Name: הכנת פנים של כלי דם עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: למד הכנת פנים של כלי דם עכבר לזיהוי חלבונים ותאים בדופן כלי הדם באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו מאפשרת ניתוח הבדלים אזוריים בביטוי חלבונים בקרוטיד ובאורטה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

פעילות המחקר של המחברים נתמכים על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות לד&quot;ר אייב (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551).

הפרוטוקולים לעורקים חלקיקים עכבר חלקית קשירת ובידוד של אבי העורקים העכבר ועורק הראש עבור הפנים immunostaining הם מאושרים על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IBT 2014-9231). 1. משמאל חלקית עורק הלב הראשי קשירת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את שטח כירורגי על ידי הנחת 12 אינץ &#39;x 14 אינץ&#39; כרית חימום על השולחן לכסות את הפנקס ואת שולחן הדף עם וילון כירורגי גדול ונקי. התאם את הזרוע של הדום לעמוד כך שדה stereomicroscope של נוף הוא באזור המרכז של כרית חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כרית החימום על השולחן ולהגדיר את 3 חיוג בקרת חיוג לרמת החום בינוני. בהגדרת טמפרטורה זו, משטח הלוח הכירורגי (ראה 1.6.1) יהיה 38-40 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כלוב נקי על כרית חימום נוספת. הפעל את כרית חימום על מעל. כלוב זה ישמש להתאוששות לאחר הניתוח (ראה 1.16) וכן דיור. </li></ol></lI <li style=";text-align:right;direction:rtl"> על השולחן הכירורגי, הניחו את שקית עיקור autoclaved המכיל מספריים איריס (זוג אחד), מלקחיים רקמות (1 זוג), מלקחיים אחיזה סופר (2 זוגות), מספריים האביב (1 זוג), מפשק קהה (1 זוג, רוחב 2.5 מ&quot;מ) , עגול מטפל מחזיק מחט (1), מעוקרים 6-0 משי תפר, כותנה היטה applicators, כותנה מיני היטה applicators, וילונות כירורגי, 2 &quot;x 2&quot; גזה ספוגים. גם במקום בקבוק לסחוט המכיל אתנול 70% ועוד המכיל chlorhexidine scrubon כירורגי השולחן כירורגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקלו עכבר. משקל הגוף נדרש כדי לקבוע את הכמות המתאימה של כאבים, אשר ינוהל מיד לפני הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר לתוך החדר אינדוקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מיכל החמצן ואת מאדה הרדמה כדי להרדים את העכבר בחדר אינדוקציה. לשמור על רמת isoflurane ב 2%. זה לוקח 3-5 דקות לפני העכבר מפסיק לזוז. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד העכבר הוא להיות anestheTized, במקום חתיכה קטנה יותר של סטרילית כירורגי drape (24 אינץ &#39;24 אינץ&#39;) תחת stereomicroscope כדי ליצור משטח כירורגי. לאחר מכן מקום לוח כירורגי אקרילי (אשר נוקה עם אלכוהול 70%) על משטח וילונות. הלוח כירורגי ולכן צריך להיות על כרית חימום אבל מופרדים על ידי שתי שכבות של וילונות כירורגיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר העכבר מפסיק לנוע בחדר אינדוקציה, להעביר את העכבר לאזור הכנה טרום ניתוחי למקם את האף לתוך חרוט האף מחובר מאדה (2% isoflurane). הסר את השיער סביב אזור צוואר הרחם באמצעות גוזם חשמלי או מסיר שיער. אנו ממליצים על הסרת שיער קרם כי שיטה זו לא לייצר חתיכות שיער רופף, אשר קשה להסיר לחלוטין מן האזור כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם חרוט האף במקום, להזיז את העכבר ללוח כירורגית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת את כפות הרגליים הימנית והשמאלית אל לוח הניתוח. קלטת את שתי רגליה האחוריותבצד ימין של העכבר. זה גורם סיבוב קל של גוף העכבר כך בצד שמאל של אזור הצוואר של העכבר הופך להיות ממוקם טוב יותר לניתוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את אזור החתך עם אלכוהול 70%, chlorhexidine לשפשף, ושוב עם אלכוהול 70%. לכסות את העכבר עם וילון כירורגי מעוקרים למעט באזור החתך צוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישור על ידי קמצוץ הבוהן כי העכבר הוא הרדים לחלוטין לתת כאבים (Caprofen 3-5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) באמצעות הזרקה intraperitoneal או תת עורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, לעשות חתך קו האמצע הגחון סביב אזור צוואר הרחם באמצעות או אזמל או מספריים איריס. הערה: אנו משתמשים מספריים כי מרחק העבודה של stereomicroscope מוגבל, מה שהופך אותו קשה להשתמש באזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את עורק הצוואר השמאלי השמאלי (LCCA) על ידי דחיפת הצידה repositioning את בלוטות הרוק המכסים את כלי הדם בצד שמאל שלNimal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות את כל כלי הדם בשדה כירורגי ( איור 1 ). LCCA bifurcates לתוך עורק הצוואר הפנימי השמאלי (ICA) ואת עורק הצוואר החיצוני השמאלי (ECA). עורק התריס שטחי (STA) עולה ECA בצד המדיאלי. עורק העורקים (OA) עולה בדרך כלל מה- ECA, אך בחלק מהעכברים הוא נובע מה- ICA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקשור את כל ענפי העורק למעט OA באמצעות סטריליזציה 6-0 משי סטרילי. כדי להשיג זאת, להפוך את שתי ligations הבא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בעדינות את רקמת החיבור סביב ומתחת עורק הצוואר הפנימי השמאלי (ICA). לתפוס חתיכת precut 6-0 משי תפר (~ 2.5 ס&quot;מ) עם מלקחיים ולהעביר אותו מתחת לעורק. באמצעות זוג אחר של מלקחיים, למשוך את התפר בערך 1/3 אורכו ולקשור את העורק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את רקמת החיבור סביב עורק הצוואר החיצוני השמאלי (ECA) באותה הדרך שתוארה לעיל ולעשות פרוקסימלי קשירת שמאל thyroi השמאליעורק ד (STA) ( איור 1 ). היזהר לא לפגוע סיבי העצבים הפועלים בתוך שדה כירורגי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ligations אלה נעשו, להחזיר את בלוטות הרוק למצב המקורי להידד את שדה הניתוח על ידי הצבת 2-3 טיפות של מלח סטרילית. סגור את העור באמצעות sucures 6-0 מצופה vericl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניתוח, במקום את העכבר בכלוב מחומם מראש (ראה 1.2.1). העכבר צריך להתעורר בתוך 5 דקות ולהתחיל להסתובב. לאחר אישר כי העכבר מתנהג בצורה נורמלית, להביא את הכלוב לחדר הדיור בבעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לעכבר במשך 3 הימים הראשונים של ההתאוששות. העכבר יכול להישמר כל עוד הניסוי דורש בתנאים שונים כי פרוטוקול הניסוי קורא. ההכנות פנים יכול להיעשות בכל עת לאחר הניתוח. </li></ol> 2. פנים Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר עם CO 2 על ידי מנת יתר שאיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">קלטת את העכבר במצב שכיבה (בטן כלפי מעלה) על גבי לוח לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את חלל הבטן על ידי ביצוע חתך קו האמצע באמצעות מספריים איריס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את חלל החזה על ידי חיתוך הצלעות רוחבית לחזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות ניק בתוך קאווה הווריד או לחתוך אחד העורקים הירך עבור ניקוז הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט 26 G המצורפת ההתקנה זלוף הכבידה (120 ס&quot;מ לחץ מים) לתוך השיא של החדר השמאלי ו perfuse את מערכת הדם עם תמיסת מלח המכיל הפרין (40 U / mL). המשך את זלוף עד מלוחים הזורמים מתוך לחתוך הופך ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את מערכת זלוף מ מלוחים לפתרון קיבעון המכיל paraformaldehyde 4% ב PBS (פוספט שנאגרו מלוחים), ולהמשיך perfusing עבור 5 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את אבי העורקים ואת שני העורקים הימנית ואת ימין ושמאלי באמצעות מספריים מלקחיים בסוף המלקחיים, ומניחים צינור 50 מ&quot;ל חרוטי המכיל את מקבע על הקרח. </li><li&gt; להעביר את כלי לתוך צלחת פטרי המכיל PBS תחת מיקרוסקופ לנתח, בזהירות להסיר את רקמת השומן החיבור המצורפת העורקים אבי העורקים ואת הצוואר. להפריד ולפצל את העורקים אבי העורקים ואת הצוואר ארוך longitudinally לחשוף את האנדותל ( איור 2 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כל כלי בנפרד היטב של צלחת 12 גם המכיל 0.5 מ&quot;ל של פתרון permeabilizing (0.1% Triton X-100 ב PBS) לכל טוב. Permeabilize כלי דם במשך 10 דקות עם נדנדה בטמפרטורת החדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בקצרה עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחסום אתרים שאינם קשורים ספציפית נוגדן, דגירה כלי הדם בסרום 10% נורמלי מן המין החיה שבה נוגדנים משני נעשו, ב TTBS (טריס שנאגרו מלוחים (TBS) עם 2.5% Tween 20) במשך 30 דקות עם נדנדה ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כלי עם נוגדנים ראשוניים בדילול נאות ב TTBS עם סרום 10% נורמלי (כמתואר לעיל) בן לילה עם נדנדה על 4 מעלות צלזיוס. הרמהשל דילול יש לקבוע עבור כל נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את מכתים הבקרה הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כלי עם TTBS במקום נוגדן ראשוני ואחריו הדגירה עם נוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כלי עם TTBS המכיל לא החיסונית (או מראש החיסון) בסרום או Ig של אותו בעל חיים (מינים) שבו נוגדנים ראשוניים נעשו, ואחריו הדגירה עם נוגדנים משני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשמיט את הדגירה עם נוגדנים משני. דגימות בקרה אלה יש לטפל באותו אופן באותו זמן כאשר מכתים עם נוגדנים ספציפיים מבוצעת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את כלי הדם 3 פעמים עם TTBS במשך 10 דקות כל עם נדנדה ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדנים משני שכותרתו fluorescently מדולל כראוי TTBS עם סרום 10% נורמלי (כמתואר לעיל) במשך 1 שעות עם נדנדה ב RT. מכתים גרעיני עם DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) עשוי להיות מבוצע בו זמניתT בשלב זה על ידי הוספת 1 / 5,000 על ידי נפח של פתרון מלאי DAPI אשר מכיל 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של DAPI ב H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים עם TTBS במשך 10 דקות כל עם נדנדה ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים בקצרה ב- PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים טיפה אחת של מגיב נגד דהייה על כיסוי זכוכית (22 מ&quot;מ x 50 מ&quot;מ) והניח כלי דם על זכוכית לכסות עם האנדותל מול למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כוס שקופיות (22 מ&quot;מ x 75 מ&quot;מ) על כלי הדם, תוך הימנעות בועות השמנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופית על מעבדה נקייה לנגב ( למשל Kimwipe) ו לכסות את השקופית עם שתי חתיכות של מעבדה לנגב. בעדינות במקום 3.5 ק&quot;ג של משקל ( למשל, השתמש בקבוק מים על ספר עבה.) על השקופית במשך מקסימום של 5 דקות כדי לשטח את מדגם כלי הדם פנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המשקל ולנגב את פתרון עודף סביב coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לק ציפור על 4 הפינות של coverslip, במקום שקופיות בתיבת שקופיות, coverslip בצד למעלה, ולשמור בחושך ב RT(או 4 ° C) למשך הלילה. תהליך זה משטחים את הרקמה עוד יותר ומקלה לעשות מיקרוסקופיה בהגדלה גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את coverslip לחלוטין באמצעות לק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מיקרוסקופיה ברגע לק ציפורן יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, שקופיות חנות ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol>

<ol><li>Jelev, L., Surchev, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+simple+technique+for+en+face+endothelial+observations+using+water-soluble+media+-%27thinned-wall%27+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations.</a> J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).</li>
<li>Neill, J. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1803374/">The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis.</a> Ann Surg. 126 (3), 270-288 (1947).</li>
<li>Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+examining+the+endothelial+cytoskeleton+in+situ+using+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A method for examining the endothelial cytoskeleton in situ using immunofluorescence.</a> J Histochem Cytochem. 11 (11), 1317-1320 (1983).</li>
<li>Poole, J. C. F., Sanders, A. G., Florey, H. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13576293">The regeneration of aortic endothelium.</a> J Pathol Bacteriol. 75, 133-143 (1958).</li>
<li>Sade, R. M., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((En+face+stripping+of+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">En face stripping of vascular endothelium.</a> Microvasc Res. 4, 77-80 (1972).</li>
<li>White, G. E., Gimbrone, M. A. Jr, Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+expression+of+stress+fibers+in+vascular+endothelial+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the expression of stress fibers in vascular endothelial cells in situ.</a> J Cell Biol. 97 (2), 416-424 (1983).</li>
<li>Kim, D. W., Gotlieb, A. I., Langille, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+modulation+of+endothelial+F-actin+microfilaments+by+experimental+alterations+in+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclero%22%5BJournal%5D)">In vivo modulation of endothelial F-actin microfilaments by experimental alterations in shear stress.</a> Arteriosclero. 9, 439-445 (1989).</li>
<li>Haka, A., Potteaux, S., Fraser, H., Randolph, G., Maxfield, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+monocyte+subpopulations+in+murine+atherosclerotic+plaques+by+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of monocyte subpopulations in murine atherosclerotic plaques by multiphoton microscopy.</a> Plos ONE. 7 (9), 244823e(2012).</li>
<li>Chèvre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+imaging+of+intravascular+atherogenic+inflammation+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">High-Resolution imaging of intravascular atherogenic inflammation in live mice.</a> Circ Res. 114, 770-779 (2014).</li>
<li>Heo, K. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbed+flow-activated+p90RSK+kinase+accelerates+atherosclerosis+by+inhibiting+SENP2+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Disturbed flow-activated p90RSK kinase accelerates atherosclerosis by inhibiting SENP2 function.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1299-1310 (2015).</li>
<li>Le, N. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crucial+role+for+p90RSK-mediated+reduction+of+ERK5+transcriptional+activity+in+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ%22%5BJournal%5D)">A crucial role for p90RSK-mediated reduction of ERK5 transcriptional activity in endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> Circ. 127, 486-499 (2013).</li>
<li>Kano, Y., Katoh, K., Masuda, M., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+composition+of+stress+fiber-plasma+membrane+attachment+sites+in+endothelial+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Macromolecular composition of stress fiber-plasma membrane attachment sites in endothelial cells in situ.</a> Circ Res. 79, 1000-1006 (1996).</li>
<li>Nigro, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21173104">Cyclophilin A is an inflammatory mediator that promotes atherosclerosis in apolipoprotein E-dependent mice.</a> J Exp Med. 208 (1), 53-66 (2011).</li>
<li>Mattson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+arterial+blood+pressure+in+different+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice.</a> Am J Hypertens. 14 (5), 405-408 (2001).</li>
<li>Jinguji, Y., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.3109/10623329409024632">Stress fiber dependent axial organization of fibronectin fibrils in the basal lamina of the chick and mesenteric artery.</a> Endothelium. 2, 35-47 (1994).</li>
<li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Lust, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/articles/srep34331">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluations and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331(2016).</li>
</ol>

אף אחד

כאשר הטיפול בכלי הדם העכבר, חשוב לזכור כי האנדותל הוא שביר וכי כל כוח מכני מוגזם יפגע בתאי אנדותל. לדוגמה, תאים אנדותל לשבור או לנתק מן הקיר כלי אם כלי הוא perfused חזק מדי, אשר יכול לקרות בקלות כאשר vasculature הוא perfused באמצעות מזרק מופעל ביד. כדי לקבל לחץ זלוף מתמיד, אנו משתמשים במערכת זלוף הכבידה עם לחץ מים 120 ס&quot;מ מים. נמסר כי הלחץ העורקי הממוצע של עכבר, אשר נבדל על ידי זן, נע בין 130 ל 170 ס&quot;מ ...

עבור מחקרים היסטופתולוגיים על ידי מיקרוסקופ אור, שלוש חתיכות ממדי של רקמות ביולוגיות מעובדות באופן שגרתי עבור emaffment פרפין ואחריו חתך מכתים. מדגם רקמה כי כבר מוטבע paraffin עשוי להיות כמה מילימטרים בכל שלושת הממדים. עם זאת, לצורך מיקרוסקופ אור, זה חייב להיות מחולק הראשון, כך האור יכול לעבור ולאחר מכן מוכתמים כך בסעיף דק תשואות בניגוד מספיק הדמיה. בגלל דגימות מחולקים הם בדרך כלל 5-10 מיקרומטר עובי, אחד רואה רק חלק קטן מאוד של הדגימה כולה בשני ממדים בכל פעם. ניתן לאסוף סעיפים עוקבים, לאחר הדמיה כל סעיף בנפרד, לבצע שחזור ממוחשב בסיוע של תמונות 3D, אבל זו עבודה מייגעת אכן. Histopathology של כלי הדם, במיוחד לחקר הפתוגנזה של טרשת עורקים, מציג בעיות ייחודיות. טרשת עורקים היא מחלה מתפתחת שמתפתחתבאופן מקומי באזורים בהם מתרחשת זרימת דם מופרעת. יתר על כן, המחלה היא יזמה בתוך האינטימה, רקמה דקה המורכבת monolayer של תאים אנדותל ו מטריקס תאיים, של העורקים הגדולים. מסיבות אלה, זהו אתגר לאתר ולחקור lesions מוקדם באמצעות כלי הדם מחולק כי אחד יכול בקלות להחמיץ חתך את הנגע. גם אם סעיף כולל אזור חולה, אחד יראה רק חלק 5-10 מיקרומטר המכיל תאים אנדותל ותאי קיר כלי דם אחרים בתקשורת adventitia. הר שלם בפנים (המובהק än fäs) ההכנות מאפשרות לנו סקר שטח רחב של משטח כלי הדם כגון האאורטה כולה מן שורש אבי העורקים כל הדרך עד לעורקים השד הנפוצים. באמצעות דוגמה כזו מוכתם נוגדנים ספציפיים ובדיקות ספציפיות אחרות, ניתן לאתר את המיקום של נגעים וגם שם אירועים מולקולריים שונים להתרחש בתאי אנדותל יחד עם wiכמו שינויים בביטוי, בלוקליזציה ושינויים פוסט-טראנסציוניים של חלבונים. בנוסף ללימוד אנתרוגנזה, צורת התא האנדותל שנצפתה בהכנות לפנים משמשת אינדיקטור לתבנית זרימת הדם הממוצעת בזמן. נתונים אלה חשובים ללימוד mechanosignaling של תאים אנדותל באתרם. לשם כך, שגרתית היסטולוגית חתך כלי הדם אינם שימושיים. לכן, עבור רפואה וסקולרית וביולוגיה, חשוב במיוחד לרכוש טכניקה להכנת ההכנות הפנים של כלי הדם המאפשר אחד להתבונן שטח רחב של משטח כלי השיט, כמו גם את אזורים תת קרקעיים עמוק יותר של כלי השיט. כפי שנבדקו על ידי Jelev ו Surchev 1 , ביולוגים כלי הדם פיתחו שיטות שונות כדי לצפות בטנה של כלי הדם על הפנים. כמה שיטות גאוני פותחו בשנות 1940 ו 1950 של. באמצעות שיטות אלה, הם היו<html> מסוגל ללמוד את הארגון הבסיסי של תאים אנדותל כי קו פני השטח הפנימיים של כלי הדם. עם זאת, בגלל הדרך ההכנות האלה מוכנים מוכנים (מה שנקרא שיטת Hautchen 2 , 3 , 4 או קילוף את פני השטח של כלי השיט 5 ) ואת האופן שבו הדגימה היה מוכתם, זה לא תמיד היה ניתן להשיג ללא הפרעה מורפולוגית מידע מכלי השיט אל האזורים העמוקים יותר של דופן כלי הדם. הר שלם בפנים הכנה הכנה בשילוב עם מכתים immunofluorescence אפשרה לנו לא רק ללמוד מורפולוגיה תא האנדותל ביטוי חלבון לוקליזציה בתאים אלה, אלא גם כדי להרחיב מחקרים כאלה לאזור subendothelial של קיר כלי השיט. מחקרים מוקדמים באמצעות ההכנות כלי דם פנים מוכתם immunoflorescently החלו להופיע בשנות ה -1980 של 6 ,F &quot;&gt; 7. עם הופעתו של מיקרוסקופ לייזר סריקת confocal ומיקרוסקופ multiphoton לאחרונה יותר לאחרונה, אחד יכול כעת לקבל תמונות ברורה להתמקד של כלי הדם מבנה הקיר בדגימות כלי רכב מוכתמים immunofluorescently אל פנים, כמו גם את רשת כלי הדם בבעלי חיים חיים 8 , 9 , 10 , 11. אלה מבוססי מחשב טכניקות הדמיה ליצור במיקוד אופטי חתך תמונות, ועל ידי ערימת תמונות כאלה, אפשר לקבל תמונות 3D משוחזרים של קיר כלי הדם ואת רשת כלי הדם ברקמות.בנוסף, אחד יכול ליצור תמונות של קטע שנעשה לאורך ציר ה- Z של התמונה המשוחזרת 12 , 13 . במאמר זה, נוכל להמחיש שיטה להכנת ההכנות פנים של אבי העורקים העכבר ואת עורק הצוואר מכתים אימונופלורסנט. הכנות פניםיכול להתבצע גם לאחר כלי אלה כבר מניפולציה ניסיונית. לדוגמה, עורק הראש יכול להיות ligated חלקית ולאחר מכן הכנה פנים עשה לאחר ניתוח כזה. מסיבה זו, אנו גם לתאר במאמר זה איך אנחנו עושים קשירת חלקית על עורק הצוואר. בהשוואה להכנת תכשירים דומים מחיות גדולות יותר, כגון עכברושים, ארנבות ובני אדם, כלי העכברים קטנים בגודלם ובריריים יותר, מה שדורש טיפול נוסף לטיפול במהלך בידוד כירורגי של כלי הדם והכנתם לצביעת נוגדן ומיקרוסקופ. בגלל המודל החייתי הנפוץ ביותר עבור שינוי גנטי הוא העכבר, זה הופך להיות קריטי עבור חוקרים רבים להתמודד עם כלי העכבר מבלי לפגוע בהם. בכתב יד זה, נתאר כיצד להתמודד עם כלי הדם העכבר בעת ביצוע ההכנות פנים של אבי העורקים בעורק ואת עורק הצוואר. לצורך ההדגמה, נשתמש בעכברי בר C57 / b6.

<table><tbody><tr><td>0.9% תמיסת הזרקת נתרן כלורי USP 500 מ"ל שקית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>NC9788429</td><td></td></tr><tr><td>12 בארות פישר</td><td>סיינטיפיק</td><td>12556005</td><td></td></tr><tr><td>6-0 תפר ויקריל מצופה</td><td>Ethicon</td><td>J833G</td><td></td></tr><tr><td>AF488 עז נגד חולדות IgG&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11006</td><td></td></tr><tr><td>AF546 עיזים נגד ארנב IgG&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD144 (Ve-Cad)</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555289</td><td></td></tr><tr><td>Anti-VCAM-1 (H-276) ארנב פוליקלונלי IgG</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>Sc-8304</td><td></td></tr><tr><td>Aoto Flow System</td><td>Braintree Scientific</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr><tr><td>עטיפת חיטוי. 24 אינץ' x 24 אינץ'</td><td>Cardinal Health</td><td>4024</td><td></td></tr><tr><td>מחזירים קהיםרוחב 2.5 מ"מ</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-10</td><td></td></tr><tr><td>קפרופן (רימדיל)&nbsp;,</td><td>zoetis</td><td>NADA#141-199</td><td></td></tr><tr><td>פילינג כלורהקסידין, 2%</td> <td>Med-Vet International</td><td>RXCHLOR2-PC</td><td></td></tr><tr><td>ספוגי גזה Curity 2 x 2</td> כרית חימום חשמלית <td>Cardinal Health</td><td>KC2146</td><td></td></tr>, <tr><td>12 x 14</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0667724</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים דקים במיוחד Fine Graefe</td><td>Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td> <td>איריסFine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי מיקרו 22 מ"מ x 50 מ"מ</td><td>VWR</td><td>48393059</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-18</td><td></td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל</td><td>Equitech-Bio</td><td>GS05</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פרפורמלדהיד 4% ב-PBS</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי 100 מ"מ x 15 מ"מ</td><td>פישר Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade mountant with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P-36935</td><td></td></tr><tr><td>Puritan cortton swabs</td><td>VWR</td><td>10806-005</td><td></td></tr><tr><td>Puritan Mini כותנה עם קצה אפליקטורים</td><td>VWR</td><td>82004-050</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחט עם ידית עגולה</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>12076-12</td><td></td></tr><tr><td>תפר משי 6/0</td><td>מדע משובח כלים</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>מספריים אביביים</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5601</td><td></td></tr><tr><td>מספריים פזילה</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>14075-09</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים סופר אחיזה</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>00649-11</td><td></td></tr><tr><td>חבישה שקופה</td><td>קרדינל בריאות</td><td>TD-26C</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-1000</td><td>פישר AC327371000</td><td></td><td></td> מדעי</tr></tbody></table>

הכנת פנים של כלי דם עכבר

En Face Preparation of Mouse Blood Vessels

חלקים של רקמות מוטבע פרפין משמשים באופן שגרתי לחקר היסטולוגיה רקמות היסטופתולוגיה. עם זאת, קשה לקבוע מה מורפולוגיה רקמת תלת מימדי הוא מן הסעיפים האלה. בנוסף, קטעים של רקמות שנבדקו לא יכול להכיל את האזור בתוך הרקמה הדרושה לצורך המחקר המתמשך. הגבלה זו מעכבת מחקרים היסטופאתולוגיים של כלי הדם מאז לפתח נגעים וסקולריים באופן ממוקד. זה דורש שיטה המאפשרת לנו לסקור שטח רחב של קיר כלי הדם, מפני השטח שלו לאזורים עמוקים יותר. הר שלם בפנים הכנה של כלי הדם ממלא דרישה זו. במאמר זה, נוכל להדגים כיצד לעשות ההכנות פנים של אבי העורקים בעורק ואת עורק הצוואר כדי כתם immunofluorescently עבור מיקרוסקופיה confocal וסוגים אחרים של הדמיה מבוססי פלואורסצנטי.

תמונה טיפוסית הפנים immunofluorescence של האנדותל מוצג באיור 3 . תמונה זו מראה קטע אופטי אחד של אבי העורקים של העכבר נלקח ליד פתיחתו של עורק בין דודי (אזור ביצה כהה גדול). אבי העורקים היו מוכתמים פעמיים עם אנטי VE-cadherin (ירוק) ואנטי-VCAM-1 (דלקת תא הידבקות מולקולה -1) (אדום). כל תא האנדותל מתואר עם מכתים ליניארי ירוק בצומת adherens. בשל חוסר אחידות קטין של הדגימה, כמה צמתים adherens נמצאים מחוץ זה קטע אופטי. אנטי VCAM-1 מכתים חז...

נוהל להכנת ההכנות הפנים של העורק הראשי עורקים אבי העורקים מתואר. הכנות כאלה, כאשר מוכתמים immunofluorescently עם נוגדנים ספציפיים, מאפשרים לנו ללמוד לוקליזציה של חלבונים זיהוי של סוגי תאים בתוך הקיר כולו כלי הדם על ידי מיקרוסקופיה confocal.

Sections of paraffin embedded tissues are routinely used for studying tissue histology and histopathology. However, it is difficult to determine what the ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להכין את האורטה ועורק התרדמת של העכבר לצביעה אימונוהיסטוכימית בשיטת en face לאחר קשירה של עורק התרדמת השמאלי. שיטה זו מאפשרת לנו לבחון את הארגון, את הביטוי של כל חלבון ואת המצב האפשרי של תאי האנטרום ותאים וסקולריים אחרים בשיטות צביעה אימונוהיסטוכימית. הכנות בשיטת en face מאפשרות ניתוח של שטחים נרחבים לרוח כלי הדם לצורך הערכת הבדלים אזוריים בביטוי של פרמטרים תאיים נורמליים ואפשריים שונים.ד"ר Quaico, מיקרו-כירורג מהקבוצה שלנו, ידגים את הפרוצדורה. התחילו בהנחת העכבר המורדם על לוח ניתוח בתנוחה גבית (supine). לאחר וידוא היעדר תגובה לצביטה באצבעות, הדביקו את כפות הרגליים הקדמיות ללוח במצב מתוח, ואת שתי הרגליים האחוריות לצד ימין של העכבר כדי לחשוף את צד שמאל של הצוואר.הסר את הפרווה מסביב לאזור הצוואר וחטא את העור החשוף. כסה את העכבר בסדין כירורגי סטרילי עם פתח מעל אזור הניתוח ומרח משחה על עיני בעל החיים. העבר את העכבר אל מתחת למיקרוסקופ הדיסקיסיה, ובצע חתך קו אמצע ונטרלי באזור הצוואר.הזיזו את בלוטות הרוק המכסות את כלי הדם לצד שמאל של בעל החיים כדי לחשוף את העורק התריסי המשותף השמאלי, המתפצל לעורק התריסי הפנימי השמאלי ולעורק התריסי החיצוני השמאלי. הסירו בעדינות את רקמת החיבור שסביב ומתחת לעורק התריסי הפנימי השמאלי, והשתמשו בפינצטה כדי להעביר קטע של 2.5 סנטימטר ש

en-face-preparation-of-mouse-blood-vessels

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מאמר זה מתאר שיטה תיוג עור וכלי דם עובריים התימוס.

שיטה תיוג vasculature ב עכברים עובריים

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד צינורות האנדותל מפרנכימה מוחית של עכבר. באמצעות שילוב של עיכול אנזימטי ודיסוציאציה מכנית, התהליך מניב צינור שלם עם תאי אנדותל.

הכנת צינורות אנדותל מוחיים מעורקים פרנכימליים של עכבר

<em&gt; In vivo</em&gt; Assay לבדיקת חדירות כלי דם

אנו מתארים בדיקת פקק מטריג'ל כדי להמחיש את הפוטנציאל האנגיוגני של מאגר של גורמים המופרשים על ידי תאים סרטניים באמצעות שתי שיטות הדמיה משלימות, אולטרסאונד ואנדומיקרוסקופיה. המטריגל, ג'ל מחקה מטריצה חוץ-תאית (ECM), משמש להחדרת גורמים אנגיוגניים למארח (עכבר) המופרשים למדיה המותנית (C.M).

פונקציונליות ניטור ומורפולוגיה של כלי דם גויס על ידי גורמים מופרשים על ידי תאים מניבי גידול בצמיחה מהיר

אנו מתארים את הבידוד של מטריצה חוץ-תאית לבבית מעכברי ביקורת C57Bl/6J, עכברים בעלי עור מתוח ועכברים בעלי עור מתוח שטופלו בפפטיד מעכב IRF5. אנו מתארים גם את מחקרי הרחבת כלי הדם על כלי הדם המבודדים מ-C57Bl/6J, עכברים בעלי עור מתוח ועכברים בעלי עור מתוח שטופלו בפפטיד מעכב IRF5.

Vasodilation של כלי מבודד והבידוד של מטריקס של עכברים צמוד עור

מחלות רבות סכנת חזון עינית משויכות לקוי microvessels ברשתית. לכן, המדידה של תגובות arteriole ברשתית הוא חשוב לחקור את המנגנונים הקשורים pathophysiological המשמש כבסיס. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט עבור בידוד arteriole רשתית העכבר והכנות כדי להעריך את ההשפעות של חומרים vasoactive על קוטר כלי הדם.

שלבי הכנה מדידה של תגובתיות ב העכבר רבים ברשתית Vivo לשעבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לצביעת התאים. האנדותל של בית העורקים של העכבר ישירות טכניקה זו שימושית כשאתה לומד את הפנוטיפים הסלולאריים והמולקולריים של תאי האנדותל בדפוסי זרימה שונים ובפיתוח טרשת עורקים.

שימוש בפני הפנים הללו Immunofluorescence כתמים כדי להתבונן בתאי כלי דם אנדותל ישירות

פרוטוקול זה מציג צעדים לרכישה וניתוח של תמונות סידן פלואורסצנטיות מפריקיטים משחישת מוח ונתוני זרימת דם מכלי דם סמוכים בעכברים מרדים. טכניקות אלה שימושיות למחקרים של פיזיולוגיה של תאי קיר וניתן להתאים אותן לחקור סידן ארעי בכל סוג תא.

דימות פריסייט במוח והדמיה המודינמית בעכברים מהונדסים ב- Vivo

באופן קלאסי, האנדוקרדיום של פרימורדיום המסתם העוברי של העכבר נותח באמצעות חתכים רוחביים, קורונליים או סגיטליים. הגישה החדשנית שלנו להדמיה דו-ממדית של האנדוקרדיום באזורים וולוולוגניים מאפשרת קוטביות מישורית וניתוח סידור מחדש של התאים של האנדוקרדיום במהלך התפתחות המסתם.

פנים אל פנים הכנה לכרית אנדוקרדיאלית לניתוח מורפוגנזה מישורית בעוברי עכברים

אנו מדגימים התרחבות כימית של כלי דם גדולים בעכברים כמודל לחקר תפקוד לקוי של כלי הדם במוח, אשר יכול לשמש עבור מודלים של דמנציה וסקולרית ואלצהיימר. אנו גם מדגימים הדמיה של כלי הדם על ידי הזרקת תרכובת גומי סיליקון ומתן הדרכה חזותית ברורה למדידת שינויים בגודל כלי הדם.

גישה חזותית לגרימת דוליכואקטזיה בעכברים כדי למדל תפקוד לקוי של כלי דם גדולים בתיווך כלי דם במוח

הפריציטים בכלי הדם ברשתית נבדקו על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית עם β קולטן גורם גדילה שמקורו בטסיות דם לאחר הזרקה רטרו-אורביטלית של לקטין עגבניות פלואורסצנטי. הרשתית המסומנת טופלה עוד בשיטת ניקוי הרקמות והותקנה בשלמותה להמחשת התצוגות התלת מימדיות של פריציטים המקיפים את כלי הדם ברשתית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

הדמיה תלת מימדית של פריציטים וסקולריים ברשתית בעכברים על ידי צביעה חיסונית 

למד הכנת פנים של כלי דם עכבר לזיהוי חלבונים ותאים בדופן כלי הדם באמצעות מיקרוסקופיית קונפוקל. שיטה זו מאפשרת ניתוח הבדלים אזוריים בביטוי חלבונים בקרוטיד ובאורטה.

הכנת פנים של כלי דם עכבר

גלה סרטונים נוספים