"פוליקולטורה שיטת Rotifer" השלמה ומעודכנת לדג הזברה האכלת לתי-פוסקת הראשונה
17 בינואר 2016
דגי זברה מותאמים להאכיל זואופלנקטון. אפשר לנצל את התכונה הטבעית הזו במעבדה על ידי גידול דגים האכלה ראשונה יחד באותה מערכת עם רוטיפרים חיים של מים מלוחים. אסטרטגיית "רב-תרבות" זו מקדמת צמיחה והישרדות גבוהות עם מינימום עבודה והפרעה לזחלים.
המטרה הכוללת של שיטת הפוליקולטורה של רוטיפר היא לרתום את הפרודוקטיביות הטבעית והמאפיינים הביולוגיים של רוטיפרים של מים מלוחים כדי ליצור סביבה המקדמת צמיחה מהירה, והישרדות מקסימלית של דג זברה הזחל הראשון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מפחיתה באופן דרמטי את כמות הזמן והמרחב הנדרשים כדי לגדל בהצלחה מספר גדול של זחלי דג זברה לשימוש בניסויי מחקר. התחל בתחזוקת תרבית הרוטיפר על ידי מילוי כלי התרבות להזנה, או FCV, לקיבולת של 90 אחוז במים מתוקים נקיים ונטולי כלור במינון של 10 גרם לליטר מלחי אקווריום.
ודא שהמים מעורבבים היטב ושכל המלח מומס במלואו. לאחר מכן, הגדר את זרימת האוויר לתוך הכלי כך שישמור על רתיחה מתגלגלת. מדוד את מליחות הנוזל בעזרת רפרקטומטר.
לאחר מכן, דגמו את הרוטיפרים בכלי התרבות, או CV.וודאו שהתרבות מעורבבת היטב. לאחר מכן, אספו שלוש דגימות של שניים עד שלושה מיליליטר באמצעות פיפטת העברה מחלקים שונים של התרבית ושלבו את הדגימות בשפופרת. מעבירים מיליליטר אחד עד שניים מהדגימה המשולבת לצלחת פטרי.
דמיין את הדגימה תחת מיקרוסקופ מנתח, ובדוק את איכות התרבית. הוסף לדגימה 100 מיקרוליטר של 50 אחוז תמיסת יוד של לוגול כדי לשתק את הרוטיפרים ולספור אותם. קח מיד תת-דגימה של שני מיליליטר עם פיפטה מפלסטיק והוציא מיליליטר אחד לשקופית ספירה של Sedgewick Rafter.
בעזרת מיקרוסקופ הניתוח, ספרו כמה שיותר משטח ההחלקה הדרוש כדי לספור עד 100 רוטיפרים שלמים ואת המספר הכולל של הביצים המחוברות לרוטיפרים. לאחר מכן, חשב את מספר הרוטיפרים למיליליטר לשימוש מאוחר יותר. התחל את הקציר על ידי הסרת אספקת האוויר ומסנן החוט הדנטלי.
פתח לאט את השסתום בתחתית קורות החיים ואפשר למים לזרום בעדינות לתוך אספן פלנקטון עם רשת 53 מיקרון. אוספים את המים הזורמים מתחתית הקולט לאחר סינון לדלי או ניקוז. לאחר מכן, מלאו בקבוק ב -10 עד 15 גרם לליטר מי מלח נקיים.
הפוך את המסך מעל ה-FCV ושטוף את הרוטיפרים לתוך ה-FCV בזרם עדין של מי מלח. הפעל את טיימר המדידה הניתן לתכנות או PMT כדי לספק הזנה ל-FCV. לאחר מכן, שפשפו את כל החלק הפנימי של קורות החיים עם כרית קרצוף נקייה.
צור תערובת חדשה של 15 גרם לליטר בדלי של חמישה ליטר כדי להחליף את נפח המים שאבד לקציר. מערבבים את התמיסה במרץ עד להמסה מלאה של התערובת. לאחר מכן, הוסף את התמיסה ל-CV.לאחר מכן, שטפו את מסנן החוט הדנטלי בתרסיס בלחץ גבוה.
כאשר מסנן החוט הדנטלי נקי מפסולת, החזר אותו ל-CV.התאם את קצב ההזנה של אצות המועברות ל-CV על ידי שינוי משך כל אירוע מינון. לאחר 24 שעות, חזור על התהליך, והחל את קציר הרוטיפרים שנותרו ב- FCV. רכזו את הרוטיפרים בשני ליטר מים טריים, נקיים ונטולי כלור עם חמישה גרם לליטר מלח.
ניתן לאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס כאספקת גיבוי, או להשתמש בהם להאכלת דגים בשלבים מאוחרים יותר מעבר למה שמתואר בפרוטוקול זה. אסוף עוברי דג זברה מאירוע הטלה על ידי שפיכת עוברים שהושרצו דרך מסננת תה. ואז, שטיפה עדינה במי דגים סטריליים מבקבוק כביסה לתוך צלחות פטרי.
לאחר איסוף כל העוברים, דגרו עליהם. התחל את שלב הפוליקולטורה כאשר יותר מ-90 אחוז מהזחלים שבקעו שוחים באופן פעיל בעמוד המים. הוסף 500 מיליליטר מתרבית הרוטיפר ישירות מה- FCV למיכל משתלה בנפח 3.5 ליטר.
לאחר מכן, שפכו בעדינות את הזחלים מצלחת פטרי אחת למיכל המשתלה. ודא שלא יישארו זחלים בכלי. הוסף למיכל 500 מיליליטר מי דגים נקיים וממוזגים ממקור מים ייעודי לנפח סופי של ליטר אחד, ו-5 גרם לליטר מליחות סופית.
התבונן במיכל הרב חקלאי לפחות פעם ביום כדי לוודא שהרוטיפרים והדגים נוכחים וגדלים. בדוק שהרוטיפרים נראים בכל עמוד המים. ודא שהדגים נראים גם בתוך עמוד המים ושהם שוחים בין הרוטיפרים.
זה קריטי להעריך את המצב של כל מיכל על בסיס יומי כדי לוודא שהם חיים ושוחים עם רוטיפרים זמינים לכל זחלי הדגים. עם הבטחה שהרוטיפרים והדגים גדלים, התחל זרימת מים רגילה דרך המיכל. לבסוף, הנח מסך מעל פתח הניקוז כדי להבטיח שהזחלים לא יישטפו מהמיכל.
הביצועים האופייניים של תרבית רוטיפר נוטרו במשך תקופה של 30 יום, והניבו צפיפות תרבית ממוצעת של 932 רוטיפרים למיליליטר. ומקסימום 1,330 רוטיפרים למיליליטר. לאוכלוסיית הרוטיפרים במיכל רב-תרבותי עם דג זברה יש צפיפות רוטיפרית ממוצעת של 589.4 רוטיפרים למיליליטר.
הערך המינימלי של 481 רוטיפרים למיליליטר טוב פי 10 מעבודות שפורסמו בעבר. דג הזברה הראה צמיחה מתמדת בכל יום במהלך תקופה של חמשת הימים מאורך כולל ממוצע של 3.9 מילימטרים ל-5.4 מילימטרים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגדל רוטיפרים לשימוש במערכת רב-תרבותית שתוכננה כדי לענות על הדרישות התזונתיות של האכלה ראשונה של דג זברה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
שיטת הרב-תרבית של רוטיפרים עושה שימוש ברוטיפרים של מי מלח כדי לשפר את הגדילה וההישרדות של זחלי דגי זברה בהאכלה ראשונה. טכניקה זו מפחיתה באופן משמעותי את המשאבים הדרושים לגידול כמויות גדולות של זחלי דגי זברה למטרות מחקר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- טכניקות של חקלאות מים
רקע
- זחלי דגי זברה ניזונים באופן טבעי מזואופלנקטון.
- שימוש ברוטיפרים חיים במי מלח יכול לשפר את צמיחת הזחלים.
- שיטה זו מפחיתה את העבודה ואת ההפרעות במהלך הגידול.
- גידול יעיל הוא קריטי עבור יישומים מחקריים.
מטרת המחקר
- במטרה לעודד גדילה מהירה של זחלי דגי זברה.
- במטרה למקסם את שיעורי ההישרדות של זחלים בשלב ההאכלה הראשונה.
- במטרה לייעל את תהליך הגידול למטרות מחקר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תחזוקת תרבית של רגיליות (rotifers) בכלי גידול עם פתח להזנה.
- הכנת מים נקיים, ללא כלור, עם מלחים לאקווריום.
- קביעת זרימת אוויר לשמירה על תנועה סיבובית (rolling boil) בכלי הגידול.
- מדידת המליחות באמצעות רפרוקטומטר להשגת תנאים אופטימליים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מפחיתה באופן משמעותי את הזמן והמרחב הדרושים לגידול זחלים.
- נצפו שיעורי גדילה גבוהים ושיעורי הישרדות גבוהים של זחלי zebrafish.
- הושג ניצול יעיל של משאבים באמצעות גידול משולב (polyculture).
מסקנות
- שיטת תרבית העירבוב של רוטיפרים יעילה לגידול של זחלי zebrafish.
- גישה זו עשויה להועיל ליישומים מחקריים שונים.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון אופטימיזציה נוספת של שיטה זו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מרכזית
גידול יעיל של דגי זברה (zebrafish) בשלב ההאכלה הראשוני הוא קריטי לסריקת in vivo בתפוקה גבוהה ולאימות מטרות בשלבים מוקדמים במחקר ופיתוח בביופארמה. שיטת פולי-קלטורה של רוטיפרים מאפשרת ייצור בר-שחזור ובקנה מידה רחב של זחלי דגי זברה בריאים, ובכך תומכת בפריסה חסונה של מערכת מודל עבור תהליכי גילוי ומחקרים פרה-קליניים. גישה זו מפחיתה מגבלות של משאבים ומשפרת את האמינות הניסויית בתוכניות פורטפוליו המשתמשות בדגי זברה כמערכת רלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הפקה עקבית של קהלים גדולים של זחלי zebrafish למחקרים מונחי היפותזה.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי הבטחת שיעורי הישרדות וצמיחה גבוהים באורגניזמי מודל.
- מפחית שונות ביולוגית, ובכך מחזק את הביטחון החזוי בסריקות בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מסייע בהכנת זחלים בריאים וסטנדרטיים עבור בדיקות סריקה פנוטיפיות.
- משפר את הדירות הבדיקה על ידי מזעור גורמים תזונתיים וסביבתיים מבלבלים.
- תומך ביכולת הרחבה (Scalability) ובשימוש חוזר בפלטפורמה עבור תהליכי הערכת תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מספק תשתית חסונה למודלי מחלות ולמחקרי ביומרקרים תרגומיים בזבובני זב (zebrafish).
- מבטיח המשכיות משלב הגילוי המוקדם ועד לאימות פרה-קליני על ידי שמירה על שלמות המודל.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאמות סיכון, המבוססות על נתונים מהימנים שגובו במודלים בחיים (in vivo).
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת בממשק שבין הגילוי המוקדם לזיהוי המולקולות המובילות (lead identification), ומספקת אספקה אמינה של זחלי zebrafish לצורך סריקות המשך ומחקרים מכניסטיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבטחת עקביות המודל.
- סינון (Screening): מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך ניתוח השוואתי של תנאי הבדיקה.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה חסונה של גדילה והישרדות כמשתנים תלויים להערכה סטטיסטית.
- מחקר תרגומי: שומר על נאמנות למערכת הרלוונטית למחלה עבור מחקרי ביומרקרים ויעילות.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן זרימת עבודה סטנדרטית וניתנת להרחבה לשימוש חוזר בתוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים המבוססים על דגי זברה.
- ערך תפעולי: מייעל את תהליכי הגידול, ובכך מפחית את צורכי העבודה והמשאבים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ואת היעילות ההונית על ידי תמיכה ביצירת נתונים מהימנים in vivo.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון וקידום של נכסי גילוי ונכסים פרה-קליניים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות טכנית בתחזוקת מערכות מודל מימיות ובניהול מזון חי.
- נדרשת גישה לבקרת איכות מים, ניטור מליחות ומיקרוסקופיה בסיסית לצורך כימות רוטיפרים.
- נדרש סטנדרטיזציה בין צוותים כדי להבטיח הדירות (reproducibility) בין סדרות הניסויים.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול בהתאם לצרכים הספציפיים של המין.
- תלוי באספקה עקבית של רוטיפרים חיים ובניטור בריאות התרבית.
