Name: Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: למדו שיטות אופטימיזציה להזרקת RNA ציטופלזמי ובידוד זקיקים בודדים בביציות Xenopus. טכניקות אלו משפרות שרידות התאים ומאפשרות שינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרופיזיולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק הקרן הלאומית השוויצרית למדע 315230_156929/1. M.C.M. הוא זוכה במלגה (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).

ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המקומית של קנטון ברן Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst ברן (BE85 / 15). 1. הכנת Xenopus ביציות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על צפרדעים (laevis Xenopus) על אור 12 שעות / 12 שעות / חושך מחזור במים כי נשמר בקפדנות על 20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האונות של השחלות צפרדעים נקבה 9. הערה: הסרת האונות היא גירוי להתחדשות, ולעתים קרובות את איכות הביציות משפרת עם ניתוח. הביצית מכוסית שכבת vitelline, שכבה של תאי זקיק, ורקמות חיבור המכילים את כלי דם 21. המבנה כולו שמכונה &quot;זקיק&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את האונות של השחלות כי הם ארוזים בצפיפות עם הזקיקים המכילים את הביציות ב (MBS) המלוח 7 של בארת סטרילי השלימו עם פניצילין סטרפטומיצין (88 mM NaCl, KCl 1 מ&quot;מ, 2.4 מ&quot;מ<html> 3 NaHCO, 0.82 מ&quot;מ 4 MgSO, 0.41 מ&quot;מ 2 CaCl, 0.33 מ&quot;מ Ca (NO 3) 2, 10 מ&quot;מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic; HEPES (7.5 pH, NaOH), 100 מיקרוגרם / פניצילין מ&quot;ל, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב יחיד-אאוט V-VI 21 זקיקים. החזק את אונת השחלה עם מלקחיים. מנמיך את לולאת הפלטינה (איור 1) על הזקיקים ולמשוך את הלולאה בעדינות כדי לשבש את רקמת חיבור המכילה את הזקיק מרקמת השחלה. הערה: שלב V-VI 21 זקיקי מאופיינים גודלם (1.0 - 1.2 מ&quot;מ קוטר) ועל ידי ניגודיות טובה בין האונה חיה פיגמנט כהה בחצי הכדור צמחיים צהבהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר זקיקים בריאים למראה בלבד (כלומר לחלוטין כדורים עם פיגמנטציה ללא פגע) לצלחת 35 מ&quot;מ קוטר פטרי באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק (לגזור הגב בקוטר פתיחה של 1.5 מ&quot;מ). </li></ol>&quot;Jove_title&quot;&gt; 2. Microinjection של mRNA לתוך הציטופלסמה הערה: מערכת microinjection שתוארה כאן נגזרה שדיווח על ידי Kressmann ו Birnstiel 22. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן cRNAs מן cDNAs בהתאמה קידוד עבור יחידות המשנה של GABA α 4 β 2 δ קולט ידי שעתוק במבחנה, התוספת של פולי (א +) זנב, וכימות RNA על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן טפטפות microinjection מתוך נימי זכוכית בורוסיליקט (1.0 מ&quot;מ קוטר חיצוני (OD), קוטר פנימי 0.58 מ&quot;מ (ID), 100 מ&quot;מ אורך) באמצעות חולץ micropipette. לשבור את קצות נימי הזכוכית תחת מיקרוסקופ באמצעות micromanipulator ו microfilament ליצור בקוטר טיפ של 12 - 15 מיקרומטר עם קצה משופע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשאים למלא את טפטפות microinjection עם שמן פרפין באמצעות מזרק 10 מ&quot;ל, ואז עגנו פיפטה microinjection גבי micr מהרכבהמנגנון oinjection (איור 2). הערה: מנגנון ההזרקה ההידראולי מהרכבת השמן מורכב מנוע גריל נשלט על ידי מתג דוושת רגל. מתג נוסף משנה את מצב המפנה של המנוע. מנוע זה מניע בורג מיקרומטר (0.5 מ&quot;מ / בתורו) שמקדם או חזר בו הבוכנה של מזרק זכוכית 10 μL. הזריקה היא במהירות של כ -3 סל&quot;ד ו תפנית 0.5 מקביל הזרקת 50 NL לתוך זקיק. הטיפ של המזרק מחובר צינורות polytetrafluoroethylene בעובי דופן כי הוא עצמו קשור מחט הזריקה ידי פיסה מאוד קצרה של צינורות Tygon. נימי ההזרקה מוחזק על ידי צ&#39;אק תרגיל כי הוא נשלט על ידי micromanipulator. המערכת כולה מלאה שמן פרפין. כל בועות אוויר יש להימנע, כפי שהם יפגעו במערכת ההזרקה. ההתקנה מוארת עם מקור אור קר. סטראו נדרשת שליטה אופטית. זקיקים הם דמיינו תחת אור קר עם stereomicroscope (בהגדלה 40X). ביצועים של התקנת ההזרקה הוא נבדק על ידי ההזרקה של רדיואקטיבי לתוך ביציות Xenopus. נפח של 45 - 55 nL צריך להיות מועבר לכל זריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה עם קצה פלסטיק סטרילית, לבדוק את ההתקנה על ידי נחת טיפה של מים סטריליים על החלק הפנימי הנקי של תרמופלסטיים לחות עמידה (2 X 2 סנטימטר). לטבול את קצה פיפטה זריקה לתוך אגל זה, ולאחר מכן להפעיל את המנוע כדי לחזור בו הבוכנה (לחץ שלילי בתוך פיפטה הזרקה). הערה: המים צריכים להיכנס פיפטה ויוצרים ממשק גלוי עם שמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור בו קצה פיפטה מן האגל ולהפעיל לחץ חיובי לחלק הפנימי של פיפטה ההזרקה. אגל מים צריך טופס על קצה פיפטה ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכון הזרקת הזקיקים ידי הזדנבות אותם עם הקטבים הצמחיים מצביעים כלפי מעלה אל הסדקים של רשת ניילון (G: 0.8 מ&quot;מ) מודבקים לתחתית של Peצלחת תלת (60 מ&quot;מ) מכוסה MBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 2 μL של mRNA בעזרת פיפטה עם קצה פלסטיק סטרילי אל תוך הפנים הנקיים של תרמופלסטיים. קח את ה- mRNA לתוך פיפטה ההזרקה ידי הפעלת לחץ שלילי על הצד הפנימי של פיפטה ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את פיפטה הזרקת מעל זקיק הפרט באמצעות micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מחט הזריקה לתוך במרכז המוט הצמחי ולהזריק 50 NL של mRNA בקצב זרימה של 0.6 μL / דקה על ידי הפעלת לחץ חיובי לחלק הפנימי של פיפטה. מתן 5 - 10 שניות לפני הסרת טיפ הזרקת פיפטה מן הזקיק להימנע בריחת mRNA. הערה: mRNA צריך להיות מוזרק לתוך צמחיים (צהבהב) מוט כדי למנוע הזרקת לתוך הגרעין, הנמצא בחצי הכדור החי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את זקיקי מוזרק אל צלחת פטרי חדש (35 מ&quot;מ) מלאים 2 מ&quot;ל של MBS. מניח את הצלחת לתוך מקרר יין נקבע על 18 מעלות צלזיוס. דגירת זקיקי המוזרק עבור 1 -7 ד לפני ההקלטה, תלוי מיהו של החלבון הביע לאחרונה. </li></ol> 3. שלילה של הזקיקים (איור 3) הערה: כפי שצוין לעיל, הביצית המכוסית בשכבת vitelline, תאי זקיק, ורקמות חיבור, אשר מכילה את כלי דם 24, שמכונה &quot;זקיק&quot;. כל השכבות למעט שכבת vitelline, המספקת יציבות מכאנית ללא במניעת כניסתם של פתרונות אל פני התא, יש להסיר לפני ניסויי אלקטרו. הזקיק ללא שכבות תאים המקיפים בעבר זכה לכינוי ביצית &quot;ערומים&quot; 25. שלב זה מבוצע בדרך כלל באותו היום כמו ניסויי אלקטרו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עשר מוזרק זקיקי לצינור זכוכית בורוסיליקט המכיל 0.5 מ&quot;ל של MBS, 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​collagenase, ו 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מעכב טריפסין. לטבול את הצינורית באמבט מים שמרו על 36 מעלות צלזיוס. דגירהזקיקים במשך 20 דקות ולנער את הצינורות מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את הזקיקים באמצעות העברה צינור שני המכיל 1 מיליליטר של MBS ב RT. השאירו אותם בצינור למשך כ -10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הזקיקים לצינור שלישי המכיל 0.5 מיליליטר של MBS המרוכז כפליים המכיל 4 מ&quot;מ אתילן גליקול-bis (2-aminoethylether) - N, N, N &#39;, N&#39;- חומצת tetraacetic (EGTA), דגירה אותם במשך 4 דקות ב RT. לנער את הצינור מעת לעת. הערה: הפתרון היפרטוני (MBS המרוכז כפליים) משמשת כדי לגרום להתכווצות של הביציות בתוך שכבות תאי זקיק, ובכך ניתוק שכבות תאי זקיקים מן הביצית; EGTA מתווסף לעכב פעילות collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את הזקיקים באמצעות העברה צינור שני המכיל 1 מיליליטר של MBS ב RT. השאירו אותם בצינור למשך כ -10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ביציות כדי בצלחת פטרי (35 מ&quot;מ קוטר) המכיל 2 מ&quot;ל של MBS. תחת סטראו, להפריד את המעטפות החיצוניות מן הזקיקים ידידוחף את ביצית העירום פשוט משם באמצעות לולאת הפלטינה. ההערה: המעטפות החיצוניות של הביציות מקלות היטב את מנת התרבות ניתן להפריד בקלות מן הביציות. ביציות יש מי ספונטניים לאבד המעטפות החיצוניות שלהם יהיה התאוששו כמו ביציות ערומות. הליך זה התוצאה הוא הכנה יציב יחסית שמחזיק את המראה הכדורית של הביציות. </li></ol> 4. שינוי פתרון מהיר סביב הביצית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו ניסוי מהדק מתח, כמתואר 9,26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את הפתרון של מערכת זלוף הניזונים הכביד על ידי סיבוב המתגים זלוף כמתחייב הניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הפתרון זלוף ב -6 mL / min דרך נימי זכוכית בקוטר פנימי של 1.35 מ&quot;מ, הפה של אשר ממוקם כ -0.4 מ&quot;מ מפני השטח של הביצית, כדי לאפשר שינויים מהירים בריכוז אגוניסט סביב הביצית. הערה: שיעור השינוי כבר בעבר אומדןד 70% בפחות מ -0.5 שניות 27. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+frog+eggs+and+oocytes+for+the+study+of+messenger+RNA+and+its+translation+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells.</a> Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).</li>
<li>Soreq, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthesis+of+biologically+active+proteins+in+mRNA-microinjected+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22CRC+Crit+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes.</a> CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).</li>
<li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Xenopus+oocytes+for+the+functional+expression+of+plasma+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins.</a> J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).</li>
<li>Dascal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Xenopus+oocytes+for+the+study+of+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22CRC+Crit+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels.</a> CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).</li>
<li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+single+sodium+channels+translated+by+Xenopus+oocytes+after+injection+with+messenger+ribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid.</a> J Physiol. 386, 73-90 (1987).</li>
<li>Sigel, E., Minier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+oocyte%3A+system+for+the+study+of+functional+expression+and+modulation+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins.</a> Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).</li>
<li>Colman, A. Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aColman%2C+A+%22Transcription+and+Translation%27A+Practical+Approach%22">Transcription and Translation'A Practical Approach</a>. Hames, B. D., Higgins, S. J. , IRL Press. Oxford. 49-69 (1984).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defolliculation+of+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Defolliculation of Xenopus oocytes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).</li>
<li>Smart, T. G., Krishek, B. J. Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmart%2C+TG+%22Patch-Clamp+Applications+and+Protocols%22">Patch-Clamp Applications and Protocols</a>. Boulton, A. A., Baker,, Wolfgang, W. alz , Humana Press. New Jersey. 259-305 (1995).</li>
<li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+sites+involved+in+modulation+of+the+GABA+receptor+channel+by+the+intravenous+anesthetics+propofol%2C+etomidate+and+pentobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital.</a> Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).</li>
<li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+positive+allosteric+modulators+of+GABAA+receptors+with+anesthetic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity.</a> Sci Rep. 6, 25943(2016).</li>
<li>Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. Towards understanding functional properties and subunit arrangement of α4β2δ GABAA receptors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWongsamitkul%2C+N+%22J+Biol+Chem%22">J Biol Chem</a>. 291 (35), 18474-18483 (2016).</li>
<li>Burgunder, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chloride+channel+mutations+leading+to+mild+myotonia+among+Chinese%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese.</a> Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).</li>
<li>Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heteromeric+potassium+channel+involved+in+the+modulation+of+the+plasma+membrane+potential+is+essential+for+the+survival+of+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes.</a> FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).</li>
<li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((myo-Inositol+uptake+is+essential+for+bulk+inositol+phospholipid+but+not+glycosylphosphatidylinositol+synthesis+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei.</a> J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).</li>
<li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+Bloodstream+Forms+Depend+upon+Uptake+of+myo-Inositol+for+Golgi+Complex+Phosphatidylinositol+Synthesis+and+Normal+Cell+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth.</a> Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).</li>
<li>Wu, M., Gerhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raising+Xenopus+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Raising Xenopus in the laboratory.</a> Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).</li>
<li>Gurdon, J. B. American clawed frogs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGurdon%2C+JB+%22Methods+in+developmental+biology%22">Methods in developmental biology</a>. Wilt, F. H., Wessels, N. K. , Thomas Y. Crowell Co. New York. 75-84 (1967).</li>
<li>Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poor+quality+of+oocytes+from+Xenopus+laevis+used+in+laboratory+experiments%3A+prevention+by+use+of+antiseptic+surgical+technique+and+antibiotic+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation.</a> Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).</li>
<li>Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+oogenesis+in+the+South+African+clawed+frog+%28Xenopus+laevis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis).</a> Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).</li>
<li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).</li>
<li>Kressmann, A. Birnstiel M.L. Surrogate genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKressmann%2C+A+%22Transfer+of+Cell+Constituents+into+Eucaryotic+Cells%22">Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells</a>. Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. , Plenum Press. 388-407 (1980).</li>
<li>Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+modulation+of+synaptic+and+extrasynaptic+GABAA+receptors+by+an+antagonist+of+the+high+affinity+benzodiazepine+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site.</a> Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).</li>
<li>Dumont, J. N., Brummett, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.+V.+Relationships+between+developing+oocytes+and+their+investing+follicular+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues.</a> J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).</li>
<li>Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+oocyte+resting+potential%2C+muscarinic+responses+and+the+role+of+calcium+and+guanosine+3%27%2C5%27-cyclic+monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate.</a> J Physiol. 352, 551-574 (1984).</li>
<li>Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocytes+as+an+expression+system+for+studying+receptor%2Fchannel+targets+of+drugs+and+pesticides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides.</a> Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).</li>
<li>Sigel, E., Baur, R., Trube, G., Möhler, H., Malherbe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+subunit+combination+of+rat+brain+GABAA+receptors+on+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function.</a> Neuron. 5, 703-711 (1990).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטות המתוארות במאמר זה לסטות אלה המשמשים באופן מסורתי 7-9. זהו תקן לחשוף את האונות של השחלה כדי טיפול collagenase 1 עד 2 h 8; לבודד ביציות ניזוק, חשופה; ולהזריק אותם עם ה- mRNA באמצעות התקני הזרקה מסחריים. הליך קלסי זו כולל את החסרונות הבאים: 1) ביציות צפויות להינזק על ידי החשיפה הארוכה לריכוזים גבוהים של collagenase. 2) ביציות הערומים היציבות חייבות להיות מאוחסנות עד הניסוי. 3) ביציות ערומים נוטות יותר לסבול במהלך microinjection מ זקיקים. מכשירי הזרקת מסחר...

ביציות Xenopus נמצאים בשימוש נרחב כמערכת ביטוי (הפניות 2 - 3, והפניות בו). הם מסוגלים להרכיב כראוי לשלב חלבוני multisubunit פעילים מבחינה תפקודית לתוך ממברנות הפלזמה שלהם. באמצעות מערכת זו, ניתן לחקור חלבונים בממברנה תפקודי לבד או בשילוב עם חלבונים אחרים, כדי ללמוד את המאפיינים של מוטציה, כימרי, או חלבונים בשרשור, ו להקרין תרופות פוטנציאליות. יתרונות שימוש ביציות פני מערכות ביטוי Heterologous אחרות נמנו טיפול פשוט של התאים הענקים, השיעור הגבוה של תאי מבטאי מידע גנטי זר, השליטה הפשוטה של ​​הסביבה של הביצית באמצעות זלוף אמבטיה, ואת השליטה על פוטנציאל הממברנה . החיסרון של מערכת ביטוי זה הוא התנודתיות העונתית שנצפתה במעבדות רבות 17-20. הסיבה וריאציה זורחוק מלהיות ברור. בנוסף, איכות ביציות הוא נצפה לעיתים קרובות כדי להשתנות מאוד. שיטות מסורתיות 7-9 כללו את הבידוד של אונות שחלה, החשיפה של אונות שחלה כדי collagenase עבור כמה שעות, הבחירה של ביציות ערומות, ואת microinjection הביצית. כאן, מספר החלופי, הנהלים מהר מדווח כי אפשר לנו לעבוד עם מערכת ביטוי זה במשך יותר מ -30 שנה ללא וריאציה עונתיות וריאציה מעט באיכות ביצית. השיטות לשנות ולשפר אותו מתואר כאן עבור הבידוד של ביציות, microinjection עם קרנה, והסרה של שכבות תאי זקיקים ניתן להשתמש על מנת לתת ביטוי לכל חלבון רצוי, לפי בחירה, ביצית Xenopus. השיטה פשוטה מאוד לשינויי פתרון מהירים של המדיום סביב הביצית ניתן להחיל המחקר של כל ערוץ יון מגודר ליגנד של נישאים.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>M-1880</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>223560</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO3)2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td>100 &mu; גרם פניצילין/מ"ל ו-100 &mu; g streptomycin/mL</td></tr><tr><td>לולאת תיל פלטינה</td><td>תוצרת</td><td></td><td></td>בית</tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>Zeitz-Instruments GmBH</td><td>DMZ</td><td></td></tr><tr><td>מזרק המילטון&nbsp;</td><td>המילטון</td><td>80300</td><td>10 &mu; L, סוג 701N</td></tr><tr><td>צינורות פוליטטרפלואורואתילן עבים עם קירות מעבדה</td><td>GmBH</td><td></td><td>1.0 מ"מ OD&nbsp;</td></tr><tr><td>שמן פרפין</td><td>Sigma</td><td>18512</td><td></td></tr><tr><td>רשת ניילון, G: 0.8 מ"מ&nbsp;</td><td>ZBF Z&uuml; עשיר יותר Beuteltuchfabrik AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינור זכוכית בורוסיליקט&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>99445-12</td><td>PYREX</td></tr><tr><td>קולגנאז NB מעכב טריפסין בדרגה סטנדרטית</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין מסוג I-S</td><td>Sigma</td><td>T-9003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3389</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית</td><td>Jencons (מדעי) בע"מ.</td><td>H15/10</td><td>1.35 ID מ"מ (לזילוף), חברה חלופית: Harvard Apparatus Limited</td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט</td><td>הרווארד מכשירים מוגבלים</td><td>30-0019</td><td>1.0 OD x&nbsp; 0.58 ID x 100 אורך מ"מ (למיקרו-הזרקה)&nbsp;</td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט&nbsp;</td><td>הרווארד מנגנון מוגבל</td><td>30-0044</td><td>1.2 OD x 0.69 מזהה x 100 אורך מ"מ (עבור מהדק מתח שתי אלקטרודות)</td></tr><tr><td>&גמא;-חומצה אמינובוטירית (GABA)</td><td>Sigma</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>3&alpha;,21-Dihydroxy-5&alpha;-pregnan-20-one (THDOC)</td><td>Sigma</td><td>P2016</td><td></td></tr><tr><td>מנוע גריל</td><td>Faulhaber&nbsp;</td><td></td><td>מיקרו-מנוע DC סוג 2230 עם בורג מיקרומטר מסוג 22/2</td></tr><tr><td>מיקרומטר</td><td>Kiener-Wittlin</td><td>10400</td><td>TESA, AR 02.11201</td></tr><tr><td>פיפטות העברת פלסטיק סטריליות</td><td>Saint-Amand&nbsp; Mfg.</td><td>222-20 שניות</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

הביצית Xenopus כמערכת ביטוי Heterologous עבור חלבונים, תוארה לראשונה על ידי ואח Gurdon. 1 ו כבר בשימוש נרחב מאז גילויו (הפניות 2 - 3, והפניות בו). מאפיין זה הופך את הביצית אטרקטיבית לביטוי ערוץ הזר הוא שפע העניים של תעלות יונים אנדוגני 4. מערכת ביטוי זה הוכיח עצמו שימושי לאפיון של חלבונים רבים, ביניהם תעלות יונים מגודרת ליגנד. הביטוי של קולטנים של GABA ב ביציות Xenopus והאפיון הפונקציונלי שלהם מתואר כאן, כולל הבידוד של ביציות, microinjections עם קרנה, הסרת שכבות תאי זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו. הנהלים היו אופטימיזציה במעבדה זו 5,6 ו לסטות אלה בשימוש שגרתי 7-9. באופן מסורתי, ביציות ערומים ערוכותעם טיפול collagenase ממושך של אונות שחלה ב RT, וביציות הערומים האלה microinjected עם mRNA. באמצעות שיטות אופטימיזציה, חלבונים בממברנה מגוונים הובעו ולמד עם מערכת זו, כגון קולטנים של GABA רקומביננטי 10-12, תעלות כלוריד רקומביננטי אנושי 13, תעלות אשלגן Trypanosome 14, ו טרנספורטר מיו -inositol 15, 16. השיטות המפורטות כאן ניתן להחיל את הביטוי של חלבון כלשהו של בחירה ב ביציות Xenopus, ושינוי הפתרון המהיר שניתן להשתמש בם כדי ללמוד תעלות יונים ליגנד מגודרת אחרות.

ביציות Xenopus נבחרו באופן מכני באמצעות לולאה פלטינה (איור 1). הביציות היו microinjected עם mRNA הקידוד ל GABA A יחידות משנה קולטן אלפא 4, בטא 2, δ, 0.5: 0.5: 2.5 fmol / ביצית (איור 2). אחרי 4 ד, שכבות תאי זקיקים הוסרו (איור 3). ביציות מתח היו מהודקים שני ב -80 mV וחשוף ריכוז גדל והולך של חומצה γ-aminobutyric (GABA) בנוכחות של 1 מיקרומטר 3α, 21-dihydroxy-5α...

מתוארים נהלים אופטימליים לבידוד זקיקים בודדים, מיקרו-הזרקות RNA ציטופלזמיות, הסרת שכבות התאים הסובבות וביטוי חלבון בביציות Xenopus. בנוסף, מוצגת שיטה פשוטה לשינויי תמיסה מהירים בניסויים אלקטרופיזיולוגיים עם תעלות יונים מגודרות ליגנד.

Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבטא חלבונים חדשים, כגון תעלות יונים בביציות Xenopus. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בכל תחום הדורש מערכת ביטוי פונקציונלית. היתרונות העיקריים של הווריאציות של טכניקה זו הם המהירות, האמינות וההישרדות המשופרת של הביציות.שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקוד תעלות יונים. בנוסף, ניתן ליישם אותו לחקר כל חלבון אחר. הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשהבנו ששיטות קלאסיות הביאו לשיעור נמוך של הישרדות ביציות.לאחר הסרת אונות השחלות מנקבות הצפרדעים על פי פרוטוקול הטקסט, הניחו את האונות בתמיסת בארת סטרילית בתוספת פניצילין וסטרפטומיצין. חותכים את האונות כדי לאפשר גישה של הרקמה לחמצן. כדי לבודד את הזקיקים בשלב 5 עד 6, השתמש במלקחיים כדי להחזיק את השחלה ולאחר מכן הורד לולאת פלטינה מעל הזקיקים ומשוך בעדינות את הלולאה כדי לשבש את רקמת החיבור עם הזקיק מרקמת השחלה.מיין ביציות בעלות מראה בריא באמצעות לולאת הפלטינה. השתמש בפיפטה פסטר מפלסטיק כשהקצה חתוך לקוטר של 1.5 מילימטר כדי להעביר זקיקים נבחרים לצלחת פטרי בקוטר 35 מילימטר. לאחר הכנת cRNA לקולטן GABA A ופיפטות מיקרו-הזרקה לפי פרוטוקול הטקסט, השתמש בשמן פרפין ובמזרק של 10 מיליליטר עם מחט דקה למילוי חוזר של פיפטה מיקרו-הזרקה.לאחר מכן הרכיב את הפיפטה על מכשיר מיקרו-הזרקה ביתי. בעזרת פיפטה עם קצה פלסטיק סטרילי, הניחו טיפה של תמיסת mRNA על הצד הנקי של חתיכת תרמופלסטי עמיד בפני לחות. לאחר מכן טבלו את קצה פיפטת ההזרקה לתוך הטיפה והפעילו את המנוע כדי להחזיר את הבוכנה.תמיסת mRNA צריכה להיכנס לפיפטה וליצור ממשק גלוי עם השמן. לאחר מכן, החזר את קצה הפיפטה מהטיפה, והפעל לחץ חיובי על החלק הפנימי של פיפטת ההזרקה. טיפה של תמיסת mRNA אמורה להיווצר בקצה פיפטת ההזרקה.בעזרת צלחת פטרי בגודל 60 מילימטר עם רשת ניילון מודבקת לתחתית ומכוסה ב-MBS להזרקה, מיישרים את הזקיקים כשהעמודים הצמחיים שלהם פונים כלפי מעלה. בעזרת המיקרומניפולטור, מקם את פיפטת ההזרקה מעל זקיק בודד. הכנס את מחט ההזרקה למרכז הקוטב הצמחי והפעל לחץ חיובי על החלק הפנימי של הפיפטה כדי להזריק 50 ננוליטר mRNA בקצב זרימה של 0.6 מיקרוליטר לדקה.המתן חמש עד 10 שניות לפני הסרת קצה פיפטת ההזרקה מהזקיק כדי למנוע בריחת RNA שליח. מעבירים זקיקים מוזרקים לצלחת פטרי חדשה מלאה בשני מיליליטר MBS. מניחים את המנה במקרר יין המוגדר על 18 מעלות צלזיוס.דגרו על הזקיקים המוזרקים למשך יום עד שבעה ימים לפני ההקלטה, תלוי בזהות החלבון החדש שהתבטא. כדי להפשיט זקיקים, העבירו עשרה זקיקים שהוזרקו לצינור זכוכית בורוסיליקט המכיל 0.5 מיליליטר MBS, מיליגרם אחד למיליליטר קולגנאז ו-0.1 מיליגרם למיליליטר של מעכב טריפסין. טבלו את הצינור באמבט מים של 36 מעלות צלזיוס ודגרו על הזקיקים למשך 20 דקות.הטמפרטורה כאן היא קריטית מכיוון שמעלה אחת נוספת עלולה להרוג את הביציות. שטפו את הזקיקים על ידי העברתם לשפופרת שנייה המכילה מיליליטר אחד של MBS בטמפרטורת החדר, והשאירו אותם בצינור למשך כעשר שניות. לאחר מכן העבירו את הזקיקים לצינור שלישי המכיל 0.5 מיליליטר MBS בריכוז כפול המכיל ארבע מילימול טוחנות EGTA, ודגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות, תוך ניעור מדי פעם של הצינורות.זמן הדגירה של ארבע דקות הוא קריטי כדי להבטיח ששכבות הזקיקים יתנתקו מהביצית. שטפו את הזקיקים על ידי העברתם לצינור אחר המכיל מיליליטר אחד של MBS בטמפרטורת החדר, והשאירו אותם בצינור למשך כ-10 שניות. העבירו את הביציות לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר המכילה שני מיליליטר MBS.לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש בלולאת פלטינה כדי להפריד את המעטפות החיצוניות מהזקיקים פשוט על ידי דחיפת הביצית העירומה. אחסן את הביציות המרוקנות עד לשימוש. בניסוי זה, ביציות Xenopus שסומנו מכנית הוזרקו במיקרו ציפוי mRNA עבור יחידות משנה של קולטן GABA A.לאחר מכן הוסרו שכבות תאים זקיקים. הביציות היו מהודקות במתח ב-80 מילי-וולט שלילי ונחשפו לריכוזים הולכים וגדלים של GABA ולנוכחות של THDOC, מודולטור אלוסטרי חיובי חזק של קולטן GABA A. פאנל זה מציג אמפליטודות זרם שנוצרו בהתאם לריכוזי ה-GABA, מה שמעיד על הרגישות של שילוב תת-יחידה זה כלפי GABA.המשוואה ששימשה הייתה I(c)Imax/n)כאשר c הוא ריכוז ה-GABA, ה-EC50 הוא ריכוז ה-GABA בנוכחות THDOC מיקרו-מולרי אחד, מה שיוצר משרעת זרם חצי מקסימלית. איימקס היא משרעת הזרם המקסימלית. I הוא המשרעת הנוכחית, ו-n הוא מקדם היל.ה-EC50 של קולטן אלפא ארבע בטא שתיים דלתא GABA A הסתכם ב-0.41 0.12 מיקרו-מולרי ו-n היה 0.76 0.04 לאחר השליטה, ניתן להסיר שכבות תאים זקיקים תוך חצי שעה אם מבוצעים כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לשפר את הליך ביטוי החלבון בביציות Xenopus. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ביציות Xenopus המוקפות בשכבות תאים זקיקים, הזרקת המיקרו שלהם עם mRNA והסרה לאחר מכן של שכבות תאים זקיקים.

xenopus-oocytes-optimized-methods-for-microinjection-removal

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מדגימים microinjection cytoplasmic...

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

Xenopus עובריים epithelia הם מערכת מודל אידיאלי ללמוד התנהגויות התא כגון פיתוח הקוטביות ולשנות צורה במהלך המורפוגנזה אפיתל. היסטולוגיה מסורתית של דגימות קבוע ויותר כהשלמה הדמיה לחיות תאים confocal. כאן אנו מדגימים שיטות לבודד ברקמות הצפרדע לדמיין לתאי האפיתל לחיות לחיות cytoskeleton שלהם באמצעות תאים מיקרוסקופיה confocal.

Live-תא הדמיה וניתוח כמותי של תאים אפיתל עובריים ב Xenopus laevis</em

יונית הנוכחי של BK ערוצי נרשם באמצעות מהדק טכניקות תיקון. ערוצי BK באים לידי...

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

אנו מתארים שיטות למניפולציה של ביציות לא בשלות Xenopus laevis, הבשלת ביציות במבחנה לביציות והזרקת זרע תוך ציטופלזמית. פרוטוקול זה מאפשר פירוק של כמה חלבונים אימהיים וביטוי יתר של גנים מעניינים בעת ההפריה, ולכן הוא בעל ערך לחקר תפקידים של גורמים ספציפיים בהתפתחות עוברית מוקדמת.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

בקרת סינתזת חלבונים מתרחשת בעיקר בשלב התחלת התרגום, ליקויים בו קשורים להפרעות מגוונות. כדי להבין טוב יותר את האטיולוגיה שלהם, תיארנו כאן פרוטוקול המשתמש בביציות Xenopus laevis המעריך את התרגום של תעתיק mos בנוכחות מוטציה של גורם התחלת התרגום eIF4G1.

Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך

כתב היד כאן מספקת מערכת פשוטה של שיטות לניתוח ההפרשה ודיפוזיה של ligands מתויג fluorescently ב Xenopus. זה מספק הקשר לבדיקת היכולת של חלבונים אחרים לשנות הפצת יגנד ומאפשר ניסויים שעשויות לתת תובנה מנגנוני ויסות הדרגתיים מורפוגן.

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

אנו מתארים מערכת ביצית Xenopus וכובע בעלי חיים לשיבוט ביטוי של גנים המסוגלים לעורר תגובה באקטודרם מוכשר, ודנים בטכניקות לניתוח מאוחר יותר של גנים כאלה. מערכת זו שימושית בזיהוי פונקציונלי של מגוון רחב של תוצרי גנים.

שיבוט פונקציונלי שימוש<em&gt; Xenopus</emמערכת ביטוי ביצית&gt;

מאמר זה מתאר שיפור של קונבנציונאלי מתח פלמורומטריה (VCF) שבו פלואורסצנט טבעי חומצות אמינו (fUAA) משמשים במקום צבעים maleimide, כדי לבדוק סידורים מבניים בערוצי יון. ההליך כולל הזרקת Xenopus ביצית דנ"א, RNA / מטבע fUAA, ומדידות בו זמנית ו פלואורסצנטי.

מתח הידוק פלואומטריה ב<em&gt; קסנופוס</em&gt; ביציות באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטי לא טבעי

כאן אנו מציגים פרוטוקול לביטוי חלבוני צומת פערים בביציות קסנופוס ורישום זרם צומתי בין שתי ביציות באמצעות מגבר מסחרי המיועד לרישומי מהדק מתח ביציות כפול במצב מדידת זרם צד גבוה.

הקלטת זרם צומת גאפ מביציות קסנופוס

למדו שיטות אופטימיזציה להזרקת RNA ציטופלזמי ובידוד זקיקים בודדים בביציות Xenopus. טכניקות אלו משפרות שרידות התאים ומאפשרות שינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרופיזיולוגיה.

Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו

גלה סרטונים נוספים