Name: G- חלבון סלקטיבית GPCR תצורות נמדדו באמצעות סריג חיישנים ב assay fluorometer השעית תא חי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: חקור תצורות GPCR סלקטיביות לחלבון G באמצעות מערכת חיישני FRET בתאים חיים. שיטה זו מאפשרת הערכת השפעת אגוניסטים שונים על קולטנים ומספקת תובנות לגבי מנגנוני פעולת תרופות בביולוגיה של תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

רום מומן על ידי הקרן איגוד הלב האמריקני קדם דוקטורט (14PRE18560010). המחקר מומן על ידי מענק פיתוח American Heart Association המדען (13SDG14270009) &amp; NIH (1DP2 CA186752-01 &amp; 1-R01-GM-105,646-01-A1) ל SS

1. DNA כן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיישן עיצוב בונה באמצעות ערכת שיבוט מודולרי. נא להפנות את עיצוב חיישן β 2 -AR כמפורט לעיל 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה- DNA על פי פרוטוקול ערכת miniprep מסחריים elute ב 2 mM Tris-HCl פתרון, pH 8, ב ≥ ריכוז 750 ng / μl, 260/280 של 1.7 - 1.9, 260 / A 230 של 2.0 - 2.29. </li></ol> 2. תא הכנת תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאים HEK-293T-FLP-n ב DMEM המכיל 4.5 גר &#39;/ ל D- גלוקוז, בתוספת 10% FBS (חום מומת) (v / v), 1% תוספת L- גלוטמין, 20 HEPES מ&quot;מ, pH 7.5 ב 37 ° C באווירה humidified ב 5% CO 2. לטפל בתאים במנדף בטיחות ביולוגית על הצעדים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר לתאים לגדול כדי בשכבה ומחוברת לפני passaging לתוך מנות שש היטב. זמן להשיג confluency תלוי צפיפות ציפוי ראשונית. צלחות השתמשולבוא confluency בתוך 1 - 2 ימים של ציפוי עבור שש גם ציפוי. A 10 ס&quot;מ רקמה ומחוברות תרבות שטופלו יש צלחת צפיפות התאים של כ 4 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. ראה איור 1 עבור תמונה של צמיחת תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 10 מ&quot;ל PBS, trypsinize עם טריפסין 0.25% (ראה דיון, פסקה 2). פלייט 8 x 10 5 תאים / גם ב 2 מ&quot;ל של התקשורת ברקמות תרבות שטופלו שש מנות היטב ולאפשר לדבוק עבור 16 - 20 שעות. </li></ol> 3. תנאי Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתנודד transfections עבור מבנים אשר יחייבו כמויות שונות של זמן כדי להשיג ביטוי אופטימלי (בין 20 - 36 שעות). סנכרון תנאים במשך זמן ניסוי אחיד. כמו כן יש פקד untransfected היטב צפיפות התאים שווה לשמש רעשי רקע וחיסור פיזור במהלך ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו ריאגנטים transfection לטמפרטורת החדר: מדיה סרום מופחת, DNA, מגיב transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במכסה מנוע בטיחות ביולוגי לשלב חומרים כימיים בתוך שפופרת microcentrifuge סטרילי לפי הסדר הבא: לערבב DNA 2 מיקרוגרם עם 100 μl מדיה סרום מופחתים. ספייק 6 μl של מגיב transfection לתוך תמהיל המדיה / DNA בלי לגעת פני השטח של תערובת או בצד של הצינור. הגדרת תגובת transfection אחד לכל טוב. תנאי transfection יכולים להיות מותאמים (1 - 4 מיקרוגרם של ה- DNA, 3 - 6 μl של מגיב transfection) להשיג רמות ביטוי עקביות. ראה טבלת מס &#39;1 עבור יחסים מותאמים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תערובת על RT במנדף בטיחות ביולוגי במשך 15 - 30 דקות. אין להשתמש תגובה אם נותר כדי לדגור במשך יותר מ -30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת תגובה לתאים באופן טיפה חכמה על פני היטב ובעדינות לנער שש היטב כדי להבטיח ערבוב יסודי. הוספת תגובה אחת לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 20 שעות של ביטוי, קרינה לפקח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתרבית רקמה. להעריך ביטוי אוכלוסייה עם 10X לוקליזציה אובייקטיבית חלבון בתא ב 40X. observe לביטוי חלבון הממברנה (PM). אם הפנמה משמעותית יצוין, לפקח transfection עד ביטוי משמעותי מזוהה ב PM. </li></ol> 4. מגיב והכנת הציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 מניות התרופות מ&quot;מ ולאחסן ב -80 ° C: bitartrate isoproterenol (100 מ&quot;מ ב DH 2 O המכיל 300 חומצה אסקורבית מ&quot;מ). הפוך על הקרח / בחדר קר, להקפיא פלאש מיד. Aliquots יכול להתבצע ומשומשים עד שנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא הצפת (~ 2 מ&quot;ל / מצב) ולאחסן באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הפוך טרי כל יום. טבלת עזר 2 עבור מרכיבי הצפת תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הצפת והתרופות האמריקני (10 מ&quot;ל) ולאחסן בטמפרטורת החדר. טבלת 2 קוד עבור מרכיבי הצפה ותרופות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומצה לשטוף cuvettes באמצעות HCl מרוכזת. לנטרל עם בסיס חלש (1 M KOH), וביסודיות לשטוף cuvettes עם DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עבודה לתחנה בסביבות fluorometer עם כמהקופסאות של 10, 200, ו -1,000 טיפים פיפטה μl, טיימר להגדיר עם ספירה לאחור 10 דקות, קו ואקום נגיש עם טיפים לניקוי קובט, מגבונים משימה עדינה, ואת בקבוק להשפריץ עם ultrapure H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים באמבט מים חיצוני עבור בלוק fluorometer וחום עד 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל fluorometer; להגדיר תוכנית איסוף הקרינה לאיסוף CFP כדי עירור 430 ננומטר, bandpass 8 ננומטר; פליטת טווח 450 ננומטר - 600 ננומטר, bandpass 4 ננומטר. לקבלת אוסף YFP רק כשליטה חיישן (ראה דיון) עירור סט ל -490 ננומטר, bandpass 8 ננומטר, טווח פליטה 500 - 600 ננומטר, bandpass 4 ננומטר. הגדרות אוסף CFP ישמש לרכישת ספקטרום סריג בניסוי הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים עשר 1.5 מ&quot;ל צינורות microcentrifuge בבלוק חום כפי שמוצג באיור 2 להלן. צינורות אלה הם בעלי צינורות התא aliquot (500 μl צינורות microcentrifuge.) מניח חתיכה קטנה של רקמת מחזיקי 1 ו -7 לרכך את cuvettes הנכתב כאן. הערה: השתמש cuvettes נפרד עבור מצב לא מטופל ומצבו התרופה כדי למנוע זיהום צולב. </li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig2.jpg" /> Tube איור 2. Microcentrifuge הגדרה והפנית עמדה בבלוק חום קובט עבור דגימות מטופל נמצא במצב 1.; צינורות התא aliquot נמצאים בעמדות 2 - 6. קובט עבור דגימות סמי מטופלים נמצאים בעמדה 7; צינורות תא aliquot נמצאים בעמדות 8 - 12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54696/54696fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו בעלי 2 - 6 ו 8 - 12 עם ~ 750 μl של מים כדי ליצור C אמבט מים מיני 37 מעלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים עשר 500 צינורות microcentrifuge μl עבור aliquots התא לתוך אמבטיות מיני-מים (בעלי 2 - 6, 8 - 12). כל שפופרת תהיה חוזרות פרט של המצב (5 untreateד, 5 סמים מטופלים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג התאים לביטוי (ראה שלב 3.6). </li></ol> ניסוי 5. &amp; איסוף נתונים <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54696/54696fig3.jpg" /> איור 3. ניסיונותיי סכמטי. מדריך צעד חכם מפורט הניסיון להגדיר וביצוע. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54696/54696fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפניה איור 3 עבור סכמטי ניסיוני. כאשר התאים מוכנים להיות שנקטפו, מבוסס על ביטוי חלבון מזוהה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראה דיון, פסקה 4): במנדף בטיחות ביולוגית, הסר בעדינות ~ 1 מ&quot;ל של התקשורת, תאים resuspend בתרבות שלהם עם P1,000 ולהעביר resuspension לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. הערה: הימנע משימוש טריפסין כפי שהוא עשוי לעכל את N- הסופית ו /או מחייב בכיס של החיישן GPCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים על מנת להבטיח צפיפות תאים נאה resuspension. מטב נפח resuspension עבור 4 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין תאי צנטריפוגות דלי מתנדנד בטמפרטורת חדר, 290 XG במשך 3 דקות. הסר supernatant לאחר צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות resuspend תאי 1 מיליליטר תא הצפה (מאוחסנת על 37 מעלות צלזיוס) וחזור על שלב 5.3. במהלך ספין השני, לאסוף aliquot המניות התרופה 100 מ&quot;מ מ -80 מעלות צלזיוס. הפוך 1: 100 דילול ב הצפת והתרופות 1 מ&quot;מ המניות לעבוד ולשמור ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה השני, להסיר supernatant ותאי resuspend בעדינות 1 מ&quot;ל של תא הצפת (4 x 10 6 תאים / מ&quot;ל). OD מדוד 600 של המדגם בשנת ספקטרופוטומטר באמצעות 1 מ&quot;ל של תאים 1 מ&quot;ל של תא הצפת בתור ריק. לוותר תאי קובט פלסטיק חד פעמי ולהעביר בחזרה אל צינור microcentrifuge מייד לאחר spectrophotometry. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך cel מלא untransfectedספקטרום מצב l, בעדינות resuspend תאים untransfected ב 1 מ&quot;ל תא הצפת עם P1,000 pipet, להוסיף 90 μl של תאים כדי קובט ולרכוש ספקטרום סריג ב ננומטר עירור 430, bandpass 8 ננומטר, פליטת 450 - 600 ננומטר, bandpass 4 ננומטר. אסוף 3 - 5 ספקטרה חוזרים עם 90 μl הטרי של תאים. לשמור על מלאי של התאים ב 37 ° C בין המשקפיים, resuspend בעדינות עם P1,000 בין כל aliquot מדגם, ולשטוף קובט עם ultrapure H 2 O בין דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תנאי ניסוי, aliquot 90 μl של תאי transfected לכל אחד 500 צינורות μl בבעלים 2 - 6, 8 - 12 בבלוק החום. בעדינות resuspend המניות של תאים עם pipet P1,000 בין כל aliquot. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התאים aliquoted, להוסיף 10 μl של הצפת והתרופות לצינורות 2 - 6 עבור דגימות מצב לא מטופל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין הניסוי על ידי הוספת 10 μl של פתרון התרופה 1 מ&quot;מ לתוך צינור 8, להפעיל את הטיימר כדי ספירה לאחור מ 10 דק &#39;, ו לערבב בעדינות צינור עם pipet P200. צינור והחזר קרוב 37° גוש חום C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להרים שפופרת 2, ומערבבים בעדינות עם P200 (השתמש טיפ חדש), להוסיף 90 μl של ההשעיה התא קובט מצב לא מטופל, ומניחים fluorometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת ספקטרום סריג ב ננומטר עירור 430, bandpass 8 ננומטר, פליטת 450 - 600 ננומטר, bandpass 4 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה 9 דק &#39;- 10 שניות, ספייק צינור 9 ​​עם 10 μl של פתרון התרופה 1 מ&quot;מ, לערבב בעדינות עם P200 (השתמש טיפ חדש), ולחזור צינור לחמם גוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.10 - 5.11 עם צינור 3 ו 5.12 עם צינור 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 5.10 - 5.13 ב 1 במרווחי דקות (08:10, 07:10, וכו &#39;) עד ספקטרה נאסף עבור כל דגימות המצב לא המטופל, ואת התרופה נוספה לכל דגימות מצב סמים. השתמש טיפ טרי לכל שלב pipet כדי למנוע זיהום צולב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשעה 5 דק &#39;- 10 שניות, להתחיל ערבוב צינור 8 (מצב סמים) בעדינות עם pipet P200, להוסיף 90 μl של ההשעיה התא קובט נפרד עבור מדגם סמים מטופלים ומניחים fluorometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת Fספקטרום RET (ראה שלב 5.11 עבור הגדרות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 5.15 - 5.16 ב 1 במרווחי דקות (04:10, 03:10, וכו &#39;) עבור דגימות מצב תרופה נותרות (צינורות 9 - 12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניסוי נגמר, לשמור קבצי פרויקט, ביסודיות לשטוף cuvettes עם ultrapure H 2 O, ו מחדש מניות צינורות עבור התנאי הבא. תשמור על עצמך כדי למנוע זיהום צולב בשלב לשטוף. שנה את הטיפ על בקבוק O H 2 וכן על קו הוואקום בין השוטף. </li></ol> 6. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור וקבצי נתוני יצוא SPC לפרמט כדי לשמש לניתוח. תוכניות ניתוח זמינות להורדה מאתר האינטרנט של פרסום מעבדת Sivaramakrishnan. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת קבצי נתיב עבור תוכנת ניתוח הכוללים תוכניות הניתוח (v9, v15), קבצי דגימות untransfected (ראה שלב 5.6 לאיסוף ספקטרום תא untransfected), קובץ נתוני תפוקה, ו ערכים מופרדים בפסיקים (CSV) קבצים עבור הזנת נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זן המידע הבאלתוך קובץ CSV (ראה מדגם בטבלה 3) ולקבוע תנאים שמתאימים לכל מדגם, כולל: שם קובץ - קבצי גרף SPC פרט קולטן - המיועד אשר מבנה GPCR נבדק (למשל, Β2) בינדר - מיועד אשר גרסת פפטיד של המבנה נבדקה (למשל, S) אגוניסט - לייעד מטופל (N) או טיפול תרופתי (ד) תנאים מדריך - את נתיב התיקייה שבה הקבצים SPC נשמרים, בדרך כלל מאורגן לפי תאריך OD - רשם צפיפות אופטית של מדגם מתוך ספקטרופוטומטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זן שמות קבצים עבור דגימות untransfected (שלב 5.6) כדי להפחית חיץ ורעש פיזור ממדגמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זן תנאי לתוך תכנית ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכניות הפעלה לנתח דגימות בתוך תנאי פרט (v9) ועל פני תנאים (v15). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תכלול קבצים מדגמים שהן חריגות לכאורה בערכת הנתונים, או להתאים עבור חיסור ידי הגדלה או הקטנת ערך OD של indiviקבצים כפולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני יצוא לקובץ פלט עבור גישה מחושבת סריג יחסי (525 ננומטר / 475 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ΔFRET על ידי הפחתת יחס הסריג הממוצע עבור מצב לא מטופל מן יחסי סריג פרט תנאי מטופלים (סמים). </li></ol>

<ol><li>Malik, R. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+G+Protein-selective+G+Protein-coupled+Receptor+%28GPCR%29+Conformations+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of G Protein-selective G Protein-coupled Receptor (GPCR) Conformations in Live Cells.</a> J. Biol. Chem. 288, 17167-17178 (2013).</li>
<li>Oldham, W. M., Hamm, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotrimeric+G+protein+activation+by+G-protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Heterotrimeric G protein activation by G-protein-coupled receptors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 9, 60-71 (2008).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+%CE%B22+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Alexander, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetic+analysis+of+the+rhodopsin-G-protein+complex+links+the+%CE%B15+helix+to+GDP+release%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Energetic analysis of the rhodopsin-G-protein complex links the α5 helix to GDP release.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 21 (1), 56-63 (2014).</li>
<li>Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+three+amino+acids+switches+receptor+specificity+of+Gq%CE%B1+to+that+of+Gi%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Giα.</a> Nature. 363, 274-276 (1993).</li>
<li>Conklin, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxyl-Terminal+Mutations+of+Gq%CE%B1+and+Gs%CE%B1+That+Alter+the+Fidelity+of+Receptor+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Carboxyl-Terminal Mutations of Gqα and Gsα That Alter the Fidelity of Receptor Activation.</a> Mol. Pharmacol. 50, 855-890 (1996).</li>
<li>Onaran, H. O., Costa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Where+have+all+the+active+receptor+states+gone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Bio%22%5BJournal%5D)">Where have all the active receptor states gone.</a> Nat. Chem. Bio. 8, 674-677 (2012).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li>
<li>Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence%2Fbioluminescence+resonance+energy+transfer+techniques+to+study+G-protein-coupled+receptor+activation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling.</a> Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).</li>
<li>Vilardaga, J. P., Bünemann, M., Krasel, C., Castro, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+millisecond+activation+switch+of+G+protein-coupled+receptors+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Measurement of the millisecond activation switch of G protein-coupled receptors in living cells.</a> Nat. Biotechnol. 21, 807-812 (2003).</li>
<li>Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).</li>
<li>Stumpf, A. D., Hoffman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+probes+based+on+G+protein-coupled+receptors+-+added+work+or+added+value%5BTitle%5D)+AND+%22Brit.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Optical probes based on G protein-coupled receptors - added work or added value.</a> Brit. J. Pharmacol. 173, 255-266 (2016).</li>
<li>Sivaramakrishnan, S., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+control+of+protein+interaction+using+a+modular+ER%2FK+%CE%B1-helix+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Systemic control of protein interaction using a modular ER/K α-helix linker.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 20467-20472 (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

הטווח הדינמי החזק של מדידות סריג במערכת זו מחזק את הצורך של בקרת איכות רגישה בכל שלב של פרוטוקול זה. השלבים החשובים ביותר כדי להבטיח ניסוי סריג מוצלח הם 1) culturing תא, 2) transfection 3) ביטוי חלבון ו -4) בזמן, תיאום מדויק במהלך ביצוע assay. Cell בריאות ואיכות תחזוקה / ציפוי יכולות להיות השפעה משמעותית על אות לרעש של המערכת הניסיונית ובריאות תא עניה יכולים לעשות את זה בלתי אפשרי לזהות כל שינוי עקבי סריג. שמרני,...

G המצומדים קולטנים (GPCRs) הם קולטנים שבע הטרנסממברני. גנום האדם לבדו מכיל כ 800 גנים המקודדים GPCRs, אשר מופעלים על ידי מגוון של הליגנדים כולל אור, ניחוחי, הורמונים, פפטידים, תרופות ומולקולות קטנות אחרות. קרוב ל -30% מכלל התרופות כיום על GPCRs היעד בשוק משום שהם ממלאים תפקיד גדול מצבי מחלה רב 2. למרות עשרות שנים של עבודה מטה מקיפה נעשתה על מש&#39; קולטן זה, נותר שאלות מצטיינות משמעותיות בתחום, במיוחד לגבי המנגנונים המולקולריים לנהוג אינטראקציות מפעיל GPCR. נכון להיום, רק המבנה הגבישי ברזולוציה גבוהה אחד כבר פורסם, מתן תובנה אינטראקציה בין רצפטור β 2 -adrenergic (β 2 -AR) ואת חלבון G 3. יחד עם מחקר מקיף בשלושת העשורים האחרונים, זה חוזר על רכיב מבני ספציפי אחד כי הוא קריטי זהאינטראקציה: C- הסופי למקטע Gα. מבנה זה הוא חשוב עבור שתי הפעלת חלבון G על ידי מבחר חלבון GPCR 4 ו- G 5-6. לפיכך, הסופית- C Gα על זיקה מכרעת בין גירוי ליגנד של GPCR והפעלה G חלבון סלקטיבית. מחקר בעשור האחרון מצביע על כך GPCRs לאכלס נוף קונפורמציה רחב, עם ייצוב תת-מחייב ליגנד של תצורות GPCR. בעוד מספר טכניקות, כוללים קריסטלוגרפיה, NMR ספקטרוסקופיה קרינה, ו ספקטרומטריית מסה זמינות לבחון את נוף קונפורמציה GPCR, יש מחסור של גישות להבהיר המשמעות התפקודית שלהם בבחירת מפעיל 7. הנה, הנה תיאור של העברת אנרגיה תהודה Fӧrster (סריג), גישה מבוססת על לזהות תצורות GPCR חלבון-סלקטיבית G. סריג מסתמך על הקרב וכיוון במקביל של שני fluorophores עם פליטת חופפים (תורם) אnd עירור (acceptor) ספקטרה 8. ככל fluorophores התורם acceptor להתקרב יחד כתוצאה משני של שינוי קונפורמציה בחלבון או אינטראקציה חלבון-חלבון, סריג ביניהם גדל, והוא יכול להימדד באמצעות מגוון של שיטות 8. חיישנים ביולוגיים מבוסס סריג להיות מועסקים בהרחבה בתחום GPCR 9. הם שמשו לחקר שינויים קונפורמציה של GPCR ידי החדרת תורם acceptor בלולאה התאית השלישית GPCR C- הסופית; חיישנים עוצבו כדי לחקור GPCR ואינטראקציות מפעיל ידי בנפרד תיוג GPCR ו מפעיל (יחידות משנה חלבון G / arrestins) עם זוג סריג 10; חיישנים מסוימים גם לזהות שינויי קונפורמציה חלבון G 11. חיישנים ביולוגיים אלה אפשרו בתחום לשאול המון שאלות מצטיינים כולל שינויים קונפורמציה GPCR ו מפעיל, קינטיקה אינטראקציה GPCR-מפעיל, ו ligands האלוסטריים 12. הקבוצה שלנוהתעניין במיוחד ביצירת biosensor שיכול לזהות תצורות GPCR חלבון ספציפי G בתנאים מונחה אגוניסט. Biosensor זה מסתמך על טכנולוגיה שפותחה לאחרונה בשם עווית (אפנון כוח זיקת חלבון שיטתי) 13. עווית כרוכה תחומי חלבון אינטראקצית קשירה באמצעות מקשר ER / K, שולטת הריכוזית היעילה שלהם. איגוף ומקשר עם זוג fluorophores סריג יוצר כלי שיכול ולדווח על המצב של יחסי הגומלין בין חלבוני 12. בעבר 1 מודול התכווצות שימש לקשור את C- הסופית Gα על GPCR ולפקח הגומלין שלהם עם fluorophores סריג, mCitrine (המכונה בפרוטוקול זה על ידי גרסה שלה הידוע בכינויו, חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP), עירור / פליטה לשיא 490/525 ננומטר) mCerulean (המכונה בפרוטוקול זה על ידי חלבון ציאן פלורסנט וריאנט שלו הידוע בכינויו (CFP), עירור / פליטה השיא 430/475 ננומטר). מאת N- כדי C- סופי, tפוליפפטיד היחיד שלו המקודד גנטי מכיל: באורך מלא GPCR, סריג acceptor (mCitrine / YFP), 10 ננומטר ER / מקשר K, תורם סריג (mCerulean / CFP), ואת פפטיד הסופית- C Gα. במחקר זה, חיישנים מקוצרים כמו פפטיד GPCR המקשר אורך-Gα. כל הרכיבים מופרדים על ידי מקשר בלתי מובנה (גלאי-שיר-גלאי) 4 המאפשר סיבוב חופשי של כל תחום. האפיון המפורט של חיישנים כאלה בוצע בעבר בעזרת שתי GPCRs אבטיפוס: β 2 -AR ו opsin 1. חיישן זה הוא transfected זמני לתאי HEK-293T, ספקטרום קרינת מידת ניסויי תא חי מבוסס fluorometer של זוג הסריג ביחידות כלשהן של ספירה לשנייה (CPS) בנוכחות או בהעדר ליגנד. מדידות אלה משמשים לחישוב יחס סריג בין fluorophores (YFP מקסימום / מקס CFP). שינוי סריג (ΔFRET) לאחר מכן מחושב על ידי הפחתת יחס סריג הממוצעשל דגימות מטופל מייחס הסריג של דגימות מטופלים ליגנד. ΔFRET ניתן להשוות ברחבי בונה (β 2 -AR-10 ננומטר-Gαs פפטיד לעומת בטא 2 -AR-10 ננומטר-אף פפטיד). כאן, אנו בפירוט את הפרוטוקול להביע חיישנים אלה בתאי HEK-293T חיים, לפקח הביטוי שלהם, ואת ההתקנה, ביצוע, והניתוח של התא החי מבוסס fluorometer סריג מדידת מטופל מול תנאי מטופלים בתרופה. בעוד פרוטוקול זה הוא ספציפי עבור חיישן פפטיד β 2 -AR-10 ננומטר-Gαs שטופלו 100 מיקרומטר bitartrate isoproterenol, זה יכול להיות מותאם במיוחד בזוגות הליגנדים GPCR-Gα שונים.

<table><tbody><tr><td>B2-AR-10 ננומטר-חיישן פפטיד גז</td><td>Addgene</td><td>47438</td><td>https://www.addgene.org/Sivaraj_Sivaramakrishnan/</td></tr> <tr><td>GeneJET פלסמיד מיני-פרפ ערכת</td><td>Fermentas/Fisher Sci</td><td>FERK0503</td><td>Elute in 2 מ"מ Tris מאגר פליטה</td></tr><tr><td>תאי HEK-293T-Flp-n Life</td><td>Technologies</td><td>R78007</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין (0.25%)</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>DMEM- גלוקוז גבוה</td><td>Life Technologies</td><td>11960-044</td><td>חם ב&nbsp; 37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>FBS, מוסמך, מושבת בחום, שמקורו בארה"ב</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I 100x</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>MT25060CL</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td>מדיית סרום מופחתת; הביאו ל-RT לפני השימוש</td></tr><tr><td>XtremeGene HP transfection reagenet</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>מומלץ מאוד בשל העקביות שלו. הביאו ל-RT לפני השימוש</td></tr><tr>שימוש<td>ב-FluoroMax 4</td><td>Horiba</td><td></td><td>עם תוכנת FluorEssence V3.8</td></tr><tr><td>קובטת קוורץ באורך נתיב 3 מ"מ</td><td>Starna</td><td>NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5)</td> <td>עשוי לדרוש מחזיק/מתאם קובטה לשימוש בפלואורומטר, זמין מ-Starna</td></tr><tr><td>Sc100-S3 משאבת אמבט מים מחוממת במחזור</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-874-826</td><td>חם ל-37 מעלות; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>Thermomixer Heat Block</td><td>Eppendorf</td><td>22670000</td><td>חם ל-37 מעלות; C לפני השימוש</td></tr><tr><td>מים נטולי DNA/RNAse טהורים</td> במיוחד <td>Life Technologies</td><td></td><td>10977015 שימוש ב-RT</td></tr><tr><td>D(+)-גלוקוז,</td> אסימא <td></td><td>G5767</td><td></td>נטול מים</tr><tr><td>אפרוטינין מריאות בקר</td><td>סיגמא</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>לופפטין המיסולפט</td><td>EMD</td><td>10-897</td><td></td></tr><tr><td>חומצה L-אסקורבית, דרגת ריאגנט</td><td>סיגמא</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>(-)- איזופרוטרנול (+)-ביטרטרט</td><td>סיגמא</td><td>I2760</td><td>השתמש בכל ניסוי טרי</td></tr></tbody></table>

g- חלבון סלקטיבית gpcr תצורות נמדדו באמצעות סריג חיישנים ב assay fluorometer השעית תא חי

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

העברת אנרגית תהודת Fӧrster (סריג) מבוססת מחקרים הפכו נפוצים יותר ויותר בחקירת איתות GPCR. קבוצת המחקר שלנו יצרה חיישן סריג תוך מולקולרי כדי לזהות את האינטראקציה בין Gα יחידות משנה ו GPCRs בתאים חיים בעקבות גירוי אגוניסט. כאן, אנו בפירוט את הפרוטוקול לאיתור שינויים סריג בין קולטן β 2 -adrenergic ואת פפטיד C הסופית- Gαs על טיפול עם 100 מיקרומטר hydrochloride isoproterenol כפי שאפיינו 1. חיישן הסריג שלנו הוא פוליפפטיד יחיד המורכב סדרה של GPCR באורך מלא, fluorophore acceptor סריג (mCitrine), גידול ER / K עווית (אפנון כוח זיקת חלבון שיטתי) מקשר, fluorophore התורם סריג (mCerulean), וכן Gα C פפטיד -terminal. פרוטוקול זה התקנת פרט תא יהיה בהכנה, תנאי transfection, ציוד, ביצוע assay, וניתוח נתונים. עיצוב ניסיוני זה מזהה ch הקטןAnges ב הסריג מעיד על אינטראקציות בין חלבונים, והוא יכול לשמש גם כדי להשוות את עוצמת האינטראקציה ברחבי הליגנדים ואת זיווגי חלבון GPCR-G. כדי לשפר את האות לרעש במדידות שלנו, פרוטוקול זה דורש דיוק מוגבר בכל השלבים, והוא מוצג כאן כדי לאפשר ביצוע לשחזור.

סכימטי כללי של הגדרת הניסוי וביצוע מפורט באיור 3. כדי להבחין בשינוי סריג בטווח הדינמי הצר של החיישן, זה קריטי לדבוק הניואנסים של המערכת להיות דבק. איכות תא קיימת הכרח ביטוי חלבון וכן עקביות דגימה. איור 1 תכונות תמונות של תאים בתרבית גדלו בשכבה עקבית (10X) כי הוא אופטימלי עבור שש גם ציפוי ו transfection איור 1 (א) ותאים הגדלים בדפוסים בכבדות להוביל כי לצורות הדנדר...

שיטות פשוטות לזיהוי הפעלה סלקטיבית של חלבוני G על ידי קולטנים מצומדים לחלבון G נותרו אתגר יוצא דופן באיתות תאים. כאן, חיישנים ביולוגיים של העברת אנרגיית תהודה (FRET) של Fӧrster פותחו על ידי קשירה זוגית של פפטידי חלבון GPCR ל-G כדי לחקור שינויים קונפורמטיביים בריכוזים מבוקרים בתאים חיים.

G- חלבון סלקטיבית GPCR תצורות נמדדו באמצעות סריג חיישנים ב assay fluorometer השעית תא חי

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

המטרה הכללית של בדיה זו, המבוססת על העברת אנרגיה במהודקים (Forster resonance energy transfer) או FRET בתאים חיים, היא להעריך קונפורמציות של קולטנים המצומדים לחלבון G (GPCR) הסלקטיביים לחלבון G תחת תנאי אגוניסטים שונים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום ה-GPCR בנוגע לאינטראקציות של GPCR עם אפקטורים שונים ולהשפעתם של תרופות שונות על קונפורמציית הקולטן. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהחיישנים הם מודולריים, וניתן להנדס אותם מחדש בקלות עבור שילובים שונים של GPCR ופפטידים של G alpha, כולל היחידה המלאה ותת-היחידה של G alpha.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי בחירת חלבוני G ותגובה לליגנדים שונים, ניתן להשתמש בה גם כדי לבחון את ההשלכות הפיזיולוגיות של הפעלה דיפרנציאלית של חלבוני G. לפני תחילת הפרוטוקול, יש לגדל את התאים הרלוונטיים במצע מלא בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחית עם 5% CO2 עד שהתרביות יגיעו למצב של התכנסות (confluency).בשלב הבא, נתקו את התאים באמצעות Trypsin והעבירו את התרביות בריכוז של 8 × 10⁵ תאים לכל באר, ב-2 מ"ל מדיום, לתוך צלחות שש-בארים שעברו טיפול לתרביות רקמה, למשך 16 עד 20 שעות של תרבית. לאחר 16 עד 20 שעות, כאשר התאים כבר נצמדו לצלחות, הכינו תגובת טרנספקציה אחת לכל באר בתוך קבטן ביולוגי, ואפשרו לתערובת הרכיבים להגיע לשיווי משקל במשך 15 עד 30 דקות. עם סיום הדגירה, הוסיפו תגובה אחת לכל תרבית תאים בטפטוף על פני הבאר.יש לנער בעדינות את הפלטה כדי להבטיח פיזור יסודי של הרכיב בכל התרביות. לאחר מכן, החזירו את הפלטה למדגרה לתרביות תאים. לאחר 20 שעות, נתחו את התרביות לבדיקת ביטוי חלבון של ממברנת הפלסמה והעריכו את בריאות התאים.אם נצפה פילוס (internalization) משמעותי של החלבון, יש לעקוב אחר התהליך עד שתימדד ביטוי משמעותי בממברנה הפלזמית. הערכת רמת ביטוי החלבון חיונית להגדרת מערך ניסוי אופטימלי. במקרה שהטרנספקציה של התאים הייתה דלה או שביטוי החלבון נמוך מדי, יש להמתין לפני קצירת התאים.אחרת, האות הפלואורסצנטי עשוי להיות לא מספיק לצורך ניתוח. כאשר התאים מוכנים לקצירה, העבירו אותם לקבינה לבטיחות ביולוגית והסירו בעדינות 1 mL של מצע. באמצעות פיפט P1000, השביעהו מחדש את התאים ב-1 mL מהמצע שנותר לכל באר, והעבירו את תרחיפי התאים לשפרויות מיקרוצנטריפוגה נפרדות של 1.5 mL.ספרו את התאים ושקיעו אותם על ידי סבב צנטריפוגה. הסירו את המצע מהמשקע התאי. השביעו בעדינות את הנוזל העליון ב-1 mL של בופר תאים בטמפרטורה של 37 °C וחזרו על הסבב בצנטריפוגה.ששוף שוב את המשקע בריכוז של ארבעה כפול 10 בחזקת 6 תאים למיליליטר בבופר תאים טרי לאחר הסבב השני. לאחר מכן, הוסף 90 µL של תאי ביקורת לקובטה ורכוש את ספקטרום ה-FRET של הביקורת. לאחר איסוף של שלושה עד חמישה ספקטרומי ביקורת חוזרים עם 90 µL טריים של תאים עבור כל מדידה, חזור על שלבי הסספנסיה, הסבב והשטיפה עבור התאים שעברו טרנספקציה.העבירו מנה של 90 µL של תאים שעברו טרנספקציה לכל מבחנה של 500 µL במחזיקים שתיים עד שש ושמונה עד 12 בבלוק חימום, תוך כדי רסספנסיה עדינה של התאים בין כל מנה. לאחר העברת כל התאים, הוסיפו 10 µL של באפר תרופה למבחנות שתיים עד שש עבור דגימות הביקורת (ללא טיפול). לאחר מכן, הוסיפו 10 µL של תמיסת תרופה בריכוז 1 mM למבחנה שמונה.הפעילו טיימר לספירה לאחור של 10 דקות והשתמשו בפיפט P200 כדי לערבב בעדינות את תכולת המבחנה. סגרו את המבחנה לאחר הערבוב והחזירו אותה לבלוק החימום. לאחר מכן, קחו מיד את מבחנה מספר שתיים.ערבבו את התכנים בעדינות בעזרת טיפ חדש. הוסיפו 90 µL של תרחיף התאים שעברו טרנספקציה לקובטה של תנאי הביקורת (ללא טיפול) והניחו את הקובטה בתוך הפלואורומטר. השג את ספקטרום ה-FRET עבור הדגימה תוך שימוש באותם פרמטרים ששימשו עבור ספקטרומי הביקורת.בדקה התשע ובשנייה ה-10, הוסיפו לשפ管 תשע 10 µL של תמיסת התרופה בריכוז 1 mM. ערבבו בעדינות את תכולת השפערור והחזירו אותו לבלוק החימום. לאחר מכן, קחו מיד את שפערור שלוש, ערבבו ומדדו את תכולת הקובט כפי שהודגם זה עתה עבור שפערור שתיים.בדקה החמישית ושנייה העשירית, ערבבבב בעדינות את מבחנה שמונה באמצעות פיפט P200. הוסף 90 microliters של תמיס התאים לקובטה נפרדת עבור מדידת הדגימה שעברה טיפול בתרופה, והשג את ספקטרום ה-FRET עבור דגימת תנאי התרופה. לאחר השגתן של כל הספקטרומים, שמור את קבצי הפרויקט.שטפו ביסודיות את הקיווותות במים אולטרה-טהורים ומלאו מחדש את המבחנות עבור התנאי הבא. בתמונה זו מוצגת שכבה Ein-cell (monolayer) הומוגנית של תרבית תאים, המהווה מצב אופטימלי לזריעה בלוח בעל שש בארות ולטרנספקציה. עם זאת, תאים הגדלים בתבניות גושים המובילות לצורות דנדריטיות אינם מומלצים לזריעה עקבית ולניתוח מדויק של ביטוי חלבונים או למדידת FRET.ניתן לבצע אופטימיזציה גם לתנאי הטרנספקציה כדי להשיג ביטוי הניתן לשחזור. לאחר שכל הנתונים נאספו והוכנסו לקובץ CSV לצורך ניתוח, התוצאות שיתקבלו יהיו דומות לספקטראי ממוצעי FRET נורמליזציה ו-RAW מייצגים אלו. כל ספקטראי ה-RAW FRET מניסוי מייצג זה מדגימים טווח אות לרעש חלק ומספיק, המאפשר ניתוח נתונים עקבי עם שיא מים מינימלי מהדגימה.כאשר הנתונים מנורמלים באורך גל של 475 nanometers, מספר הספירות לשנייה של ערך זה נקבע ל-1.0, והשינוי המשמעותי בקריאה באורך גל של 525 nanometers בין הדגימות הטיפוליים לדגימות שאינן מטופלות הופך גלוי. אם ביטוי החלבון נמוך, או אם יעילות הטרנספקציה נמוכה או צפיפות התאים בקיובטה לקריאת הפלואורסצנציה נמוכה, נתוני ה-RAW עלולים להיות רועשים, מה שיגרום לבעיה בהפחתת הרקע ובנרמול, ויוביל לספקטרה שאינה מסתנכרנת ולא ניתן לנתח אותה. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן להשלים אותה בתוך 25 דקות אם היא מבוצעת כראוי.במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנהוג בעדינות בעת טיפול בתאים בכל שלבי הניסוי. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן להרחיב את הטכניקה כדי לבחון חיישני FRET שונים עבור רספטורים שונים, תרופות ואפקטורים שונים וסוגי תאים שונים. לאחר פיתוחה, תרמה טכניקה זו לתחום ה-GPCR, כאשר מחקרים אחרונים שהשתמשו בחיישנים אלו שפכו אור על המנגנון המולקולרי של בחירת חלבוני G.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להעריך קונפורמציות ספציפיות של GPCR באמצעות בדיקת מדידה של מבנה FRET tether בתאי חיים. זכרו כי עבודה עם תרביות של תאי יונקים ותרופות ניסיוניות מסוימות עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי מתאים, בעת ביצוע הליך זה.

g-protein-selective-gpcr-conformations-measured-using-fret-sensors

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר כיצד חלבונים תמונה אינטראקציות באמצעות assay סריג מבוססי הקרבה.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

על ידי שימוש לפתור spectrally שני הפוטונים מערכת הדמיה מיקרוסקופית, פיקסל ברמה מפות של העברת אנרגיה תהודה פורסטר (סריג) יעילות מתקבלים עבור תאים להביע את קולטני קרום השערה כדי ליצור הומו-oligomeric קומפלקסים. מן סריג מפות יעילות, אנו מסוגלים להעריך מידע stoichiometric על המתחם oligomer תחת מחקר.

ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית

כאן אנו מתארים מפורט לחיות הדמיה תא שיטות החקירה chemotaxis. אנו מציגים שיטות מיקרוסקופיות הקרינה לפקח על הדינמיקה של spatiotemporal איתות אירועים בתאים נודדות. מדידה של אירועים איתות מאפשר לנו עוד להבין כיצד רשת GPCR-איתות משיגה שיפוע חישה של chemoattractants בקרות כיווני ההגירה של התאים האיקריוטים.

קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium</em

העברת אנרגית פורסטר תהודה (סריג) מיקרוסקופית היא טכניקה רבה עצמה לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות חיישנים ביולוגיים שונים כעיתונאים. כאן אנו מתארים כיצד לבנות epifluorescence אישית סריג מערכת הדמיה ממרכיבים מסחריים זמינים וכיצד להשתמש בו לניסויי סריג.

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

Assay הגיוס שתואר כאן הקרינה מבוססת סידן הוא מערכת הקרנת פרמקולוגיה ההפוכה בינוני תפוקה לזיהוי ליגנד תפקודי הפעלה (ים) של קולטני G-חלבון בשילוב יתום (GPCRs).

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

GPCR-β-מפיגור אינטראקציות הם שדה המתעוררים בגילוי סמים GPCR. מדויק, מדויק וקל להגדיר שיטות נחוצים כדי לפקח על אינטראקציות כאלה במערכות החיים. אנו מראים שיטת compleמנטציה מבנית לניטור GPCR-β-בפיגור בתאי החיים בזמן אמת, וזה יכול להיות מורחב לכל GPCR.

מעקב GPCR-β-arrestin1/2 אינטראקציות בזמן אמת מערכות חיים כדי להאיץ את גילוי הסמים

בהינתן כי GPCRs הם מטרות druggable אטרקטיבי, gpcr ליגנד הקרנה היא הכרחית ובכך לזיהוי תרכובות עופרת ולמחקרים de aniטיזציה. לקראת מאמצים אלה, אנו מתארים את פרסטו-טנגו, פלטפורמת משאב מקור פתוח המשמש ליצירת פרופיל סימולטני של גיוס β-arrestin2 ארעי ב כ 300 GPCRs באמצעות שיטת העיתונאי מבוסס TEV.

חקירה מקבילה של גיוס β-Arrestin2 עבור ליגיון הקרנה בקנה מידה מוקטן של הסרט באמצעות שיטת הטנגו-פרסטו

מחקר זה מציג הליך מפורט לביצוע ניסויים של העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת (smFRET) על קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) באמצעות תיוג ספציפי לאתר באמצעות שילוב חומצות אמינו לא טבעיות (UAA). הפרוטוקול מספק מדריך שלב אחר שלב להכנת דגימות smFRET, ניסויים וניתוח נתונים.

הדמיה של הדינמיקה הקונפורמציונית של קולטני ממברנה באמצעות FRET של מולקולה בודדת

בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

הפרוטוקול המוצג במחקר זה ממחיש את יעילותו של cAMP Difference Detector In Situ  במדידת cAMP בשתי שיטות. שיטה אחת משתמשת בספקטרופוטומטר קריאת לוחות 96 בארות עם תאי HEK-293. השיטה השנייה מדגימה תאי HASM בודדים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

דינמיקת cAMP בזמן אמת בתאים חיים באמצעות גלאי ההבדל cAMP פלואורסצנטי באתרו

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בחיישנים ביולוגיים מבוססי BRET למדידה בזמן אמת של הפעלת חלבון G בתאי HEK293 חיים על גירוי ליגנד קולטן מצומד לחלבון G. כאן, קולטן β2-אדרנרגי וקולטן קנבינואיד מסוג 1 משמשים כדוגמאות להדגמת היעילות של חיישנים עבור מספר תת-סוגים של חלבון G ועל פני GPCRs שונים.

חיישנים ביולוגיים של חלבון G מבוססי BRET למדידת פעילות קולטן מצמד חלבון G בתאים חיים

חקור תצורות GPCR סלקטיביות לחלבון G באמצעות מערכת חיישני FRET בתאים חיים. שיטה זו מאפשרת הערכת השפעת אגוניסטים שונים על קולטנים ומספקת תובנות לגבי מנגנוני פעולת תרופות בביולוגיה של תאים.

G- חלבון סלקטיבית GPCR תצורות נמדדו באמצעות סריג חיישנים ב assay fluorometer השעית תא חי

גלה סרטונים נוספים