אימונוהיסטוכימיה על סעיפים פרפין של האפידרמיס עכבר באמצעות נוגדנים פלורסנט

באפידרמיס. אימונוהיסטוכימיה היא אמצעי יעיל למיקום חלבונים ספציפיים לתא הביטוי שלהם. בסרטון זה, אנו מדגימים שיטה אמינה ללוקליזציה חיסונית של חלבון באפידרמיס, בה אנו משתמשים באופן שגרתי במעבדה שלנו.

היי, אני תמי מהמעבדה של ד"ר טורינו כאן בבניין הנמוך של מכון המחקר לבריאות אוטווה בתוכנית למחלות כרוניות. היום אנו הולכים להראות לכם הליך לאימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים על קטעי רקמה משובצים בפרפין של אפידרמיס עכבר. במעבדה שלנו, ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקולים לסמני התמיינות אפידרמיס אימונולוגיים באמצעות רקמה קבועה של BO.

כחלק מהאופטימיזציה, אנו שומרים על העור שטוח על ידי הנחתו על מגבת נייר לפני הקיבוע. הליך זה כולל דיסקציה של קיבוע האפידרמיס, התייבשות, הטמעת פרפין וחיתוך חתך, שעווה, אנטיגן התייבשות, חשיפת תיוג נוגדנים, ולבסוף הרכבה והדמיה עם אפי פלואורסצנטי. אז בואו נתחיל.

בעת שימוש בעכברים יילודים, אין צורך לגלח את עור הגב. עם זאת, כאשר יש לך עכברים מבוגרים שיש להם פרווה, אתה צריך לגלח את העור האחורי כדי שלא יפריע לחיתוך החלקים. כשאתה מבצע את הדיסקציה שלך, אתה רוצה להיזהר מאוד לא להכניס את המלקחיים שלך לאזורי העור שבהם אתה רוצה להשתמש לבדיקה שלך.

אז מה שאנחנו עושים זה פשוט לשים את המלקחיים סביב הקצה של המקום שבו אנחנו הולכים לחתוך, ואז אתה מרים בזהירות רבה, חותך את האפידרמיס, וזוכר לא לגעת באזור שבו אתה רוצה להשתמש לניסוי שלך. כשאנחנו מתקנים את העור, אנחנו לא רוצים שהעור יתגלגל ויהיה בתוך הצינורית. אנחנו רוצים שזה יהיה נחמד ושטוח.

אז מה שאנחנו עושים כדי לעזור לזה זה להניח את העור על מגבת נייר כך שהוא יישאר שטוח בזמן הקיבוע. אז עכשיו כשהעור יפה ושטוח על מגבת הנייר, מה שאנחנו עושים זה לחתוך את הקצוות או לקצץ אותם על מנת להסיר את החלקים שאולי פגענו בהם עם המלקחיים. ואז אתה חותך את העור לחתיכות קטנות מאוד בערך שני מילימטר על שני מילימטרים.

עכשיו הרקמה עומדת להיות מתוקנת. לאחר חיתוך העור לחתיכות הניתנות לניהול, אתה טובל אותו בתמיסת הבוין. מכסים את הצינורות, עוטפים את הצינורות בפרפיל ומניחים אותם על נדנדה.

לדגירה של לילה, חשוב לדגור בתמיסת הבוין רק 16 עד 18 שעות. תקופות קיבוע קצרות או ארוכות יותר יפגעו ברקמות שלך. הדגירה הסתיימה.

אתה שוטף את הטישו שלך עם PBS ולאחר מכן דרך סדרה של שטיפות אתנול תוך שימוש ב-30%50% ו-70% אלכוהול. אתה יכול לראות שה-BO הוא בצבע צהוב ושתוך כדי השטיפות, ככל שהבונים מדוללים החוצה, צבע הכביסה הופך פחות ופחות צהוב. אתה שוטף פעמיים 30 דקות בכל פעם.

לאחר השטיפה האחרונה באתנול, הדגימות מונחות באתנול טרי של 70% וניתן לאחסן אותן בארבע מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף של כמה פתחי אוורור של פרפין. הטבעה. שימוש יתר ברקמות קפואות גורם לכך ששלמות הרקמות עדיפה וניתן לאחסן דגימות לפרקי זמן ארוכים. באופן כללי, מתקני ליבה מייצרים תוצאות הניתנות לשחזור יותר.

עם זאת, אם יש לך את המתקן ומפעיל ייעודי שיש לו את המומחיות, ניתן לחתוך חלקים בתוך החברה. ללמוד לחתוך קטעים טובים הוא סוג של אמנות. לכן, אנו משתמשים במתקן ליבה.

לאחר קבלת השקופיות בחזרה ממתקן הליבה, ניתן לראות שהפרפין קיים בשקופיות. כסרט דק, השקופיות מונחות על רשת עטופה בנייר אלומיניום, ממש כמו תפוח אדמה אפוי ומודגרות במשך חמש דקות בחום של 55 מעלות. לאחר סיום הדגירה שלך, פרקו במהירות את השקופיות והניחו את השקופיות בטולואן למשך שלוש כביסות של חמש דקות.

חשוב מאוד לזכור שמכונות הכביסה הללו של חמש דקות צריכות להיות מתוזמנות היטב, דגירה ארוכה מדי, וטולואן לא יהיה טוב לדגימות שלך. לאחר שלוש הכביסות והטולואן, בצע שטיפה מהירה במאה אחוז אתנול. מאחר שאתנול וטולואן יוצרים משקע שיפריע לניסוי שלכם, זהו צעד חשוב מאוד שיש לזכור.

לאחר מכן, הדגימות עוברות התייבשות על ידי שקופיות דגירה, חמש דקות ב-95% אתנול, חמש דקות פנימה, 70% אתנול, ואז פעמיים חמש דקות במים. בשלב זה, ניתן לעבד רקמות לצביעה עם h ו-e. אנו משתמשים גם במתקן הליבה למטרה זו.

לחשיפת אנטיגן מסכה של 500 מיל של חוצץ ציטראט חד פעמי לתוך פלסטיק של ליטר אחד וטבול את המגלשות שלך. זכור להסיר את ידית המתכת ולהכניס את הכוס שלך למיקרוגל. מיקרוגל בעוצמה גבוהה במשך פעמיים חמש דקות.

זכרו לפתוח את הדלת כדי לקרר את המיקרוגל בין שתי הדגירות שלכם. לאחר סיום המיקרוגל, הסר את השקופיות ממאגר הציטראט הרותח והנח אותן בכלי מכתים המכיל מים חמים. אנחנו פשוט משתמשים במי ברז חמים ומטרת זה היא לקרר לאט לאט את המגלשות שלך מרתיחה לטמפרטורת החדר.

עכשיו אתה יכול לשטוף את השקופיות שלוש פעמים חמש דקות ב-PBS ואנחנו מוכנים להתחיל עם אימונוהיסטוכימיה. הדבר הראשון שעלינו לעשות כדי להתחיל לצבוע את מערכת החיסון הוא לייבש את האזור סביב הדגימות שלנו עם פיסת נייר טישו. על מנת למנוע זיהום צולב של נוגדנים, אנו תוחמים את האזור סביב הדגימות שלנו באמצעות חוסם נוזלים.

הכן תא לח על ידי הכנסת נייר פילטר לצלחת פטרי. השרו אותו במים, הסירו את עודפי המים והכניסו את המגלשות. הסיבה לכך שאנו משתמשים בתא לחות היא להבטיח שבמהלך תקופות הדגירה שלנו המגלשות שלנו לא יתייבשו.

חשוב מאוד שהשקופיות לא יתייבשו מכיוון שציור יגדיל את הרקע שלך. מגלשות חסומות בשלב זה עם מאגר דגירה למשך 30 דקות. לאחר החסימה, העבירו את השקופיות בחזרה למתלה השקופיות ודגרו במאגר הכביסה.

הסר את המאגר העודף בדיוק כפי שעשית קודם. החזירו את המגלשה לתא הלח ודגרו עם נוגדן ראשוני למשך שעה. בטמפרטורת החדר.

כאשר הדגירה של שעה תסתיים, החזירו את המגלשות למתלה השקופיות ושטפו עם מאגר כביסה למשך שלוש פעמים 10 דקות. לאחר השטיפות, הסר את מאגר הכביסה העודף מסביב לדגימה שלך בעזרת נייר טישו. החזירו את השקופיות לתא הלח ודגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר עם נוגדן משני לאחר הדגירה עם נוגדן משני, שטפו בשלושה שינויים של מאגר הכביסה 15 דקות כל אחד.

בשלב הבא אנו שוטפים תוך שלוש פעמים חמש דקות. ב-PBS, הסר את כל הנוזלים העודפים המקיפים את הדגימה ונגב את ה-PBS מהחלק האחורי של המגלשה כדי להרכיב את החלקות הכיסוי למגלשה. אנו משתמשים במובייל עם 2.5% DAB co.

על מנת להפחית את הדהייה, הוסף 80 מיקרוליטר טיפה לשקופיות. היזהר לא להכניס בועות. ואז לאט מאוד הורד על החלקת כיסוי.

הקפידו לא להשאיר בועות מאחור. בועות הן רעות מכיוון שלעתים קרובות הן נוחתות ממש על הדגימה שלך, בדיוק במקום שבו אתה רוצה לצלם את התמונות שלך לאחר שהנייד שלך יבש. עכשיו אתה מוכן לצאת לדרך: עיין בשקופיות שלך.

הנה מבט על צביעה מוצלחת באמצעות מסנן FITC. במטרה של פי 20, אנו רואים את קליין שש קשורה לכל השכבות הסופר-בסיסיות של האפידרמיס. המעבדה שלנו מתעניינת מאוד בביטוי ובלוקליזציה של קלאודינים באפידרמיס.

ביחס לצמתים הדוקים והיווצרות מחסום חדירות האפידרמיס, זה עתה הראינו לכם כיצד לבצע אימונוהיסטוכימיה על עור העכבר. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שאתה רוצה שחלקי הרקמה שלך יהיו שטוחים ושאתה רוצה לוודא שהשקופיות שלך לא יתייבשו בין הדגירות. אז זהו.

תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.