKD. שיטת patch-clamp ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשרות ניתוח פיזיולוגי מדויק של מנגנוני המחלה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לגלן סלוקום (ספר לרפואה של ויסקונסין) וקולין א לאבין (מכשירי Nikon Inc) לקבלת סיוע טכני מעולה עם ניסויים במיקרוסקופ. מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות מעניקים R01 HL108880 (לAS), R01 DK095029 (לOPO) וK99 HL116603 (לכפית), קרן הלאומית לכליות IG1724 (לכפית), איגוד לב האמריקאי 13GRNT16220002 (לOPO) ו בן ג &#39;יפס מחקר המלגה מהאגודה האמריקנית לנפרולוגיה (ל- DVI).

הפרוצדורות המתוארות להלן אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים בבית הספר לרפואה של ויסקונסין ואוניברסיטת מרכז מדע בריאות טקסס ביוסטון והיו בהתאם למכונים הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. איור 1 מדגים את שלבים עיקריים של בידוד הרקמות והליך עיבוד. בקצרה, כליות מחולדות PCK או SD משמשות לבידוד ידני של monolayers אפיתל של איסוף צינורות או מצינוריות-חייג אינן בריאה או ציסטות. כאן למדנו כליות 4-16 שבועות חולדות PCK ישנים 10,13. 1. צינוריות מגזרי בידוד של ציסטות בכליות וקשיות חיבור (CNT) / איסוף (CD) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים בעלי חיים ניסיוניים עם isoflurane (אינדוקציה 5%, 1.5 עד 2.5% אחזקה) / O כיתה רפואי 2 או שיטה שאושרה עוד. בעלי חיים חייבים להיות במעקב רציף על מנת להבטיח le ההולםvel של הרדמה. תגובת קמצוץ שיעור ובוהן נשימה יציבה משמשות כדי לאשר הרדמה מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע laparotomy ולשטוף את הכליות עם מי מלח פוספט (PBS) דרך אב העורקים בבטן 17. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קטטר צינורות פוליאתילן (PE50) ולחבר אותו למשאבת מזרק מלאה PBS. חותך את העור וקיר בטן לאורך Linea alba, ואז לעשות חתך רוחבי בבטן פני הבטן מצד לצד ולהעביר את אברי בטן עם צמר גפן כדי לקבל גישה לאב העורקים היורדים עם הסתעפות עורקי mesenteric וצליאק. להרטיב את האיברים הפנימיים עם מי מלח חם במהלך הליכים נוספים כדי למנוע היובש שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח מייתר אחד (מס &#39;1) סביב עורקי mesenteric וצליאק ומייתר אחר (מס&#39; 2) סביב אב העורקים מתחת לסרעפת (לא לקשור). בעדינות להפריד. abdominalis ידי להקהות לנתח רקמות חיבור סביבו עם מלקחיים דקים ומניח את שני חיבורים אותיות ~ 3מ&quot;מ מתחת לעורק הכליה השמאלי (# 3) ומעל הסתעפות עורקי הכסל (מס &#39;4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור # מייתר 4 ולצרף מהדק כלי סביב אב העורקים בין עורק הכליה השמאלי ומייתר # 3. עושה חתך בין המהדק ו# מייתר 4 לצנתר את אב העורקים, להשתמש מייתר # 3 כדי לתקן את הצנתר בתקיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את המהדק ולוודא כי דופק הדם גלוי בקטטר כדי להבטיח התקנה נכונה. התחל זלוף בשיעור של 6 מיליליטר / דקה, לקשור ליגטורה # 1 ומס &#39;2, ולחתוך את וריד הכליה השמאלי. המשך שטיפה במשך 1-2 דקות, עד שהאיברים החווירו לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים כלי דם כליות, שופכה ורקמות חיבור ושומן סביב במספריים כדי לאסוף את הכליות. לאחר מכן לבצע דמעה קצרה בכמוסה בכליות ולקלף את הכליות לdecapsulate. מניחים את הכליות לPBS קר כקרח. המתת חסד הוא אושר על ידי פתיחת בית החזה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 X 5 שבבי זכוכית כיסוי מ&quot;מ מצופים בפולי-L ליזין. לחתוך בשטח בנוי כיסויss עם עיפרון יהלומים ומקום כ 20 μl של 0.01% פתרון פולי-L ליזין מסונן סטרילי על כל שבב זכוכית. הכן מלוח ושני זוגות מלקחיים שען לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הכליות בסכין גילוח במישור הקדמי לפרוסות של ~ 1-2 מ&quot;מ עובי. מניחים את הפרוסות אחת תחת סטראו. בידוד של רקמות צריך להיעשות במלוח קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר ציסטות תחת סטראו כחללים עגולה צורה (איור 2 א); הקירות שלהם לעתים קרובות מכילים רשת בולטת של כלי דם התרבו. קצו מלקחיים העדין באמצעות לנתח את שכבת האפיתל הפנימית של ציסטה דקה ככל האפשר כדי להשיג שטח שכבה. לצרף אותו לשבב זכוכית מכוסה בפולי-L ליזין. משטח פולי-L ליזין דביק מאפשר לחוקר למקם את שכבת ציסטה הפנימית על זכוכית בחוזקה. לחשוף את ציסטה עם הצד עד הפסגה כדי לספק גישה לטפטפות (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בילד PCK או החולדה SDפרוסות מרכזיות ניי מכילות papilla לבידוד של CNT / CCDsegments אינו מורחב 18-21. הערה: רקמות papillary הן עמידות יותר מקליפה ועל ידי החזקת להקות צינורי פפילרי עם מלקחיים וקריעות רדיאלי ציר פרוסה ניתן ביקעו לדק מגזרים. tubules פרט גלוי ויכול להיות שלף להיות ממוקם על שבבי זכוכית כיסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את מגזרי CNT / CCD ידי הסתעפויות, שקיפות גבוהה מצינוריות הפרוקסימלי ותאים גדולים בולטת לעין (איור 2 ג). מניחים את שבב מכסה זכוכית עם צינוריות המצורפות תחת מיקרוסקופ מצויד בmicromanipulators המתאימה לנהיגת micropipettes. שימוש micropipettes החד tubules מפוצל פתוח ולצרפם לקצות הזכוכית כדי להפוך את משטח הפסגה נגיש (איור 2 ד). </li></ol> אלקטרופיזיולוגיה 2. ערוץ יחיד תיקון מהדק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את תא תיקון- clamp עם פתרון אמבטיה ולהעביר את שבב מכסה הזכוכיתעם רקמות מבודדות לתא. ודא שיש לי micropipettes תיקון מהדק התנגדות של 7-10 MΩ למדידות אמינות בתאים (מצורף תא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדידות מצורפים תא, להגדיר את יחס רווח המגבר ל20x ונמוך לעבור הזרמים ב 300 הרץ על ידי מסנן שמונה-מוט בסל. לניטור ערוצי ENaC, להשתמש בפתרון אמבטיה, במ&quot;מ: 150 NaCl, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES (pH 7.4); פיפטה: 140 LiCl, 2 MgCl 2 ו -10 HEPES (pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל ניסוי תיקון- clamp קונבנציונלי במצב 10-מצורף תא. בחר תא בשכבת האפיתל ומתקרב לפיפטה קרום הפסגה. ליצור חותם גבוהה התנגדות בין פיפטה וקרום תא על ידי יישום שאיבה עדינה. ברגע שחותם gigaOhm עמיד גבוהה נוצר, פרוטוקול ללא פער בפוטנציאל החזקה יש להתחיל לפעילות ניטור של הערוץ של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתונים חנות פער ללא יחידים ערוץ הנוכחי מגיגהחותמות אוהם לניתוח שלאחר מכן. לנתח את אירועי הערוץ באמצעות חבילת תוכנה בדרך כלל מסופקת עם הגדרות תיקון מהדק 18. חישוב פעילות ערוץ כעמותה שבי N מתייחס למספר הערוצים הפעילים בo התיקון וP היא הסתברות פתוחה ממוצעת של הערוצים. הערה: השתמש בציסטות או צינוריות בודדות בניסויי תיקון מהדק לא יותר מ -30 דקות. </li></ol> 3. מדידות ratiometric epifluorescence של ריכוז סידן תוך תאים בתאי אפיתל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 5 מ&quot;מ פורע-2:00 מומסים DMSO. פתרון מניות Aliquot לתוך צינורות חרוטי 500 μl בודדים (כ -10 μl). להגן מפני אור ולאחסן במקפיא ב -20 מעלות עד שישה חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ציסטות מבודדות וtubules המפוצל פתוחה במשך 30-40 דקות בPSS (מ&quot;מ: 145 NaCl, 4.5 KCl, 2 MgCl 2, 2 CaCl 2 ו -10 HEPES ב- pH 7.35) המכיל 5 מיקרומטר צבע פורע-2 בבוקר ו0.05% חומצת pluronic כדי לעזור לפזר את אסטרים acetoxymethyl. לשם כך, רקמות מקום בצלחת 3.5 סנטימטר המכילות קוקטייל טעינה, להגן מפני אור ודגירה על שייקר איטי בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות פורע-2:00 מכיל תקשורת לנקות PSS לאחר דגירה ולמקם את הרקמה תחת מיקרוסקופ כדי לבצע הדמיה epifluorescence נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מצלמת CCD ומקור יציב אור (מערכת monochromator) מצויד בגלגל מסנן (כל עמדת מסנן יכולה להיות קשורה לרמה שלו הנחתה, שנבחרה בכל פעם שהמסנן נקרא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את הרקמה בשדה בהיר. לעבור לזיהוי של אותות הקרינה ולהתאים את עוצמת מקור האור באמצעות מסנני צפיפות ניטראליים ומנורת כוח כדי למנוע הרוויה של האות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג הפורע-2 הקרינה בבוקר בדגימת הרקמה עם עירור ratiometric בננומטר 340/380 בתדירות של 0.125 הרץ ומעלה. השתמש 40 × / עדשה אובייקטיבית NA 1.3 או דומה לresolu הנכוןתמונת tion. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעיבוד תמונה וחישובים לייבא תמונה ברצף. ודא לפצל את הערוצים ולהשתמש בגווני אפור מצב hyperstack. בחר כמה אזורים של עניין (תאי ציסטה בודדת או אזורים נבחרים של רקמת פיברוזיס) ולחשב ערכי עוצמה לכל ערוץ (340 ו -380 ננומטר) לתוך תוכנת ניתוח נתונים העדיפה; ערכי עוצמת רקע לחסר מכל נקודת נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל נקודת זמן לחשב את היחס של עוצמות של 340-380 ערוצי הפורע-2 בבוקר. פיזור עלילה / קו שינויי נקודה-זמן של חולף Ca 2 + לכל איזור ולחשב ערכים / SE ממוצעים. </li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שתארנו כאן יישומים של טכניקת תיקון- clamp הקונבנציונלית וסידן הדמיה epifluorescence לmonolayers אפיתל פיברוזיס נגזר ממודל גנטי בעכברים של ARPKD. הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים, שרוב תשומת הלב צריך להיות משולם על הבידוד של ציסטות (שלב 1.5 של סעיף הפרוטוקולים) ומחקרי אלקטרו. נהלי מפתח אלה דורשים אימון וסבלנות רבים, והקורא לא צריך להיות מתוסכל ובעונה אחת. קודם כל, את עיקר תשומת הלב צריך להיות משולם על התהליך של בידוד ...

תעלות יונים לשחק תפקיד משמעותי בהרבה פונקציות פיסיולוגיות, כוללים צמיחת תאים והתמיינות. מחלות אוטוזומלית דומיננטיות ורצסיבי פוליציסטיות כליות (ADPKD וARPKD, בהתאמה) הן הפרעות גנטיות המתאפיינות בפיתוח של שלפוחיות מלאות נוזל כליות של מקור תאי אפיתל צינורי. ADPKD נגרמים על ידי מוטציות של גני PKD1 או PKD2 קידוד polycystins 1 ו -2 חלבונים, קרום מעורב בוויסות של התפשטות תאים והתמיינות. PKD2 על ידי עצמו או כמורכב עם PKD1 גם לתפקד כערוץ קטיון -permeable Ca 2 + 1. מוטציות של fibrocystin PKHD1 גן המקודד (חלבון כמו קולט-הקשורים cilia המעורב בtubulogenesis ו / או התחזוקה של קוטביות של אפיתל) הן הדחף הגנטי של ARPKD 2. צמיחת ציסטה היא תופעה מורכבת בליווי התפשטות מופרעת 3,4, אנגיוגנזה 5, dedifferentiation ואובדן הקוטבity של תאי צינורי 6-8. ספיגה פגומה והפרשה מוגברת באפיתל פיברוזיס לתרום להצטברות נוזלים בהרחבת הלום וציסטה 9,10. זרימה תלויה פגום [Ca 2 +] איתות אני כבר קשור גם לcystogenesis במהלך PKD 11-15. כאן, אנו מתארים שיטה מתאימה למדידות תיקון מהדק של פעילות ערוץ אחד וCa 2 + רמות תאיות בmonolayers אפיתל פיברוזיס מבודד מחולדות PCK. שיטה זו יושמה בהצלחה על ידינו לאפיין פעילות של ערוץ אפיתל Na + (ENaC) 10 ו[ Ca 2 +] אני -dependent תהליכים הנגרמים על ידי Ca 2 + TRPV4 -permeable ומפל איתות purinergic 13. במחקרים אלה השתמשנו חולדות PCK, מודל של ARPKD נגרמים על ידי מוטציה ספונטנית בגן PKHD1. זן PCK היה originally נובע מSprague-Dawley (SD) חולדות 16 חולדות ובכך SD משמשות כבקרה נאותה להשוואה עם מתח PCK. כתוצאה מכך, שני מגזרי SD עכברוש נפרון וצינורות איסוף מורחב שאינם מבודדים מאותו חולדות PCK יכולים לשמש כשתי קבוצות השוואה שונות לניסויים באפיתל פיברוזיס.

<table><tbody><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14185</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8</td><td>AAT Bioquest</td><td>21091</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פלורונית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F-68&nbsp;</td><td>תמיסה</td></tr><tr><td>Shaker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>מקור אור</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>Lambda XL</td><td>עם נהג גלגל תריס/פילטר משולב</td></tr><tr><td>מסנני צפיפות ניטרלית</td><td>Nikon</td><td></td><td>ND4, ND8</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Nikon</td><td>SFluo&nbsp;</td><td>40/1.3 DIC WD 0.22&nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td>מצלמת</td><td>שמן Andor Technologies</td><td>Zyla sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nikon&nbsp; מיקרוסקופ (הפוך)</td><td></td><td>Nikon Nikon Eclipse TE2000-S</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>Thermo Scientific</td><td>6661B52</td><td></td></tr><tr><td>עיפרון יהלום</td><td>Fisher Scientific</td><td>22268912</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת רכישת תמונות</td><td>Nikon Nikon</td><td>NIS-Elements&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תמונות</td><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/</td> <td>ND Utility plugin מאפשר לייבא תמונות בפורמט המקורי של Nikon Instruments .nd2</td></tr><tr><td>תא הקלטה/זלוף</td><td>מגבר Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patch Clamp</td><td>Devices Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition System</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&reg; מערכת</td></tr><tr><td>מסנן מעבר נמוך</td><td>וורנר אינסטרומנטס</td><td>LPF-8</td><td>8 מוט בסל</td></tr><tr><td>בורוסיליקט נימי זכוכית</td> מכשירי <td>דיוק עולמיים</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>חולץ מיקרופיפטה מסוג בוער / חום</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>יפן</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td> <td>ממונעSutter Instrument Co</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>שולחן בידוד מיקרו-רטט</td><td>TMC</td><td></td><td>מצויד בכלוב פאראדיי</td></tr><tr><td>מערכת זלוף שסתומים רב-ערוצית</td><td>AutoMake Scientific</td><td>Valve Bank II</td><td></td></tr><tr><td>תא הקלטה/זלוף</td><td>תוכנת Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td></td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>pClamp 10 . 2</td><td></td></tr><tr><td>שולחן כירורגי מבוקר טמפרטורה&nbsp;</td><td>ליבת</td><td></td> MCW <td>למכרסמים</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ דו-עיני</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>מערכת זלוף מבוססת משאבת מזרק</td><td>מכשירי</td><td></td><td></td>הרווארד</tr><tr><td>צינורות פוליאתילן</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PE50</td><td></td></tr><tr><td>הרדמה איזופלואורן</td><td><a href="http://www.vetequip.com/">http://www.vetequip.com/</a></td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנטים בסיסיים אחרים</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

יישום הצמד תיקון והחי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפקח על מאפיינים פונקציונליים של מבודד טרי pkd האפיתל

Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium

ייזום ציסטה והתרחבות במחלת כליות פוליציסטיות הוא תהליך מורכב המתאפיין בהפרעות בשגשוג תאי צינורי, הצטברות נוזלים והיווצרות luminal מטריקס. פעילות של תעלות יונים ואיתות סידן תוך תאי פרמטרים פיסיולוגיים מפתח הקובעים פונקציות של האפיתל צינורי. אנחנו פיתחנו שיטה מתאימה לתצפית בזמן אמת של פעילות תעלות יונים עם טכניקת תיקון מהדק ורישום של Ca 2 + רמה תאית בmonolayers אפיתל המבודדים טרי מציסטות כליות. חולדות PCK, מודל גנטי של מחלה אוטוזומלית רצסיבית פוליציסטיות כליות (ARPKD), שמשו כאן לניתוח vivo לשעבר של תעלות יונים ושטף סידן. שתואר כאן הוא הליך צעד-אחר-צעד מפורט שנועד לבודד את monolayers פיברוזיס וצינוריות-מורחב שאינם מPCK או חולדות נורמליות ספראג Dawley (SD), ולעקוב אחר פעילות ערוץ אחד וCa 2 + דינמיקה תאית.שיטה זו אינה דורשת עיבוד האנזימטית ומאפשרת ניתוח בהגדרת יליד monolayer אפיתל מבודד טרי. יתר על כן, טכניקה זו היא רגישה מאוד לשינויי סידן תוך תאי ויוצרת תמונות ברזולוציה גבוהות למדידות מדויקות. לבסוף, האפיתל פיברוזיס המבודד יכול לשמש עוד לצביעה עם נוגדנים או צבעים, הכנת תרבויות עיקריות וטיהור למבחנים ביוכימיים שונים.

מעורבות ENaC פוטנציאלית בcystogenesis הודגמה על ידי מספר מחקרים שנצפו גורם גדילה באפידרמיס שיבש (EGF) איתות בהתקדמות PKD 22-25 וספיג החוזר של סודיום חריג בARPKD מודלים עכברי ותרביות רקמת 26-28. לדוגמא, Veizis et al. הראה כי קליטת amiloride רגישה Na + היא ירידה בתאי CD ממודל העכבר הלא-orthologous BPK של ARPKD 29. אנחנו הוכחנו לאחרונה כי נתרן לקוי וספיגת מים בציסטות הוא גורם חשוב בהחמרת cystogenesis 10. באופן ספציפי, אנ...

תעלות יונים מתבטאות באפיתל צינורי הכליות לשחק תפקיד משמעותי בפתולוגיה של מחלת כליות פוליציסטיות. כאן אנו מתארים פרוטוקולי ניסוי המשמשים לביצוע מדידות וניתוח רמת סידן תוך תאי תיקון מהדק באפיתל פיברוזיס המבודדים טרי מכליות מכרסמים.

יישום הצמד תיקון והחי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפקח על מאפיינים פונקציונליים של מבודד טרי PKD האפיתל

Cyst initiation and expansion during polycystic kidney disease is a complex process characterized by abnormalities in tubular cell proliferation, luminal ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לרשום פעילות של תעלה בודדת ולמדוד שינויים בריכוז הסידן התוך-תאי בשכבות מונו-שכבה של ציסטות שבודדו acabado ממודלים של מכרסמים למחלת הכליות הפוליציסטית. דבר זה מושג תחילה על ידי שטיפה של כליות PCK rec דרך אבי העורקים הבטני על מנת להסיר דם מרקמות הכליה. השלב השני הוא בידוד המונו-שכבה האפיתליאלית של הציסטות.בשלב הבא, ניתן להשתמש בשכבה הבודדת (monolayer) המבודדת להקלטות patch clamp קונבנציונליות של תעלות יונים בממברנות האפיקליות של תאי אפיתל. ניתן להשתמש ברקמה המבודדת גם לצורך טעינה בצבעי סידן, על מנת לכמת שינויים בריכוז הסידן התוך-תאי בתאי האפיתל.ניתן להשוות פרמטרים אלו, שנמדדו בסביבתם הטבעית של הציסטות, לצינוריות בריאות על מנת לחקור את תהליך היווצרות הציסטות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לחקור את פעילות תעלות ה-chi ואת זרימת הסידן בתוך ציסטות כלייתיות. ניתוח זה מספק נתונים רלוונטיים פיזיולוגית שהתקבלו מרקמות שבודדו במידי.באמצעות גישה זו, אנו יכולים לנטר פעילות של תעלה בודדת באפיתל שבודד הרגע. זוהי שיטה ייחודית מכיוון שניתן להשתמש בה כדי לאפיין במדויק את התנהגותן של תעלות ברזל תוך שימוש בשינויים שונים של טכניקת ה-patch. אנו יכולים לבחון את תגובת התעלה לתרופות שונות בצינורות חסר (cystic) ובצינורות בריאים.ניתן להשתמש בשכבה החד-שכבתיות של הציסטות שבודדו acabado לצורך דימיון של סידן תוך-תאי. טכניקה זו מאפשרת סריקה פרמקולוגית ומחקרי תפקוד של הומאוסטזיס של סידן תוך-תאי בתאי ציסטות, המהווים אמצעים חשובים לגילוי טיפולים חדשים למניעת מחלת הכליות הפוליציסטית. טיפול בהסרת דם ימחיש את הגישה הכירורגית המשמשת לניקוי הכליות מהדם.ראשית יוצגו הלימודי בידוד של הכליה והציסטות. התחל את הפרוצדורה בביצוע לפרוטומיה ושטיפת הכליות ב-PBS דרך אבי העורקים הבטני של חולדה שהורדמה. לשם כך, חבר קטטר של צינור פוליאתילן למשאבת מזרקים מלאה ב-PBS.חתכו את העור ואת דופן הבטן לאורך קו האמצע של הבטן, והזיזו את איברי הבטן בעזרת מקלוני צמר גפן כדי להשיג גישה לאבי העורקים היורד (descending aorta) עם הענפי העורקים המזנטריים והצליאקיים. לאחר מכן, הצמידו את הליגטורה הראשונה סביב העורקים המזנטריים והצליאקיים ואת הליגטורה השנייה סביב אבי העורקים, מתחת לסרעפת.הפרידו בעדינות את ה-aorta ADOS באמצעות דיסקציה קהה של הרקמות החיבוריות שסביבו באמצעות פינצטה. לאחר מכן, מקמו את הליגטורה השלישית כ-3 mm מתחת לעורק הכליתי השמאלי ואת הליגטורה הרביעית מעל למסעף של העורקים האיליאקים. קשרו את הליגטורה הרביעית וחבקו את האורטה באמצעות תפס כלי דם בין העורק הכליתי השמאלי לליגטורה השלישית.בצעו חתך בין התסבכת לבין הליגטורה הרביעית כדי להחדיר קטטר לאורטה. לאחר מכן, השתמשו בליגטורה השלישית כדי לקבע את הקטטר בצורה חזקה. כעת, שחררו את התסבכת.וודאו כי פעימות הדם נראות בקטטר כדי להבטיח התקנה תקינה. לאחר מכן, התחילו בפרפוזיה וקשרו את הליגטורה הראשונה והשנייה. לאחר מכן, חתכו במהירות את הווריד הרנאלי השמאלי כדי לשחרר את הלחץ.המשיכו בשטיפה למשך דקה אחת עד שתי דקות עד שהאיברים יהיו לבנים לחלוטין. לאחר מכן, גזרו את כלי הדם של הכליות, את השופכה ואת רקמת החיבור והרקמה השומנית שסביבם. כדי להוציא את הכליות, בצעו קרע קצר בקפסולת הכליה וקלפו את הכליות כדי לעטוף אותן.לאחר מכן, העבירו את הכליות ל-PBS קר בקרח. בשלב הבא, הכינו לוחות כיסוי מזכוכית במידות של 5 על 5 מילימטר ו-25 על 25 מילימטר, מצופים ב-poly L lysine.חתכו את הכליות בעזרת להב תער לאורך המישור הפרונטלי לפרוסות בעובי של 1 עד 2 מ"מ. לאחר מכן, הניחו את אחת הפרוסות תחת מיקרוסקופ סטריאו. אתרו את הציסטות, הנראות כחללים עגולים, באמצעות פינצטה בעלת קצה דק.בצעו דיסקציה של השכבה האפיתלית הפנימית של הציסטה באופן דק ככל האפשר כדי לקבל שטח של שכבה אחת (monolayer). לאחר מכן, הצמידו אותה לשבב זכוכית המצופה ב-polylysine וחשפו את הצד האפיקלי של הציסטות כלפי מעלה. כדי לאפשר גישה לפיפטות לביצוע אלקטרופיזיולוגיה, מלאו את תא ה-patch clamp בתמיסת רחצה (bath solution). לאחר מכן, העבירו את שבב זכוכית הכיסוי עם הרקמות המבודדות אל התא.בחרו תא בשכבה האפיתליאלית החד-שכבתיות והתקרבו לממברנה טיפוסית באמצעות פיפטת פאץ' (patch pipette). לאחר מכן, בצעו ניסוי patch clamp קונבנציונלי במצב הצמדה לתא (cell attached mode). בהליך זה, הניחו את הציסטות המבודדות ואת הצינוריות שנפתחו בצלחת של שלושה וחצי סנטימטרים המכילה PSS, והוסיפו 5 $\mu$M flu, 8 HD ו-0.05% onic acid כדי לסייע בפיזור ה-acet to meth lesters.לאחר מכן, הגנו על הדגימה מפני אור והדגירו אותה על ניעור איטי בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 40 דקות. לאחר ההדגרה, שטפו את מצע ההדגרה באמצעות PSS נקי. לאחר מכן, הניחו את הרקמה תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי לביצוע דימות פלואורסצנציה.הפעל את תוכנת הרכישה של המיקרוסקופ הקונפוקאלי. לאחר מכן, הפעל את לייזר הארגון על אורך גל עירור של 488 nanometers וכייל את הפליטה ל-520 עם רוחב פס של 25 nanometers. לאחר מכן, אתר את הרקמה באמצעות שדה בהיר (bright field).נטר את הפלואורסצנציה של fluo-8H בדגימת הרקמה בתדר של 0.25 hertz או גבוה יותר. החל TP או מודולטורים פרמקולוגיים אחרים כדי להשרות עלייה בריכוז הסידן התוך-תאי. מוצגים כאן עקומות זרם מייצגות עבור פעילות תעלת נתרן אפיתלית שנמדדה ב patched-cell של ציסטות שבודדו טרימם מחולדה מסוג PCK בת 16 שבועות, לאחר טיפול ב-benzoyl ובמי שתייה למשך 12 שבועות.קווים מקווקווים מציינים את המצב הנוכחי הרלוונטי, כאשר C ו-op n מסמנים את המצבים הסגור והפתוח. גרף זה מסכם את פעילות תעלת הנתרן האפיתלית שנצפתה, שבה benzoyl, מעכב סלקטיבי של תעלת הנתרן האפיתלית, הפחית באופן משמעותי את פעילות תעלת הנתרן האפיתלית. סרטון זה מציג שכבה מונו-ציסטית הטעונה ב-flu oh eight H לפני ואחרי יישום של 10 µM ATP. ניתן לראות עלייה בעוצמת אות הפלואורסצנציה הירוקה כאשר ריכוז הסידן התוך-תאי עולה בתגובה ל-ATP. גרף זה מסכם את השפעת ה-ATP על רמות הסידן בתא.בשכבה חד-שכבתית (Monolayer) של חולדות PCK, יישום של TP גורם לעלייה מהירה ברמת הסידן התוך-תאית, אשר חוזרת לרמה הבסיסית תוך שתי או שלוש דקות. טכניקה זו מציעה הזדמנות ייחודית לניטור שינויים בזרימת הסידן ובפעילות תעלות ברזל בכליות ציסטיות. מעבר לאפיון הפעילות של תעלת הנתרן התאית והזרמת הסידן בחולדות PCK, ניתן להשתמש בגישה זו לניתוח תעלות ברזל אחרות במגוון מודלים של AR ו-A-D-P-K-D.

implementing-patch-clamp-live-fluorescence-microscopy-to-monitor

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מדגימים כיצד ללמוד את ההשפעה של מוטציה נקודה אחת על התפקוד של ערוץ יון.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

בסרטון הזה אנחנו מדגימים להדמיה טרנסלוקציה של PKC בתאים חיים באמצעות PKCS מתויג fluorescently.

Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

סרטון זה מתאר שיטה לדימות ורישום בו זמנית של פעילות חשמלית מפרוסות מוח טרנסגניות המכילות חלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים לנוירונים. ההליך כולל שמירה על פרוסת המוח בתא זילוח עם נוזל מוחי מלאכותי משודר, שימוש במקור אור כדי לעורר תאים המסומנים בפלואורסצנט, ורישום האותות החשמליים באמצעות בדיקה רב-ערוצית ומהדק טלאי.

ניטור אופטי ואלקטרופיזיולוגי סימולטני של תאי עצב בפרוסות מוח

בסרטון זה, תרביות תאי כליה עובריים המבטאים חלבוני תעלות יונים תלויי אור המאוחים עם כתב פלואורסצנטי מדגימות את השפעת האור על תנועת היונים. מהדק טלאי תא שלם משמש לניטור תנועת היונים.

רישום אלקטרופיזיולוגיה אופטוגנטית של תאים עם תעלות יונים תלויות אור

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

שינויים ברמות הסידן התוך-תאיות בפודוציטים הם אחד האמצעים החשובים ביותר לשליטה בתפקוד הסינון של גלומרולים. כאן אנו מסבירים גישה בעלת תפוקה גבוהה המאפשרת זיהוי של טיפול בסידן בזמן אמת ופעילות תעלות יונים בודדות בפודוציטים של הגלומרולים הטריים שבודדו.

ערוץ יחיד הדמיה ניתוח וסידן בPodocytes של glomeruli מבודדת טרי

מתוארת שיטה לגירוי פעילות חשמלית של תרביות תאים במבחנה עם אור נראה, המבוססת על שימוש בפולימרים אורגניים מוליכים למחצה.

שליטה אופטית של תאי חיים פעילות חשמלית על ידי פולימרים מצומדות

מאמר זה מתאר כיצד נקבעת סלקטיביות היונים של channelrhodopsin באמצעות רישומים אלקטרופיזיולוגיים של Patch-Clamp של תאים שלמים באמצעות תאי HEK293. כאן, מודגם ההליך הניסיוני לחקירת סלקטיביות כלוריד של תעלה רודופסין סלקטיבי של אניונים. עם זאת, ההליך ניתן להעברה לתעלות רודופסינים אחרים בעלי סלקטיביות מובחנת.

תא שלם תיקון מהדק הקלטות עבור קביעת electrophysiological של יון סלקטיביות ב Channelrhodopsins

אנו מציגים פרוטוקול המשלב בידוד התא ואת כל התא תיקון תיקון מהדק כדי למדוד את המאפיינים החשמליים של תאים אפיתל העיקרי ניתק מן epididymides cauda חולדה. פרוטוקול זה מאפשר חקירה של המאפיינים הפונקציונליים של תאים אפיתלתיים ראשוניים אפידלימלי נוספת להבהיר את התפקיד הפיזיולוגי של האפידידימיס.

כל תא תיקון מהדק הקלטות של תאים אפיתל העיקרי מבודדים מן האברדימיס

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע אוטומטית תמונה מודרך תיקון ניסויים מהדק באמצעות מערכת שפותחה לאחרונה עבור תקן במבחנה electrophysiology ציוד.

יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

מטרת פרוטוקול זה היא לבודד אזורי קוצב לב שלמים של אגן כליות העכבר באמצעות חלוקת רטט. לאחר מכן ניתן להשתמש במקטעים אלה בהדמיה של מקום Ca2+ כדי לפרט תכונות חולפות Ca2+ של תאי קוצב לב ותאים ביניים אחרים בפרוסות ויברטום.

בידוד והדמיה חיה, אזורי קוצב לב שלמים של אגן כליות העכבר על ידי חלוקת ויברטום

חקור פעילות תעלות יונים ורמות סידן תוך-תאיות באפיתל כיסי כליות מבודד ממודלים מכרסמים של PKD. שיטת patch-clamp ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשרות ניתוח פיזיולוגי מדויק של מנגנוני המחלה.

יישום הצמד תיקון והחי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפקח על מאפיינים פונקציונליים של מבודד טרי PKD האפיתל

גלה סרטונים נוספים