Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבטא חלבונים חדשים, כגון תעלות יונים בביציות Xenopus. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בכל תחום הדורש מערכת ביטוי פונקציונלית. היתרונות העיקריים של הווריאציות של טכניקה זו הם המהירות, האמינות וההישרדות המשופרת של הביציות.

שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקוד תעלות יונים. בנוסף, ניתן ליישם אותו לחקר כל חלבון אחר. הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשהבנו ששיטות קלאסיות הביאו לשיעור נמוך של הישרדות ביציות.

לאחר הסרת אונות השחלות מנקבות הצפרדעים על פי פרוטוקול הטקסט, הניחו את האונות בתמיסת בארת סטרילית בתוספת פניצילין וסטרפטומיצין. חותכים את האונות כדי לאפשר גישה של הרקמה לחמצן. כדי לבודד את הזקיקים בשלב 5 עד 6, השתמש במלקחיים כדי להחזיק את השחלה ולאחר מכן הורד לולאת פלטינה מעל הזקיקים ומשוך בעדינות את הלולאה כדי לשבש את רקמת החיבור עם הזקיק מרקמת השחלה.

מיין ביציות בעלות מראה בריא באמצעות לולאת הפלטינה. השתמש בפיפטה פסטר מפלסטיק כשהקצה חתוך לקוטר של 1.5 מילימטר כדי להעביר זקיקים נבחרים לצלחת פטרי בקוטר 35 מילימטר. לאחר הכנת cRNA לקולטן GABA A ופיפטות מיקרו-הזרקה לפי פרוטוקול הטקסט, השתמש בשמן פרפין ובמזרק של 10 מיליליטר עם מחט דקה למילוי חוזר של פיפטה מיקרו-הזרקה.

לאחר מכן הרכיב את הפיפטה על מכשיר מיקרו-הזרקה ביתי. בעזרת פיפטה עם קצה פלסטיק סטרילי, הניחו טיפה של תמיסת mRNA על הצד הנקי של חתיכת תרמופלסטי עמיד בפני לחות. לאחר מכן טבלו את קצה פיפטת ההזרקה לתוך הטיפה והפעילו את המנוע כדי להחזיר את הבוכנה.

תמיסת mRNA צריכה להיכנס לפיפטה וליצור ממשק גלוי עם השמן. לאחר מכן, החזר את קצה הפיפטה מהטיפה, והפעל לחץ חיובי על החלק הפנימי של פיפטת ההזרקה. טיפה של תמיסת mRNA אמורה להיווצר בקצה פיפטת ההזרקה.

בעזרת צלחת פטרי בגודל 60 מילימטר עם רשת ניילון מודבקת לתחתית ומכוסה ב-MBS להזרקה, מיישרים את הזקיקים כשהעמודים הצמחיים שלהם פונים כלפי מעלה. בעזרת המיקרומניפולטור, מקם את פיפטת ההזרקה מעל זקיק בודד. הכנס את מחט ההזרקה למרכז הקוטב הצמחי והפעל לחץ חיובי על החלק הפנימי של הפיפטה כדי להזריק 50 ננוליטר mRNA בקצב זרימה של 0.6 מיקרוליטר לדקה.

המתן חמש עד 10 שניות לפני הסרת קצה פיפטת ההזרקה מהזקיק כדי למנוע בריחת RNA שליח. מעבירים זקיקים מוזרקים לצלחת פטרי חדשה מלאה בשני מיליליטר MBS. מניחים את המנה במקרר יין המוגדר על 18 מעלות צלזיוס.

דגרו על הזקיקים המוזרקים למשך יום עד שבעה ימים לפני ההקלטה, תלוי בזהות החלבון החדש שהתבטא. כדי להפשיט זקיקים, העבירו עשרה זקיקים שהוזרקו לצינור זכוכית בורוסיליקט המכיל 0.5 מיליליטר MBS, מיליגרם אחד למיליליטר קולגנאז ו-0.1 מיליגרם למיליליטר של מעכב טריפסין. טבלו את הצינור באמבט מים של 36 מעלות צלזיוס ודגרו על הזקיקים למשך 20 דקות.

הטמפרטורה כאן היא קריטית מכיוון שמעלה אחת נוספת עלולה להרוג את הביציות. שטפו את הזקיקים על ידי העברתם לשפופרת שנייה המכילה מיליליטר אחד של MBS בטמפרטורת החדר, והשאירו אותם בצינור למשך כעשר שניות. לאחר מכן העבירו את הזקיקים לצינור שלישי המכיל 0.5 מיליליטר MBS בריכוז כפול המכיל ארבע מילימול טוחנות EGTA, ודגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות, תוך ניעור מדי פעם של הצינורות.

זמן הדגירה של ארבע דקות הוא קריטי כדי להבטיח ששכבות הזקיקים יתנתקו מהביצית. שטפו את הזקיקים על ידי העברתם לצינור אחר המכיל מיליליטר אחד של MBS בטמפרטורת החדר, והשאירו אותם בצינור למשך כ-10 שניות. העבירו את הביציות לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר המכילה שני מיליליטר MBS.

לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש בלולאת פלטינה כדי להפריד את המעטפות החיצוניות מהזקיקים פשוט על ידי דחיפת הביצית העירומה. אחסן את הביציות המרוקנות עד לשימוש. בניסוי זה, ביציות Xenopus שסומנו מכנית הוזרקו במיקרו ציפוי mRNA עבור יחידות משנה של קולטן GABA A.

לאחר מכן הוסרו שכבות תאים זקיקים. הביציות היו מהודקות במתח ב-80 מילי-וולט שלילי ונחשפו לריכוזים הולכים וגדלים של GABA ולנוכחות של THDOC, מודולטור אלוסטרי חיובי חזק של קולטן GABA A. פאנל זה מציג אמפליטודות זרם שנוצרו בהתאם לריכוזי ה-GABA, מה שמעיד על הרגישות של שילוב תת-יחידה זה כלפי GABA.

המשוואה ששימשה הייתה I(c)Imax/n)כאשר c הוא ריכוז ה-GABA, ה-EC50 הוא ריכוז ה-GABA בנוכחות THDOC מיקרו-מולרי אחד, מה שיוצר משרעת זרם חצי מקסימלית. איימקס היא משרעת הזרם המקסימלית. I הוא המשרעת הנוכחית, ו-n הוא מקדם היל.

ה-EC50 של קולטן אלפא ארבע בטא שתיים דלתא GABA A הסתכם ב-0.41 0.12 מיקרו-מולרי ו-n היה 0.76 0.04 לאחר השליטה, ניתן להסיר שכבות תאים זקיקים תוך חצי שעה אם מבוצעים כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לשפר את הליך ביטוי החלבון בביציות Xenopus. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ביציות Xenopus המוקפות בשכבות תאים זקיקים, הזרקת המיקרו שלהם עם mRNA והסרה לאחר מכן של שכבות תאים זקיקים.