Name: מתח ומות תא מפעיל באמצעות מיקרוסקופ Confocal הקונבנציונלי UV הליזר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: למדו שיטת אבלציית לייזר UV במיקרוסקופ קונפוקלי לחקר מוות תאי ותגובות מיקרוגליה בזברה דניו רריו. שיטה זו מאפשרת ניטור מדויק של תהליכים נוירודגנרטיביים בחיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מכון המחקר MND של אוסטרליה וקרן Cure for MND [GIA 1638], קרן Snow ואוניברסיטת Macquarie [MQRDG 9201401462]. ההדמיה בוצעה במתקן המיקרוסקופיה במחלקה למדעים ביו-רפואיים, אוניברסיטת מקווארי. חברים אחרים במרכז המחקר MND מודים על תרומתם לפיתוח שיטות וחוטי דגים אלה.

<ol><li>Becker, T. S., Rinkwitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+genomics+model+for+human+neurological+and+polygenic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a genomics model for human neurological and polygenic disorders.</a> Dev Neurobiol. 72 (3), 415-428 (2012).</li>
<li>Wilt, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+light+microscopy+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Advances in light microscopy for neuroscience.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 435-506 (2009).</li>
<li>Philips, T., Robberecht, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+role+of+glial+activation+in+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation in amyotrophic lateral sclerosis: role of glial activation in motor neuron disease.</a> Lancet Neurol. 10 (3), 253-263 (2011).</li>
<li>Robberecht, W., Philips, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+scene+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nat Rev Neurosci. 14 (4), 248-264 (2013).</li>
<li>White, D. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitroreductase+system+of+inducible+targeted+ablation+facilitates+cell-specific+regenerative+studies+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish.</a> Methods. 62 (3), 232-240 (2013).</li>
<li>Jagadeeswaran, P., Paris, R., Rao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+thrombosis+in+zebrafish+larvae%3A+a+novel+genetic+screening+method+for+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Laser-induced thrombosis in zebrafish larvae: a novel genetic screening method for thrombosis.</a> Methods Mol Med. 129, 187-195 (2006).</li>
<li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+ablation+of+the+zebrafish+pronephros+to+study+renal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration.</a> J Vis Exp. (54), e2845(2011).</li>
<li>Matrone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-targeted+ablation+of+the+zebrafish+embryonic+ventricle%3A+a+novel+model+of+cardiac+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair.</a> Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).</li>
<li>Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+Ca2%2B+waves+transmit+brain-damage+signals+to+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia.</a> Dev Cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).</li>
<li>Lewis, G. M., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+nerve+transection+and+time-lapse+imaging+of+glial+cell+behaviors+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li>
<li>Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+nerve-macrophage+interactions+following+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury.</a> J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).</li>
<li>Villegas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+degeneration+and+regeneration+in+developing+zebrafish+peripheral+axons+reveals+a+requirement+for+extrinsic+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types.</a> Neural Dev. 7, 19(2012).</li>
<li>O'Brien, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Soustelle, L., Aigouy, B., Asensio, M. L., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV+laser+mediated+cell+selective+destruction+by+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">UV laser mediated cell selective destruction by confocal microscopy.</a> Neural Dev. 3, 11(2008).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biol. 8 (6), 1000412(2010).</li>
<li>Essentials of Biology 2. JoVE. , JoVE Science Education Database. Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques (2016).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="https://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).Vol.4th ed</a>. , Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Clark, K. J., Urban, M. D., Skuster, K. J., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+using+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish using transposable elements.</a> Methods Cell Biol. 104, 137-149 (2011).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cranial+motor+neurons+in+live+transgenic+zebrafish+expressing+green+fluorescent+protein+under+the+control+of+the+islet-1+promoter%2Fenhancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer.</a> J Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).</li>
<li>Arkhipova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+regulation+of+the+hb9%2Fmnx1+beta-cell+progenitor+specific+enhancer+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish.</a> Dev Biol. 365 (1), 290-302 (2012).</li>
<li>Flanagan-Steet, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+synapses+can+form+in+vivo+by+incorporation+of+initially+aneural+postsynaptic+specializations%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations.</a> Development. 132 (20), 4471-4481 (2005).</li>
<li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+alpha2-deficient+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), 49-56 (2011).</li>
<li>Morsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+microglial+engulfment+of+dying+neurons+in+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord.</a> Front. Cell. Neurosci. , (2015).</li>
<li>Grunwald, D. J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Headwaters+of+the+zebrafish+--+emergence+of+a+new+model+vertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Headwaters of the zebrafish -- emergence of a new model vertebrate.</a> Nat Rev Genet. 3 (9), 717-724 (2002).</li>
<li>Lele, Z., Krone, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+system+in+developmental%2C+toxicological+and+transgenic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model system in developmental, toxicological and transgenic research.</a> Biotechnol Adv. 14 (1), 57-72 (1996).</li>
<li>Veldman, M. B., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).</li>
<li>Kabashi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+and+loss+of+function+of+ALS-related+mutations+of+TARDBP+%28TDP-43%29+cause+motor+deficits+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Gain and loss of function of ALS-related mutations of TARDBP (TDP-43) cause motor deficits in vivo.</a> Hum Mol Genet. 19 (4), 671-683 (2010).</li>
<li>Laird, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+is+neurotrophic+in+vivo+and+protects+against+a+mutant+TDP-43+induced+axonopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progranulin is neurotrophic in vivo and protects against a mutant TDP-43 induced axonopathy.</a> PLoS One. 5 (10), 13368(2010).</li>
<li>Lemmens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+mutant+superoxide+dismutase+1+causes+a+motor+axonopathy+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Overexpression of mutant superoxide dismutase 1 causes a motor axonopathy in the zebrafish.</a> Hum Mol Genet. 16 (19), 2359-2365 (2007).</li>
<li>Ramesh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+in+zebrafish+displays+phenotypic+hallmarks+of+motoneuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease.</a> Dis Model Mech. 3 (9-10), 652-662 (2010).</li>
<li>Hanneman, E., Trevarrow, B., Metcalfe, W. K., Kimmel, C. B., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+pattern+of+development+of+the+hindbrain+and+spinal+cord+of+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Segmental pattern of development of the hindbrain and spinal cord of the zebrafish embryo.</a> Development. 103 (1), 49-58 (1988).</li>
<li>Lewis, K. E., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cells+to+circuits%3A+development+of+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord.</a> Prog Neurobiol. 69 (6), 419-449 (2003).</li>
<li>Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-cell+autonomous+toxicity+in+neurodegenerative+disorders%3A+ALS+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond.</a> J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).</li>
<li>Philips, T., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Glial cells in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Exp Neurol. 262, Pt B 111-120 (2014).</li>
<li>Mazaheri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+BAI1+and+TIM-4+in+the+engulfment+of+dying+neurons+by+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia.</a> Nat Commun. 5, 4046(2014).</li>
<li>van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cells+are+cleared+by+directional+migration+and+elmo1-+dependent+macrophage+engulfment%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment.</a> Curr Biol. 22 (9), 830-836 (2012).</li>
<li>Radford, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+established+and+emerging+roles+of+astrocytes+and+microglia+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The established and emerging roles of astrocytes and microglia in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia.</a> Front Cell Neurosci. 9, 414(2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

גישות אבלציה לייזר ליזר בסיוע טכניקות אבלציה לאפשר המיקוד המדויק של קבוצות בודדות או קטנות של תאים. שילוב טכניקה זו עם מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה מניפולציות גנטיות במודלים של בעלי חיים כגון דג זברה מאפשר לחוקרים לבחון את גורלו של תא יחיד שיטתיים ואת האינטראקציות לאחר פציעה. ה- UV (405 ננומטר) פרוטוקול אבלציה לייזר המתואר כאן מתאר כיצד תאים בודדים ניתן הדגיש או נהרג סלקטיבי (באופן תלוי מינון), בעוד השכנה נוירונים, גליה, ואת האקסונים נותרים ללא פגע. יש לנו מנוצל בהצלחה גישה זו בניסויים בתרביות תאים ולתאר כאן הגישה מפורטת חוט השדרה דג הזברה. אנו מראים יישום של גישה זו בחוט השדרה דג הזברה על ידי הדגשת נוירון יחיד סלקטיבי בתוך רשת של תאים אחרים (איור 5, A ו- <strong&gt; B), או על ידי הריגת נוירון בודד מיד וללא התאוששות (איור 5, C ו- D). בעבר, מערכות לייזר מתמחה, כגון לייזר פעמו-חנקן או מערכות לייזר שני הפוטונים, נדרשו כדי לגרום נזק לרקמות עצב מוטוריים transections 10, 11, 12, 13. מערכות לייזר אלה נוצלו בהצלחה לגרום נזק לתאים, כגון פקקת עורקים וורידים 6, פציעה 7 כליות חריפה, הלב פציעה 8, וכדי ללמוד גלי סידן ותגובה microglial לאחר פגיעה מוחית 9. יתר על כן, סוסטל ועמיתיו השתמשו ההתקנה confocal קונבנציונאלי (351 ננומטר ו 364 ננומטר לייזרים UV) כדי לגרום נזק אפיתל ותאי גלייה ב תסיסנית 14 &lt;/ Sup&gt;. רלוונטי של מודלי דג זברה עבור הבנת ALS (ומחלות אדם אחרות) דג הזברה הם אורגניזם מודל בשימוש נרחב, במיוחד ללימודי התפתחותי 28, 29, 30. אמנם יש להם מגבלות מסוימות, את הפוטנציאל שלהם לבנות מודל מחל אנושיות ולתת הבנה של מנגנונים מולקולריים פתוגניים הוא עצום. מודלי דג זברה הוקמו היטב לחקר MND ו הובילו לתובנות מולקולריים חשובים 31, 32, 33, 34. קווי דג הזברה מהונדס יכול להיווצר במהירות (4 - 5 חודשים) ולאפשר מעקב סלקטיבית של תאים מסוג מסוים, תכונות ההופכות אותם תוספת רבת ערך במודלים של בעלי חיים הנוכחי של ALS. עוברי דג זברה / זחלים הם אופטיים שקופים להציע התנסות ייחודיתיתרונות נפשיים המאפשרים הדמיה חי לטווח ארוך ברמה מהתא הבודד במוח או בחוט השדרה, אשר לא ניתן להשיג בקלות במודלים של מכרסמים (או בבני אדם). בשילוב עם שיטות מולקולריות, כגון אבלציה תא בודד, זה מספק פלטפורמת ניסיוני ייחודית לחקר מנגנונים מולקולריים מדויקים in vivo. הנוירונים המוטוריים ניתן לכוון באופן סלקטיבי באמצעות UV לייזר אבלציה הנוירונים שדרת דג הזברה מתחילים להתפתח בתוך 10 שעות לאחר הלידה, שהוקמו לאחר כ 48 שעות 35, 36. זו התפתחות מהירה מאפשרת ההדמיה של נוירונים אלה במסגרות זמן קצרות ועם קצב העברת נתונים גבוהים. הנוירונים מוטוריים לספק את הקשר ההכרחי בין המוח ושרירים, ב ALS, מושפעות הקורטקס המוטורי (נוירונים מוטורי עליון), גזע המוח, ואת חוט השדרה (הנוירונים מוטוריים נמוכים). אובדן הנוירונים האלה מוביל בהכרח muניוון וחולשה scle. הנוירונים מוטוריים בחוט של דג זברת השדרה ניתן לזהות על ידי התחזיות המובהקות שלהם ועל ידי השימוש של יזמים ספציפיים הנוירון מוטורי כמו -3MNX1. מיקוד סומה תא של נוירונים מקרין כזה חשף את ניוון האנטרוגרד לאורך הקרנת axonal לאורך זמן (איור 4 ווידאו 1). הדמיה ברזולוציה מתחיל מתא בודד הנוירונים המוטוריים השדרה בנוסף אישר טרנסלוקציה phosphatidylserine ו Annexin V-תיוג הסוגר לאחר אבלציה לייזר (ראה איור 4 משלים וידאו 3 הפניה 27). למרות אנו מדווחים על ההפעלה של Annexin V בלמות נוירונים לאחר גישה אבלציה לייזר UV שלנו, אנחנו לא יכולים להיות בטוחים כי מפל המוות כי היא מופעלת במהלך תהליך מואץ זה תואם בדיוק את ומוות עצבי המתרחשת במהלך ניווניות של מערכת העצבים או הומאוסטזיס תא נורמלי. בעוד גישה זו אבלציה היא מאוד לשחזורוספציפיות, אסטרטגיות הטבעה שונות עשויות גם להשפיע על היעילות של אבלציה UV. מניסיוננו, זה היה מוצלח ביותר כדי למזער את שכבת agarose אנו מוטבעים הדגים שלנו. שכבות דקיקות של הטבעה בינונית עם שכבה נוספת של מי ביצה עשוי להפחית את כוח UV קבל בסופו של דבר על ידי התא בשל הנחתה ואפקטי פיזור המתרחשים לאורך נתיב קרן. בעתיד, חציית קווי דג מהונדסים שונים תאפשר ההדמיה של לטווח קצר מיידית (עד 12 שעות) תגובות של תאים נגועים אחרים, כגון גליה, להרס תאים שנגרם ע&quot;י הליזר. לדוגמא, astrocyte ורעילה אוטונומיים בלתי תא בהפרעות ניווניות כגון ALS כבר באור זרקורי המחקר מעורב בכבדות פתוגניות של ALS ספורדי והמשפחתי 37, 38. עם זאת, המנגנונים רעילים גליה סלקטיביותכלפי מנוע נוירונים עדיין אינם ברורים. אנחנו ואחרים נצלו לאחרונה של גישה זו ללמוד לבליעה למות נוירונים ידי המיקרוגליה דמיינו סליקת שרידים עצביים 27, 39, 40. שילוב הטכניקה אבלציה עם מיקרוסקופיה וסמנים ברזולוציה גבוהה neuroinflammation יאפשר לחוקרים בעתיד להרחיב את ההבנה של תפקוד תא בודד ומערכות תאים מחוברות. אפיון התהליכים האלה בסביבת in vivo הוא קריטי לא רק במסגרות התפתחותיות אלא גם במודלים של מחלות ניווניות, כולל MND, שבו אינטראקציות הסלולר עלולות להיפגע 3, 41.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי כבר זמן רב בשימוש כדי לחקור את ההשפעות של transgenes במערכת העצבים המרכזית דג הזברה, במיוחד והשפעתם על פיתוח 1. מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה אפשרה מיפוי מפורט של התהליכים התאיים מעורבים בהתפתחות מוח, דור שריר, ואירועים התפתחותיות אחרים רבים 2. לימוד מותו של תא יחיד כבר יותר מאתגר, בעיקר בשל הקשיים הטכניים של גרימת מוות של תאים סלקטיבי במהלך הליכי הדמיה סטנדרטיים. עם זאת, שילוב של הדמיה ברזולוצית תא בודד וטכניקות אבלציה ממוקדות במיוחד מאפשר חקירת תגובות הסלולר מיידיות מתח פציעה, כמו גם של אינטראקציות תאי תאים הסוגרות. הבנת התהליכים הללו הוא קריטי, במיוחד עבור מחלות ניווניות כגון מחלת הנוירון המוטורי (MND), שבו אינטראקציות גליה נוירון הוכחו לתרום להתקדמותשל המחלה 3. MND, או טרשת לרוחב amyotrophic (ALS), היא מחלה ניוונית של מערכת העצבים הרסנית המשפיעה הנוירונים המוטוריים בגזע המוח, הקורטקס המוטורי, וחוט השדרה. אובדן הנוירונים האלה מוביל לאובדן שריר, וחולה למות תוך 3 - 5 שנים של אבחון 4. הנוירונים המוטוריים בקישור חוט השדרה אל סיבי השריר ויש להם תפקיד חיוני בהנחיית התכווצות שרירים. ניתק בתקשורת זו או מוות של נוירונים אלה בהדרגה מחליש את השרירים ומשפיע על היכולת של החולה לבלוע, ללכת, לדבר, לנשום. לדמיין את מותו של הנוירון מוטורי ואת ההשלכות לטווח קצר חי מספק הזדמנות מצוינת להבין טוב יותר את התהליכים הדינמיים מעורבים הומאוסטזיס ומחלות תא נורמלי. דג זברה צמחה כמערכת מודל אטרקטיבית כדי לחקור מחלות ניווניות 1. זֶהבשל היתרונות המוצעים על ידי אורגניזם מודל זה, כגון הפריה חוץ, זמן התפתחות קצר, גישה אופטית למערכת העצבים, וקלות transgenesis. בנוסף, את היכולת ליצור מהונדס דג זברת תרכובת בקלות מאפשרת אסטרטגיות תיוג מרובות של תאים מסוגים שונים. אבלציה גנטי מתקרב להרוג סוגי תאים מסוימים לאפשר הפרעה רחבה למדי, אך היא לא יכולה בקרה טובה של מיקוד תאים בודדים 5. טכניקות בסיוע לייזר, מצד שני, לספק שליטה של ​​זמן ומרחב משובח שימשו במשך במודלים של בעלי חיים שונים. בעוד שרוב הגישות להשתמש בציוד מיוחד, כגון לייזרים פעמו 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 או שני פוטונים בחרו קופץ 13, אחרקבוצות מחקר ניצלו לאחרונה של לייזר UV במיקרוסקופים confocal קונבנציונאלי 14. הטכניקה המתוארת כאן משלב מיקרוסקופיה confocal ברזולוציה גבוהה עם גישה לייזר בתיווך UV לגרום הסלולר מתח או מוות בצורה תלוית-מינון הנוירונים המוטוריים שנבחרו. היא מסתמכת על שימוש ליזר 405 ננומטר מותקן בדרך כלל, כבר נוסה בהצלחה על תרבית תאים ובחיות חיים, מאפשרת אפיון המפורט של אינטראקציות הסלולר, כגון שחרור microglial לאחר מותו העצבי.

<table><tbody><tr><td>אגרוז נמס נמוך</td><td>פישר-סיינטיפיק</td><td></td><td>מתמוסס במי ביצים עם טריקאין (0.02%) ב-0.8 - 1.5%</td></tr> <tr><td>טריקאין</td><td>Argent Labs</td><td>MS-222</td><td>0.02%</td></tr> <tr><td>בורוסיליקט קיר סטנדרטי של הרווארד עם נימה זכוכית נימית</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>GC100F-10 (קצר) GC100F-15 (ארוך)</td><td>משיכה להתנגדות של 2 - 7 M&Omega;</td></tr><tr><td>מי ביצים&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.6 גרם מלח ים אינסטנט אוקיינוס, 4 מ"ל של 1 מ"ג/מ"ל מתילן כחול ב-10 ליטר מים נטולי יונים</td></tr><tr><td>1-פניל-2-תיאוריאה (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>פרונאז</td><td>סיגמא</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>בלוק חום</td><td>בחר</td><td>מחמם בלוק דיגיטלי של BioProducts (SBD110_)</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר מיקרו-הזרקה</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>מיקרו-הזרקה בוצעה ביד תחת סטרומיקרוסקופ (Leica) עם מחט זכוכית טעונה ומיקרוסקופ Picospritzer II (General Valve corporation)</td></tr> <tr><td>סטריאוסקופ</td><td>Leica</td><td></td><td>מיקרוסקופ תאורת שדה בהיר בוצע על מיקרוסקופ דיסקציה סטריאו Leica M165FC (Leica)</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica&nbsp;</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr></tbody></table>

מתח ומות תא מפעיל באמצעות מיקרוסקופ confocal הקונבנציונלי uv הליזר

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

באמצעות מערך קונפוקלי סטנדרטי, ניתן להשתמש בשיטת אבלציה UV כדי לגרום באופן סלקטיבי לפגיעה תאית ולדמיין תגובות של תא בודד ואינטראקציות תא-תא במערכת העצבים המרכזית בזמן אמת. בעבר, חקר התגובות הספציפיות לתאים לאחר פציעה דרש לעתים קרובות הגדרות מסובכות או העברת תאים או בעלי חיים לסביבות שונות ולא פיזיולוגיות, מה שמבלבל ניתוח מיידי וקצר טווח. לדוגמה, גישות אבלציה בתיווך תרופות חסרות לעתים קרובות את הספציפיות הנדרשת כדי לחקור תגובות של תא בודד ואינטראקציות מיידיות בין תאים. באופן דומה, בעוד שגישות אבלציה בלייזר פועם בעוצמה גבוהה מספקות שליטה וחדירה טובה מאוד לרקמות, הן דורשות ציוד מיוחד שיכול לסבך הדמיה בזמן אמת של תגובות תאיות. גישת האבלציה המעודנת של לייזר UV המתוארת כאן מאפשרת לחוקרים להלחיץ או להרוג תא בודד באופן תלוי מינון וזמן באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי המצויד בלייזר 405 ננומטר. השיטה יושמה כדי לפרק באופן סלקטיבי נוירון בודד בתוך רשת צפופה של תאים מסביב בחוט השדרה של דג הזברה. גישה זו חשפה תגובה תלוית מינון של תאי העצב שנכרתו, וגרמה לפיצול של גופים תאיים וניוון אנטרוגרדי לאורך האקסון תוך דקות עד שעות. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את גורלו של תא גוסס בודד, וחשוב מכך, את התגובה המיידית של תאים - כגון מיקרוגליה ואסטרוציטים - המקיפים את אתר האבלציה.

השיטה המתוארת כאן מאפשרת אבלציה של הנוירונים מוטוריים בחוט שדרת דג הזברה באמצעות מודול FRAP של מיקרוסקופ confocal מסחרי. קווי דג זברה מהונדסים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק בנוירונים בשליטת יזמים ספציפיים, כגון - 3mnx1, islet1, או נפגשו, היו בשימוש. הביטוי של ה- GFP מונע על ידי אמרגן הנוירון המוטורי (כגון -3mnx1 או נפגש) מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של גופי התא, אקסונים הראשי, ואת הענפים ההיקפיים הארכת השרירים (איור 4 וידאו 1). נוירונים בחוט השדרה של 3 עד 5 דגים יום בן כבר ablated בהצלחה, עם זמן להתעכב הכולל של 60 - 80 s בהספק לייזר של ~ 70% ואת ההגדרות הכלליות כמתואר בשלב 3. אבלציה מוצלחת היא מושגת כאשר הקרינה נמוג מיד לאחר אבלציהולעולם לא יתחדש (איור 5, C ו- D). ניסיונות אבלציה עם קווי לייזר אחרים (כגון קו לייזר 488 ננומטר) לא לגרום דהייה קבע, הקרינה שוקם בתוך מסגרות זמן קצר. חשוב לציין, טכניקה זו הפגינה תכונות אופייניות של מוות של תאי אפופטוטיים נוירונים-ablated UV, כגון נוכחות של Annexin V, שינויים מורפולוגיים עקביים של ניוון somal, ו blebbing axonal של נוירון ablated 27. הספציפיות של גישה זו הוא אישר בניסויים באמצעות fluorophore photoconvertible קאאד (שעוברת פליטתו מירוק לאדום לאחר חשיפה לאור UV), שבו נוירון ממוקד אחד הוסב (איור 5, A ו- B) ללא סימני הסלולר הרס על פני כמה שעות. השימוש של כוח לייזר גבוה במקום מוביל to הכחדה של הנוירון הממוקד (לא photoconversion או מחודש של קרינה) ו photoconversion (ללא מוות) של התאים בסמיכות (~ 20 מיקרומטר) לאתר אבלציה (איור 5, C ו- D). יתרון חשוב אחד טכניקת אבלציה ליזר מושרה זהו התלות במינון של הגישה. כדי למקד תאים עם עוצמות שונות, מספר שכבות של כיוונון עדין זמינות ידי התאמת כוח הליזר (איור 3 ג, 8), מיצוע מהירות קו הסריקה (איור 3B, 4 ו -5), בגודל של ROI להיות ablated (איור 3D, 10), ואת החזרות (3E האיור, 12). יש לציין, גישה זו יכולה גם להיות מנוצלת כדי ליישם מתח הסלולר לתאים בודדים במקום גרימת מוות של תאים. לדוגמה, כיוונון עדין כבריקר למדי להעריך תהליכים תאיים במהלך המוות של תא עצב. הנוירונים המוטוריים עם תחזיות axonal ארוכים שהיו ablated עם עוצמות לייזר UV נמוכה חשף "blebbing" מאפיין (היווצרות ופיצול של שלפוחית הסלולר), שהחלה ב סומה ממוקד והמשיך לאורך האקסון לאורך זמן (40 - 90 דק '; איור 4 ; שניתן 3D סרט של אבלציה זה וידאו 1). כתוצאה מכך, ויסות פרמטרי אבלציה ליזר שונה ועל כן רמת מתח הסלולר מושרה ואת מהלך הזמן של מוות מאפשרת לחוקרים רמה גבוהה של גמישות ניסיון. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig1.jpg"> איור 1: הטמעה של דג הזברה הדמיה לחיות. (AF) Embedding נוהל הדמיה חיה: (א) Tricaine מתווסף מי ביצה כדי לטשטש א דג הזברה שיעור התחלה במינון ta של 50 מ"ג / ליטר. (ב) agarose התכה נמוכה (0.8 - 1.5%) מוכן וחמם עד 38 - 40 ° C. (C) בעזרת פיפטה העברה, דג הזברה ושנבחר מועבר לתוך צלחת עם פתרון tricaine. לאחר סדציה מוצלח (תנועת opercular רדודה, ירד קצב לב, העדר תגובה עורר מגע), דג מועבר לתוך agarose שחומם מראש (D). תקטין את כמות מי ביצה מועברת לתוך agarose כדי למנוע דילול שלאחר מכן. (E) עבר טיפת agarose (~ 30 - 50 μL) המכילה את דג הזברה על צלחת בגודל 35 מ"מ זכוכית תחתונה. בצע זה תחת מיקרוסקופ לנתיחה להשתמש במברשת כדי ליישר את דג הזברה בעדינות האוריינטציה המועדפת שלה. המתן 10 - 15 דקות, עד agarose מוגדר, ולהוסיף ~ 2 מ"ל של תמיסת tricaine כדי בצלחת (F). ה' "&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig2.jpg"> איור 2: ויזואליזציה של נוירונים microglia בחוט השדרה של דג הזברה 3-DPF. ויזואליזציה של המיקרוגליה נוירונים בחוט השדרה של דג הזברה מהונדס בן 3 ימים לבטא (א) נוירונים GFP חיובי (islet1: GFP) ו- (ב) mCherry חיובי microglia (MPEG1: GAL4, כטב"מ: mCherry). (C) תמונה מורכבת של ערוץ נוירון ו microglia יחד עם תמונת השדה הבהיר. את כנס סכמטית (C) מתאר את הכיוון של הדגים ומתווה באזור שהוצג. בר סולם = 30 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> דק-page = "1"&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig3.jpg"> איור 3: צעדים בתהליך של אבלציה לייזר UV (כפי שמתואר בפרוטוקול, שלב 3). צעדים לשלוט מודול תוכנת FRAP בתוכנת confocal (חבילת יישומים ליקה). (א) החל את מודול FRAP ככלי לבצע אבלציה לייזר UV. (ב) הקמת מטוס- z עבור הגדרות FRAP אבלציה אחרים כמו פורמט, מהירות, והעמיד ממוצע, אשר יקבע את זמן להתעכב של הלייזר. (ג) בקרה של עוצמת הלייזר ואת "זום" אפשרות מנת למקסם את יעילות הלבנה. (ד) בחירה של אזור אחד או מספר של (ROI) הריבית תהיה ablated. (ה) הגדירה את מהלך הזמן של הלבנה קובעת את מחזורי האקונומיקה להתעכב זמן ליזר על ROIs. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ אותה</a> דואר כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig4.jpg"> איור 4: ניוון האנטרוגרד של נוירון-ablated UV. זמן לשגות הדמיה של הניוון המוחיה של נוירון שדרת ablated-UV. (AF) UV-הקרנה של נוירון השדרה יחיד (במצטבר: GAL4, כטב"מ: EGFP; A; מעגל) הביא סומה של נוירון מתכווץ וריכוז לאורך זמן (AC), ואחריו הפיצול אקסונלית (CF; ראשי חץ) . התנוונות אקסונלית התחילה ב סומה (האתר של אבלציה) והתקדמה האנטרוגרד לכיוון הקצה הדיסטלי של האקסון עד שלבסוף, הקרינה ב סומה נעלמה ואת האקסון כולו הראה "blebbing" (DF). ברי סולם = 20 מיקרומטר. סרט 3D שניתן זמן לשגות של אבלציה זה מוצג וידאו 1.es / ftp_upload / 54,983 / 54983fig4large.jpg "target =" _ blank "&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54983/54983fig5.jpg"> איור 5: אישור של השפעת קרינת UV תא בודד באמצעות fluorophore photoconvertible (קאאד) בתוך הנוירון מוטורי. אימות של קרינת UV תא בודד דרך ההפעלה של קאאד fluorophore photoconvertible נוירון. (AD) קרינת UV של נוירונים שכותרתו עם קאאד. (א) photoconversion של נוירון בודד (עיגול) עם כוח לייזר של 30% עבור 10 s הובילה photoconversion של קאאד (מירוק לאדום) ב נוירון יחיד ממוקד בלבד (B). ראוי לציין, כי תא המרה שרד במשך כמה שעות, לא הראה שום סימנים חזותיים של הידרדרות, כגון blebbing או עיגול כלפי מעלה. אבלציה של נוירון בודד (C ; המעגל) עם כוח ליזר גבוה יותר (95% במשך 10 שניות) הביא היעלמות לאלתר כי נוירון (ד) ו photoconversion הבאה של קאאד במספר קטן של נוירונים שמסביב ברדיוס של כ 20 מיקרומטר. ברי סולם = 20 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/54983fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="וידאו 1" src="/files/ftp_upload/54983/54983vid1.jpg"> וידאו 1: טיוח משטח 3D (Imaris) של הנוירון ablated UV באיור 4. הוידאו זמן לשגות של הנוירון מתואר באיור 4 הוא משטח שניתנו באמצעות תוכנת ויזואליזציה (Imaris, Bitplane). זה מדגיש את תהליך ההתכווצות של סומה ablated, ואחריו פיצול אקסונלית anterogradely לקראת סוף דיסטלי של התא."Target =" euron_ablation-3D_rendered.mov _ blank "&gt; אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. איור 1 משלים: יצוק agarose אופציונלי הדמיה זמן ארוך. כדי למנוע תנועה של הדג ואת agarose במהלך הרכישה לטווח ארוך להכין סופגנייה מעגל בצורת של agarose בשולי באמצע המנה 35 מ"מ זכוכית התחתונה (א). תן סט agarose עבור ~ 10 דקות והועבר דגים לתוך המעגל הפנימי עם ירידה של agarose (B). נסו לצמצם את כמות agarose עבור הטבעה (לצחצח agarose עודף אל מחוץ לאחר orientating הדג). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54983/Supplementary_Figure_1.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

מניפולציות ממוקדות לגרימת מתח מכוון או מוות בתאים בודדים היו קשות יחסית לביצוע. כאן, מתוארת גישת אבלציה ברזולוציה של תא יחיד ללחץ סלקטיבי ולהרוג תאים בודדים בתרבית תאים ובבעלי חיים על בסיס לייזר UV קונפוקלי סטנדרטי.

מתח ומות תא מפעיל באמצעות מיקרוסקופ Confocal הקונבנציונלי UV הליזר

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

המטרה הכוללת של גישת אבלציה תאית זו היא ללחוץ או להרוג תאים בודדים באופן סלקטיבי בתרבית תאים או בבעלי חיים חיים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את גורלו של תא גוסס בודד ואת תגובת התאים, כגון מיקרוגליה ואסטרוציטים לאתר האבלציה שמסביב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא מיקוד מדויק של תאים בודדים, וכי ניתן להשיג זאת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי רגיל המצויד בלייזר 405 ננומטר.אנו משתמשים בדג הזברה כמערכת מודל לחקר מחלות ניווניות כגון מחלת נוירונים מוטוריים או דמנציה פרונטו-טמפורלית. הדמיית מותו של נוירון מוטורי וההשלכות שלאחר מכן מספקת הזדמנות מצוינת להבין טוב יותר את התהליכים הדינמיים המעורבים במחלה. הגישה שלנו להפעלת לחץ תאי באופן תלוי מינון מאפשרת אפיון מפורט של אינטראקציות תאיות.לדוגמה, פינוי מיקרוגליה לאחר מוות נוארונלי. בעוד ששיטה זו מספקת תובנות לגבי מנגנוני המחלה של אורגניזם חי, ניתן ליישם אותה באופן דומה גם בתאים מבודדים בתרבית. לאחר הגדרת קווים טרנסגניים זכריים ונקביים להזדווגות על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש במסננת תה מפלסטיק כדי לאסוף עוברים לאחר השרצה מוצלחת על ידי סינון מי המיכל.לאחר מכן השתמש במי ביצים כדי לשטוף את הביצים ולהעביר אותן למי ביצים בצלחת פטרי. בדוק את העוברים במיקרוסקופ אור כדי לקבוע את ההפריה. לאחר מכן דגרו על ביצים מופרות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס.כאשר העוברים מגיעים ליומיים עד חמישה ימים לאחר ההפריה או DPF, הניחו אותם תחת מיקרוסקופ תרכובת פלואורסצנטית ובדקו את העוברים לביטוי פלואורופור מתאים. לאחר מכן הפרד דגים עם תווית בהירה לכלי טרי עם מי ביצים להטמעה מאוחרת יותר. כדי להטמיע דג זברה באגרוז, הכינו תמיסת הרדמה על ידי הוספת ארבעה גרם לליטר MS 222 טיפה לצלחת פטרי המכילה מי ביצים.הכינו מלאי של אגרוז נמס נמוך ומי ביצים ומכניסים אותו לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. מניחים אליקוט לתוך גוש חום בטמפרטורה של 38 עד 40 מעלות צלזיוס ונותנים לו להתאזן לזמני הדמיה של יותר מארבע שעות, פיפטה כ-300 מיקרוליטר אגרוז לאורך העיגול הפנימי של צלחת עם תחתית זכוכית כדי להכין עיגול בצורת סופגנייה עם פתח קטן במרכז.כדי להרכיב את דג הזברה באגרוז למיקרוסקופיה, לאחר הרדמת הדג על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בפיפטה מתכווננת כדי לצייר זחל ולתת לו לשקוע לתחתית הקצה. זרוק את הזחל בנפח מינימלי של נוזל לאגרוז שחומם מראש. לאחר מכן משכו את הדג עם אגרוז והוציאו אותו במהירות לכלי זכוכית 35 מילימטר שהוכנה בעבר.תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש במכחול רגיל כדי למקם את החיה או מספר בעלי חיים בתוך האגרוז על צידיהם כך שהגוף והזנב יהיו שטוחים. הניחו לדג המוטבע לשבת במשך 10 עד 15 דקות עד שהאגרוז מתייצב היטב. לאחר מכן השתמש בכשני מיליליטר מי ביצים עם טריקאין כדי למלא בזהירות את צלחת הפטרי בגודל 35 מילימטר.הניחו את צלחת הפטרי עם זחל משובץ על במת המיקרוסקופ הקונפוקלי ובאמצעות תאורת שדה בהירה והגדלה פי 40, התמקדו בצד הגבי של חוט השדרה של החיה. עבור להגדרת פלואורסצנטיות מתאימה ודמיין את המבנה המעניין כדי לאשר שכל פרמטרי ההדמיה הם כנדרש לאבלציה שלאחר מכן. כדי לקבוע את עובי המבנה לאבלציה בלייזר UV, השתמש בכונן Z כדי לאמת את החלק העליון והתחתון של המבנה המעניין על ידי מיקוד ידני למעלה ולמטה.רשום ידנית את מישור ה-Z שיבוטל. לדוגמה, מרכז התא. כדי לבצע אבלציה בלייזר, הפעל את אשף FRAP על ידי לחיצה על התפריט הנפתח בחלק העליון של תפריט התוכנה.מהחלון החדש, קבע את פרמטרי התמונה עבור גישת האבלציה על ידי בחירת הפורמט, מהירות הסריקה והממוצע. אם מישור ה-Z לאבלציה עדיין לא נבחר, לחץ על כפתור Live והתמקד בדגימה עד שהמבנה הפלואורסצנטי או מישור ה-Z הרצוי לביטול יהיו בפוקוס. לאחר הגדרת פרמטרי התמונה הכלליים, גש לשלב Bleach כדי לשלוט ברכיבי האבלציה הספציפיים.לאחר מכן הפעל את הלייזר 405 ננומטר על ידי הפעלתו להליך ההלבנה. לאחר מכן, השתמש באפשרות זום אין כדי למקסם את עוצמת ההלבנה בהחזר ההשקעה שנבחר על ידי הפחתת שדה הסריקה, ובכך למקסם את זמן השהייה. בחר החזר ROI אחד או יותר עבור האבלציה באמצעות אחד מכלי הציור בחלון Image Acquisition.כוונו את גבעת האקסון, למשל, עם כלי הציור המעגלי של כארבעה עד שמונה מיקרומטרים. לאחר קביעת ההחזר על ההשקעה, בחר בלחצן Time Course ואשר את מספר המחזורים שהחזר ה-ROI ייסרק. בחר את המסגרות Pre-Bleach ו-Post-Bleach כרצונך כדי לאפשר סקירה כללית של התמונה כולה ממש לפני ומיד לאחר תהליך ההלבנה.הגדרות אלה מאפשרות לחוקרים שכבות מרובות של עידון. באמצעות התאמת עוצמת הלייזר, מהירות הסריקה, ממוצע הקווים, גודל אזור העניין והחזרות, טכניקה זו מציעה רמה גבוהה של חופש לגרום ללחץ או מוות בתאים בודדים. לאחר קביעת כל פרמטרי האבלציה הדרושים, לחץ על הפעל ניסוי ופקח על יעילות האבלציה.עיין בפרוטוקול הטקסט לפרטים נוספים. בניסוי זה בוצעה אבלציה בלייזר UV על GFP המבטא נוירונים מוטוריים בחוט השדרה של דג זברה מהונדס. ביטוי GFP המונע על ידי מקדמי נוירונים מוטוריים כגון 3 MINX one, IO one או MET מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של גופי התאים, האקסונים העיקריים והענפים ההיקפיים המשתרעים לשרירים.אבלציה מוצלחת של נוירונים בחוט השדרה הושגה כאשר הקרינה דועכת מיד לאחר האבלציה ולעולם לא מתחדשת. הספציפיות של גישה זו מאושרת כפי שמוצג כאן, כאשר נוירון ממוקד יחיד הומר באמצעות הפוטו-פלורו Kaede הניתן להמרה שמחליף את פליטתו מירוק לאדום לאחר חשיפה לאור UV. כדי למקד לתאים בעוצמות שונות, קיימות שכבות מרובות של כוונון עדין על ידי התאמת עוצמת הלייזר, מהירות הסריקה, ממוצע הקו, גודל ההחזר על ההשקעה שיש לבטל והחזרות.כפי שמוצג כאן, נוירונים מוטוריים עם הקרנות אקסונליות ארוכות שהוכרתו בסומה עם עוצמות לייזר UV נמוכות יותר חשפו בלבלים אופייניים שנמשכו מהסומה לאורך האקסון לאורך הזמן. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור שכל מערך קונפוקלי הוא ייחודי, וכי תפוקת הלייזר עבור כל מכשיר היא ספציפית ועשויה להיות שונה. לאחר ההליך, ניתן לראות מאפיינים אופייניים של מוות תאי אפופטוטי בתאי העצב המנוצלים.ניתן לזהות סמנים אפופטוטיים כגון XN 5 או שינויים מורפולוגיים כמו ניוון סומלי או בלבינג חיצוני. ניתן לבצע בדיקות נוספות כדי לענות על שאלות נוספות כגון כיצד ביצועי השחייה מושפעים מאבלציה של נוירונים בודדים או מרובים בחוט השדרה. על ידי חציית קווים שונים של דגי זברה טרנסגניים, חוקרים יכולים לחקור את התגובה של תאים אחרים להרס תאים המושרה על ידי לייזר.שיטות אלו מספקות פלטפורמה ניסויית ייחודית להבנת המנגנונים המולקולריים המדויקים של מחלה כגון MND in vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין דג זברה למיקרוסקופיה קונפוקלית וכיצד לבצע אבלציה בלייזר UV של תא יחיד.

triggering-cell-stress-death-using-conventional-uv-laser-confocal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: Morsch, M.,  et. al., הפעלת מתח ומוות של תאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של לייזר UV קונבנציונלית. J. Vis. Exp. (2017) בסרטון זה, אנו בוחנים את הטכניקה של אבלציה בלייזר UV בעוצמה גבוהה למיקוד מדויק ולימוד של נוירונים בודדים בדג זברה טרנסגני. אנו מדגימים כיצד להכין, לשתק ולדמיין תגובות עצביות, תוך הדגשת הדינמיקה התאית של פציעה והתאוששות.

אבלציה סלקטיבית של לייזר חד-נוירון בזחל דג זברה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

הגדרה ניסיונית מקורי לחימום תאים בצלחת תרבות באמצעות 1.94 מיקרומטר גל רציף הקרנת לייזר מוצג כאן. באמצעות שיטה זו, התגובות הביולוגיות של פיגמנט רשתית אפיתל (RPE) תאים לאחר חשיפות תרמיות שונות ניתן לחקור.

רציף גל תוליום לייזר עבור תאים תאים מתורבת לחקור אפקט תרמי נייד

לייזרים משמשים לעתים קרובות במחקרים של התגובה התאית לנזקי DNA. עם זאת, הם מייצרים נגעים אשר מרווח, תדירות, ואת התנגשויות עם מזלגות שכפולים נדירות מאופיינות. כאן, אנו מתארים גישה המאפשרת קביעת פרמטרים אלה עם crosslinks interstrand לייזר מקומי.

ניתוח מולקולה בודדת של מותאמת לשפה לייזר Psoralen Adducts

Microirradiation לייזר הוא כלי שימושי עבור מחקרים של תיקון ה-DNA בתאים חיים. בגישה מתודולוגי לשימוש של לייזרים UVA לזירוז נגעים דנ א שונים מוצג. לנו יש אופטימיזציה שיטה microirradiation המקומי המתחזק מחזור תא נורמלי; לפיכך, תאים לקרינה להמשיך לעבור מיטוזה.

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את אופן השימוש בלייזר microirradiation לזירוז סוגים שונים של נזק לדנ א, לרבות מעברי חוט פשוטה יחסית, נזק מורכבות, ללמוד DNA נזק איתות ותיקון גורם מכלול אתרים של נזק ויוו .

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית מיקרוסקופ לייזר מיקרו-הקרנה הצעה וכלים גרימת נזק לדנ א וניטור התגובה של חלבונים תיקון ה-DNA באזורים נבחרים גרעיני תת. טכניקה זו התקדמה באופן משמעותי את הידע שלנו של גילוי הנזק, איתות, גיוס. כתב יד זה מדגים הטכנולוגיות הללו לבחון סטרנד ליחיד מעבר לתיקון.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

פרוטוקול זה מתאר קספאז פלורסצנטיות ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה (BiFC); מבוססת הדמיה בשיטת יכול לשמש כדי להמחיש המושרה הקרבה של יוזם caspases, וזה הצעד הראשון ההפעלה שלהם.

מאיר את המסלולים להפעלה קספאז באמצעות קרינה פלואורסצנטית ריאקציה דו-מולקולרית קומפלמנטציה

לומד DNA נזק תיקון קינטיקה דורש מערכת לזירוז נגעים ב גרעיני תת אזורים מוגדרים. אנו מתארים שיטה ליצור מעברי גדילי זוגיות המותאמות לשפות אחרות באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 405 ננומטר לייזר ולספק שגרות אוטומטיות כדי לכמת את הדינמיקה של הגורמים תיקון הפצעים כאלה.

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

לייזר ממוקד בצורה ממוקדת בשני התאים יכול לספק גירוי מדויק לתאי החיבור למיקרוסקופיה מרוכזת המאפשרת תצפית וגירוי בזמן אמת. הגירוי יכול להפעיל את האירועים המולקולריים תאים כולל מסלול מאותת והבזקים מיטוכונדריאלי של מינים חמצן תגובתי.

גירוי התמונה על ידי לייזר מפעיל בלייזר-האות-מוסדרים-קינאז (טיפשה) איתות או האירועים מיטוכונדריאלי בתאי היעד

פרוטוקול זה מדגים את הזיהוי הסימולטני של מינים חמצן תגובתי (ROS), תאים חיים, ותאים מתים בתרבויות הראשיות חי מפני העכבר משטח העינית תאים. 2 ', 7 '-diלורופלוט אצטט, propidium יודיד, וכתמים הופסט משמשים כדי להעריך את רוס, תאים מתים, ותאים חיים, בהתאמה, ואחריו הדמיה וניתוח.

הערכה של נזק חמצוני בעכבר הראשי פני השטח העינית/תאים גזע בתגובה אולטרה סגול (UV-C) נזק

פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית לזיהוי יעיל של תאי S-phase למחקרי מיקרוסקופיה במורד הזרם, כגון מדידת גיוס חלבונים לתיקון דנ"א באמצעות הקרנת מיקרו-קרינה בלייזר.

הקרנת מיקרו לייזר לחקר גיוס DNA במהלך שלב S

למדו שיטת אבלציית לייזר UV במיקרוסקופ קונפוקלי לחקר מוות תאי ותגובות מיקרוגליה בזברה דניו רריו. שיטה זו מאפשרת ניטור מדויק של תהליכים נוירודגנרטיביים בחיים.

מתח ומות תא מפעיל באמצעות מיקרוסקופ Confocal הקונבנציונלי UV הליזר

גלה סרטונים נוספים