מתח ומות תא מפעיל באמצעות מיקרוסקופ Confocal הקונבנציונלי UV הליזר

המטרה הכוללת של גישת אבלציה תאית זו היא ללחוץ או להרוג תאים בודדים באופן סלקטיבי בתרבית תאים או בבעלי חיים חיים. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את גורלו של תא גוסס בודד ואת תגובת התאים, כגון מיקרוגליה ואסטרוציטים לאתר האבלציה שמסביב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא מיקוד מדויק של תאים בודדים, וכי ניתן להשיג זאת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי רגיל המצויד בלייזר 405 ננומטר.

אנו משתמשים בדג הזברה כמערכת מודל לחקר מחלות ניווניות כגון מחלת נוירונים מוטוריים או דמנציה פרונטו-טמפורלית. הדמיית מותו של נוירון מוטורי וההשלכות שלאחר מכן מספקת הזדמנות מצוינת להבין טוב יותר את התהליכים הדינמיים המעורבים במחלה. הגישה שלנו להפעלת לחץ תאי באופן תלוי מינון מאפשרת אפיון מפורט של אינטראקציות תאיות.

לדוגמה, פינוי מיקרוגליה לאחר מוות נוארונלי. בעוד ששיטה זו מספקת תובנות לגבי מנגנוני המחלה של אורגניזם חי, ניתן ליישם אותה באופן דומה גם בתאים מבודדים בתרבית. לאחר הגדרת קווים טרנסגניים זכריים ונקביים להזדווגות על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש במסננת תה מפלסטיק כדי לאסוף עוברים לאחר השרצה מוצלחת על ידי סינון מי המיכל.

לאחר מכן השתמש במי ביצים כדי לשטוף את הביצים ולהעביר אותן למי ביצים בצלחת פטרי. בדוק את העוברים במיקרוסקופ אור כדי לקבוע את ההפריה. לאחר מכן דגרו על ביצים מופרות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס.

כאשר העוברים מגיעים ליומיים עד חמישה ימים לאחר ההפריה או DPF, הניחו אותם תחת מיקרוסקופ תרכובת פלואורסצנטית ובדקו את העוברים לביטוי פלואורופור מתאים. לאחר מכן הפרד דגים עם תווית בהירה לכלי טרי עם מי ביצים להטמעה מאוחרת יותר. כדי להטמיע דג זברה באגרוז, הכינו תמיסת הרדמה על ידי הוספת ארבעה גרם לליטר MS 222 טיפה לצלחת פטרי המכילה מי ביצים.

הכינו מלאי של אגרוז נמס נמוך ומי ביצים ומכניסים אותו לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. מניחים אליקוט לתוך גוש חום בטמפרטורה של 38 עד 40 מעלות צלזיוס ונותנים לו להתאזן לזמני הדמיה של יותר מארבע שעות, פיפטה כ-300 מיקרוליטר אגרוז לאורך העיגול הפנימי של צלחת עם תחתית זכוכית כדי להכין עיגול בצורת סופגנייה עם פתח קטן במרכז.

כדי להרכיב את דג הזברה באגרוז למיקרוסקופיה, לאחר הרדמת הדג על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בפיפטה מתכווננת כדי לצייר זחל ולתת לו לשקוע לתחתית הקצה. זרוק את הזחל בנפח מינימלי של נוזל לאגרוז שחומם מראש. לאחר מכן משכו את הדג עם אגרוז והוציאו אותו במהירות לכלי זכוכית 35 מילימטר שהוכנה בעבר.

תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש במכחול רגיל כדי למקם את החיה או מספר בעלי חיים בתוך האגרוז על צידיהם כך שהגוף והזנב יהיו שטוחים. הניחו לדג המוטבע לשבת במשך 10 עד 15 דקות עד שהאגרוז מתייצב היטב. לאחר מכן השתמש בכשני מיליליטר מי ביצים עם טריקאין כדי למלא בזהירות את צלחת הפטרי בגודל 35 מילימטר.

הניחו את צלחת הפטרי עם זחל משובץ על במת המיקרוסקופ הקונפוקלי ובאמצעות תאורת שדה בהירה והגדלה פי 40, התמקדו בצד הגבי של חוט השדרה של החיה. עבור להגדרת פלואורסצנטיות מתאימה ודמיין את המבנה המעניין כדי לאשר שכל פרמטרי ההדמיה הם כנדרש לאבלציה שלאחר מכן. כדי לקבוע את עובי המבנה לאבלציה בלייזר UV, השתמש בכונן Z כדי לאמת את החלק העליון והתחתון של המבנה המעניין על ידי מיקוד ידני למעלה ולמטה.

רשום ידנית את מישור ה-Z שיבוטל. לדוגמה, מרכז התא. כדי לבצע אבלציה בלייזר, הפעל את אשף FRAP על ידי לחיצה על התפריט הנפתח בחלק העליון של תפריט התוכנה.

מהחלון החדש, קבע את פרמטרי התמונה עבור גישת האבלציה על ידי בחירת הפורמט, מהירות הסריקה והממוצע. אם מישור ה-Z לאבלציה עדיין לא נבחר, לחץ על כפתור Live והתמקד בדגימה עד שהמבנה הפלואורסצנטי או מישור ה-Z הרצוי לביטול יהיו בפוקוס. לאחר הגדרת פרמטרי התמונה הכלליים, גש לשלב Bleach כדי לשלוט ברכיבי האבלציה הספציפיים.

לאחר מכן הפעל את הלייזר 405 ננומטר על ידי הפעלתו להליך ההלבנה. לאחר מכן, השתמש באפשרות זום אין כדי למקסם את עוצמת ההלבנה בהחזר ההשקעה שנבחר על ידי הפחתת שדה הסריקה, ובכך למקסם את זמן השהייה. בחר החזר ROI אחד או יותר עבור האבלציה באמצעות אחד מכלי הציור בחלון Image Acquisition.

כוונו את גבעת האקסון, למשל, עם כלי הציור המעגלי של כארבעה עד שמונה מיקרומטרים. לאחר קביעת ההחזר על ההשקעה, בחר בלחצן Time Course ואשר את מספר המחזורים שהחזר ה-ROI ייסרק. בחר את המסגרות Pre-Bleach ו-Post-Bleach כרצונך כדי לאפשר סקירה כללית של התמונה כולה ממש לפני ומיד לאחר תהליך ההלבנה.

הגדרות אלה מאפשרות לחוקרים שכבות מרובות של עידון. באמצעות התאמת עוצמת הלייזר, מהירות הסריקה, ממוצע הקווים, גודל אזור העניין והחזרות, טכניקה זו מציעה רמה גבוהה של חופש לגרום ללחץ או מוות בתאים בודדים. לאחר קביעת כל פרמטרי האבלציה הדרושים, לחץ על הפעל ניסוי ופקח על יעילות האבלציה.

עיין בפרוטוקול הטקסט לפרטים נוספים. בניסוי זה בוצעה אבלציה בלייזר UV על GFP המבטא נוירונים מוטוריים בחוט השדרה של דג זברה מהונדס. ביטוי GFP המונע על ידי מקדמי נוירונים מוטוריים כגון 3 MINX one, IO one או MET מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה של גופי התאים, האקסונים העיקריים והענפים ההיקפיים המשתרעים לשרירים.

אבלציה מוצלחת של נוירונים בחוט השדרה הושגה כאשר הקרינה דועכת מיד לאחר האבלציה ולעולם לא מתחדשת. הספציפיות של גישה זו מאושרת כפי שמוצג כאן, כאשר נוירון ממוקד יחיד הומר באמצעות הפוטו-פלורו Kaede הניתן להמרה שמחליף את פליטתו מירוק לאדום לאחר חשיפה לאור UV. כדי למקד לתאים בעוצמות שונות, קיימות שכבות מרובות של כוונון עדין על ידי התאמת עוצמת הלייזר, מהירות הסריקה, ממוצע הקו, גודל ההחזר על ההשקעה שיש לבטל והחזרות.

כפי שמוצג כאן, נוירונים מוטוריים עם הקרנות אקסונליות ארוכות שהוכרתו בסומה עם עוצמות לייזר UV נמוכות יותר חשפו בלבלים אופייניים שנמשכו מהסומה לאורך האקסון לאורך הזמן. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור שכל מערך קונפוקלי הוא ייחודי, וכי תפוקת הלייזר עבור כל מכשיר היא ספציפית ועשויה להיות שונה. לאחר ההליך, ניתן לראות מאפיינים אופייניים של מוות תאי אפופטוטי בתאי העצב המנוצלים.

ניתן לזהות סמנים אפופטוטיים כגון XN 5 או שינויים מורפולוגיים כמו ניוון סומלי או בלבינג חיצוני. ניתן לבצע בדיקות נוספות כדי לענות על שאלות נוספות כגון כיצד ביצועי השחייה מושפעים מאבלציה של נוירונים בודדים או מרובים בחוט השדרה. על ידי חציית קווים שונים של דגי זברה טרנסגניים, חוקרים יכולים לחקור את התגובה של תאים אחרים להרס תאים המושרה על ידי לייזר.

שיטות אלו מספקות פלטפורמה ניסויית ייחודית להבנת המנגנונים המולקולריים המדויקים של מחלה כגון MND in vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין דג זברה למיקרוסקופיה קונפוקלית וכיצד לבצע אבלציה בלייזר UV של תא יחיד.