Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו
31 בדצמבר 2016
מתוארים נהלים אופטימליים לבידוד זקיקים בודדים, מיקרו-הזרקות RNA ציטופלזמיות, הסרת שכבות התאים הסובבות וביטוי חלבון בביציות Xenopus. בנוסף, מוצגת שיטה פשוטה לשינויי תמיסה מהירים בניסויים אלקטרופיזיולוגיים עם תעלות יונים מגודרות ליגנד.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבטא חלבונים חדשים, כגון תעלות יונים בביציות Xenopus. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בכל תחום הדורש מערכת ביטוי פונקציונלית. היתרונות העיקריים של הווריאציות של טכניקה זו הם המהירות, האמינות וההישרדות המשופרת של הביציות.
שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תפקוד תעלות יונים. בנוסף, ניתן ליישם אותו לחקר כל חלבון אחר. הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשהבנו ששיטות קלאסיות הביאו לשיעור נמוך של הישרדות ביציות.
לאחר הסרת אונות השחלות מנקבות הצפרדעים על פי פרוטוקול הטקסט, הניחו את האונות בתמיסת בארת סטרילית בתוספת פניצילין וסטרפטומיצין. חותכים את האונות כדי לאפשר גישה של הרקמה לחמצן. כדי לבודד את הזקיקים בשלב 5 עד 6, השתמש במלקחיים כדי להחזיק את השחלה ולאחר מכן הורד לולאת פלטינה מעל הזקיקים ומשוך בעדינות את הלולאה כדי לשבש את רקמת החיבור עם הזקיק מרקמת השחלה.
מיין ביציות בעלות מראה בריא באמצעות לולאת הפלטינה. השתמש בפיפטה פסטר מפלסטיק כשהקצה חתוך לקוטר של 1.5 מילימטר כדי להעביר זקיקים נבחרים לצלחת פטרי בקוטר 35 מילימטר. לאחר הכנת cRNA לקולטן GABA A ופיפטות מיקרו-הזרקה לפי פרוטוקול הטקסט, השתמש בשמן פרפין ובמזרק של 10 מיליליטר עם מחט דקה למילוי חוזר של פיפטה מיקרו-הזרקה.
לאחר מכן הרכיב את הפיפטה על מכשיר מיקרו-הזרקה ביתי. בעזרת פיפטה עם קצה פלסטיק סטרילי, הניחו טיפה של תמיסת mRNA על הצד הנקי של חתיכת תרמופלסטי עמיד בפני לחות. לאחר מכן טבלו את קצה פיפטת ההזרקה לתוך הטיפה והפעילו את המנוע כדי להחזיר את הבוכנה.
תמיסת mRNA צריכה להיכנס לפיפטה וליצור ממשק גלוי עם השמן. לאחר מכן, החזר את קצה הפיפטה מהטיפה, והפעל לחץ חיובי על החלק הפנימי של פיפטת ההזרקה. טיפה של תמיסת mRNA אמורה להיווצר בקצה פיפטת ההזרקה.
בעזרת צלחת פטרי בגודל 60 מילימטר עם רשת ניילון מודבקת לתחתית ומכוסה ב-MBS להזרקה, מיישרים את הזקיקים כשהעמודים הצמחיים שלהם פונים כלפי מעלה. בעזרת המיקרומניפולטור, מקם את פיפטת ההזרקה מעל זקיק בודד. הכנס את מחט ההזרקה למרכז הקוטב הצמחי והפעל לחץ חיובי על החלק הפנימי של הפיפטה כדי להזריק 50 ננוליטר mRNA בקצב זרימה של 0.6 מיקרוליטר לדקה.
המתן חמש עד 10 שניות לפני הסרת קצה פיפטת ההזרקה מהזקיק כדי למנוע בריחת RNA שליח. מעבירים זקיקים מוזרקים לצלחת פטרי חדשה מלאה בשני מיליליטר MBS. מניחים את המנה במקרר יין המוגדר על 18 מעלות צלזיוס.
דגרו על הזקיקים המוזרקים למשך יום עד שבעה ימים לפני ההקלטה, תלוי בזהות החלבון החדש שהתבטא. כדי להפשיט זקיקים, העבירו עשרה זקיקים שהוזרקו לצינור זכוכית בורוסיליקט המכיל 0.5 מיליליטר MBS, מיליגרם אחד למיליליטר קולגנאז ו-0.1 מיליגרם למיליליטר של מעכב טריפסין. טבלו את הצינור באמבט מים של 36 מעלות צלזיוס ודגרו על הזקיקים למשך 20 דקות.
הטמפרטורה כאן היא קריטית מכיוון שמעלה אחת נוספת עלולה להרוג את הביציות. שטפו את הזקיקים על ידי העברתם לשפופרת שנייה המכילה מיליליטר אחד של MBS בטמפרטורת החדר, והשאירו אותם בצינור למשך כעשר שניות. לאחר מכן העבירו את הזקיקים לצינור שלישי המכיל 0.5 מיליליטר MBS בריכוז כפול המכיל ארבע מילימול טוחנות EGTA, ודגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות, תוך ניעור מדי פעם של הצינורות.
זמן הדגירה של ארבע דקות הוא קריטי כדי להבטיח ששכבות הזקיקים יתנתקו מהביצית. שטפו את הזקיקים על ידי העברתם לצינור אחר המכיל מיליליטר אחד של MBS בטמפרטורת החדר, והשאירו אותם בצינור למשך כ-10 שניות. העבירו את הביציות לצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר המכילה שני מיליליטר MBS.
לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש בלולאת פלטינה כדי להפריד את המעטפות החיצוניות מהזקיקים פשוט על ידי דחיפת הביצית העירומה. אחסן את הביציות המרוקנות עד לשימוש. בניסוי זה, ביציות Xenopus שסומנו מכנית הוזרקו במיקרו ציפוי mRNA עבור יחידות משנה של קולטן GABA A.
לאחר מכן הוסרו שכבות תאים זקיקים. הביציות היו מהודקות במתח ב-80 מילי-וולט שלילי ונחשפו לריכוזים הולכים וגדלים של GABA ולנוכחות של THDOC, מודולטור אלוסטרי חיובי חזק של קולטן GABA A. פאנל זה מציג אמפליטודות זרם שנוצרו בהתאם לריכוזי ה-GABA, מה שמעיד על הרגישות של שילוב תת-יחידה זה כלפי GABA.
המשוואה ששימשה הייתה I(c)Imax/n)כאשר c הוא ריכוז ה-GABA, ה-EC50 הוא ריכוז ה-GABA בנוכחות THDOC מיקרו-מולרי אחד, מה שיוצר משרעת זרם חצי מקסימלית. איימקס היא משרעת הזרם המקסימלית. I הוא המשרעת הנוכחית, ו-n הוא מקדם היל.
ה-EC50 של קולטן אלפא ארבע בטא שתיים דלתא GABA A הסתכם ב-0.41 0.12 מיקרו-מולרי ו-n היה 0.76 0.04 לאחר השליטה, ניתן להסיר שכבות תאים זקיקים תוך חצי שעה אם מבוצעים כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לשפר את הליך ביטוי החלבון בביציות Xenopus. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ביציות Xenopus המוקפות בשכבות תאים זקיקים, הזרקת המיקרו שלהם עם mRNA והסרה לאחר מכן של שכבות תאים זקיקים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוצדורות אופטימליות לבידוד זקיקים בודדים ולביצוע מיקרו-הזרקות של RNA לציטופלזמה באוציטים של Xenopus. כמו כן, הוא מציג שיטה להחלפה מהירה של תמיסות בניסויים אלקטרופיזיולוגיים הכוללים תעלות יונים מופעלות על ידי ליגנדים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- ציותים של Xenopus משמשים בדרך כלל כמערכת מודל לחקר ביטוי חלבונים.
- שיטות קלאסיות גורמות לעיתים קרובות לשיעורי הישרדות נמוכים של הציותים.
- טכניקות משופרות יכולות להגביר את האמינות ואת מהירות הניסויים.
- הבנת תפקודם של תעלות יונים היא קריטית למגוון מחקרים ביולוגיים.
מטרת המחקר
- להביע חלבונים חדשים, ובמיוחד תעלות יונים, במערכת תפקודית.
- לספק תובנות לגבי תפקודן של תעלות יונים.
- לשפר את שיעורי ההישרדות של ציטות במהלך ניסויים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד זקיקים בודדים מאוציטים של Xenopus.
- מיקרו-הזרקות של RNA לציטופלסמה.
- הסרה של שכבות התאים המקיפות.
- ניסויי אלקטרופיזיולוגיה עם שינויים מהירים של התמיסה.
תוצאות עיקריות
- פרוצדורות אופטימליות הובילו לשיעורי הישרדות גבוהים יותר של ציטות ביצית.
- שיפור במהירות ובאמינות של ביטוי חלבונים.
- ביטוי מוצלח של תעלות יונים בציטות הביצית.
- הבנה משופרת של התפקוד של תעלות יונים.
מסקנות
- ניתן להחיל את השיטות המתוארות על חלבונים שונים מעבר לתעלות יונים.
- טכניקות אלו מייצגות התקדמות משמעותית בחקר מערכות ביטוי פונקציונליות.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בשיטות אלו למענה על שאלות ביולוגיות רחבות יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
אופטימלי Xenopus פרוטוקולים להזרקה מיקרוסקופית לתוך ציטות (oocytes) ולהסרה של תאי זקיק מאפשרים ביטוי תפקודי חסון של תעלות יונים וחלבוני ממברנה, ובכך תומכים בתיקוף מטרות בשלב מוקדם ובהפחתת סיכונים מכניסטיים במחקר ופיתוח בביופארמה.&ד. הרקע הנמוך של תעלות אנדוגניות במערכת והחילוף המהיר של התמיסות מקלים על ביצוע מדידות אלקטרופיזיולוגיות כמותיות, ובכך מגבירים את הביטחון החזוי בזיהוי וסינון מולקולות מובילות (leads). שיטות אלו מייעלות את המעבר מהשערה מולקולרית לקריאה תפקודית, ומפחיתות את העמימות הביולוגית בנקודות מפנה קריטיות בתהליך הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה&ד
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה תפקודית של תעלות יונים ונשאים מועמדים במערכת מבוקרת.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד פעילות ספציפית לחלבון מרקע אנדוגני.
- מקל על הערכה כמותית של פרמקולוגיית קולטנים מופעלים על ידי ליגנדים לצורך תיקוף מטרה.
- מספק פלטפורמה לבדיקה מהירה של היפותזות ולמיון תיקי פיתוח.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק הכנה הדירה וניתנת לשכפול של תאי ביצית (oocytes) עבור בדיקות אלקטרופיזיולוגיות המשך.
- מאפשר מדידות זרם כמותיות וסטנדרטיות לצורך סריקת תרכובות.
- תומך במוכנות הבדיקה להערכה בשיטות של סריקה רחבה (high-throughput) של מווסני תעלות.
- מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה עבור מטרות מגוונות של חלבוני ממברנה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים מדדים תפקודיים לפרמקולוגיה של תעלות יונים הרלוונטית למחלה, במידת הצורך.
- מספק רצף מגילוי מולקולרי ועד לאישור פרה-קליני של תפקוד התעלה.
- מאפשר קבלת החלטות לגבי קידום הפיתוח בהתאם לסיכון, על בסיס נתונים אלקטרופיזיולוגיים כמותיים.
- תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים עבור מטרות של תעלות יונים.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
פרוטוקולים אופטימליים אלו עבור אווציטים של Xenopus מציבים את הביטוי התפקודי ואת הניתוח האלקטרופיזיולוגי בממשק שבין הגילוי הראשוני, זיהוי המולקולות המובילות ומחקר פרה-קליני.
- ביולוגיה של התגליות: תומך בבדיקה מונחית-השערה של תפקוד חלבונים ממברנתיים ופרמקולוגיה.
- סריקה: מספק מדידות זרם כמותיות הניתנות לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר חישובים של EC50, מקדם היל (Hill coefficient) וזרם מקסימלי לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאים מולקולריים למודלים פרה-קליניים עבור מטרות של תעלות יונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להתאמה למחקרי ביטוי של חלבונים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והתפוקה של בדיקות פונקציונליות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשכה או הפסקת הפרויקט (go/no-go) וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום של תוכניות העוסקות בתעלות יונים ובנשאים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-הזרקה, טיפול באוציטים והקלטה אלקטרופיזיולוגית.
- מחייב גישה למכשור ייעודי עבור voltage clamp והחלפת תמיסות.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת אוציטים ובדיקות.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מחלקות חלבונים שונות או סוגי ליגנדים שונים.
- פרמטרי טמפרטורה ואינקובציה הם קריטיים להישמטות האוציטים ולהצלחת הבדיקה.
