הכנת פנים של כלי דם עכבר

נוהל להכנת ההכנות הפנים של העורק הראשי עורקים אבי העורקים מתואר. הכנות כאלה, כאשר מוכתמים immunofluorescently עם נוגדנים ספציפיים, מאפשרים לנו ללמוד לוקליזציה של חלבונים זיהוי של סוגי תאים בתוך הקיר כולו כלי הדם על ידי מיקרוסקופיה confocal.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להכין את אבי העורקים ועורק הצוואר של העכבר לצביעה חיסונית בפנים לאחר קשירת עורק הצוואר השמאלי. שיטה זו מאפשרת לנו לחקור ארגון, כל ביטוי חלבון ומצב אפשרי של תאים אנטרליים ותאי כלי דם אחרים בשיטות צביעה חיסונית. תכשירים פנים מאפשרים ניתוח של אזורים גדולים על פני כלי הדם להערכת ההבדל האזורי בביטוי של פרמטרים תאיים נורמליים ואפשריים שונים.

מי שידגים את ההליך יהיה ד"ר קוואיקו, מיקרו-מנתח בקבוצה שלנו. התחל בהנחת העכבר המורדם על לוח כירורגי במצב שכיבה. לאחר אישור חוסר תגובה לסרט צביטה בבוהן, הכפות הקדמיות ללוח במצב מתוח החוצה ושתי הרגליים האחוריות לצד ימין של העכבר כדי לחשוף לצד שמאל של הצוואר.

הסר את השיער סביב אזור צוואר הרחם וחטא את העור החשוף. מכסים את העכבר בווילון כירורגי מעוקר עם חור מעל אזור הניתוח ומורחים משחה על עיני החיה. הזיזו את העכבר מתחת למיקרוסקופ הניתוח, ובצעו חתך בקו האמצע הגחוני סביב אזור צוואר הרחם.

מקם מחדש את בלוטות הרוק המכסות את כלי הדם לצד שמאל של החיה כדי לחשוף את עורק הצוואר המשותף השמאלי, המתפצל לעורק הצוואר הפנימי השמאלי ולעורק הצוואר החיצוני השמאלי. הסר בעדינות את רקמת החיבור סביב ומתחת לעורק הצוואר הפנימי השמאלי והשתמש במלקחיים כדי להעביר תפר משי באורך 2.5 סנטימטר מתחת לעורק, תוך שימוש במלקחיים שניים כדי למשוך את התפר בערך שליש מאורכו לצד השני של הכלי. קשר את עורק הצוואר הפנימי השמאלי.

לאחר מכן הסר את רקמת החיבור סביב עורק הצוואר החיצוני השמאלי כפי שהודגם זה עתה, ובצע קשירה פרוקסימלית לעורק בלוטת התריס העליון השמאלי. כאשר כל העורקים למעט העורק העורפי נקשרים, החזר את בלוטות הרוק למיקומן המקורי והרטיב את שדה הניתוח בשתיים עד שלוש טיפות מי מלח. לאחר מכן השתמש בשישה תפרי ויקריל מצופים O כדי לסגור את העור ולהניח את העכבר בכלוב שחומם מראש עם ניטור עד לשכיבה מלאה.

בסיום הניסוי אבטח את העכבר במצב שכיבה על לוח חיתוך והשתמש במספריים לקשתית כדי לחשוף את חלל הבטן עם חתך בקו האמצע. חותכים את הצלעות לרוחב עצם החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה. לאחר מכן חתכו את עורק הירך והכניסו מחט בגודל 26 המחוברת לשפע כוח הכבידה שהוקם בקודקוד החדר השמאלי כדי להעשיר את מערכת הדם בתמיסת מלח בתוספת הפרין.

המשיכו בשפע עד שהמלח הזורם מהחתך יתבהר. לאחר מכן העבר את מערכת השפע ממלח ל-4% פרפורמלדהיד ב-PBS. לאחר חמש דקות העבירו את העכבר מתחת למיקרוסקופ הניתוח והשתמשו במספריים ובמלקחיים קהים כדי לקצור את אבי העורקים ואת עורקי הצוואר השמאלי והימני.

לאחר מכן, העבירו את הרקמות לצלחת פטרי של PBS והסירו בזהירות את השומן ורקמות החיבור, ולאחר מכן את ההפרדה ופיצול אורכי של אבי העורקים ועורקי הצוואר כדי לחשוף את האנדותל. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ביצוע תכשירים לכלי דם פנים הוא שתאי האנדותל נפגעים בקלות על ידי טיפול גס. אין למתוח את הכלים בשום עת, במיוחד בשלבי הקטיף והניקוי.

לאחר מכן העבירו כל כלי לבארות בודדות של צלחת 12 בארות המכילה 0.5 מיליליטר תמיסה חדירה לבאר. לחלחל את כלי הדם למשך 10 דקות עם נדנוד בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטיפה קצרה ב- PBS. חסום כל קשירה לא ספציפית עם דגירה של 30 דקות בסרום 10% נורמלי מאותו מין כמו הנוגדנים המשניים המתוכננים ב-TTBS, עם נדנוד בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן סמן את הדגימות עם הנוגדנים העיקריים המעניינים מדוללים ב-TTBS עם סרום 10% נורמלי למשך הלילה עם נדנוד בארבע מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, שטפו את כלי הדם בשלוש שטיפות של 10 דקות ב-TTBS עם נדנוד בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגירה בנוגדנים המשניים המתאימים המדוללים ב-TTBS ו-10% סרום רגיל ו-dappy. החזר את הדגימות לנדנדה ולכסות כדי להגן מפני אור.

לאחר שעה בטמפרטורת החדר עם נדנדה יש לשטוף את הדגימות שלוש פעמים ב-TTBS טרי כפי שהודגם, ולאחר מכן שטיפה קצרה ב-PBS, ולהניח טיפה אחת של מגיב נגד דהייה לכל כלי על כוסות כיסוי בודדות בגודל 22 על 50 מילימטר. תחת מיקרוסקופ, הנח כלי אחד לכל טיפת ריאגנט כשהאנדותל פונה כלפי מטה, וכסה את הכלים בכוס שקופית אחת בגודל 22 על 75 מילימטר לכל דגימה. הניחו את השקופיות על מגבון מעבדה נקי וכסו אותן בשתי חתיכות מגבון מעבדה ומשקל של 3.5 קילוגרם כדי לשטח את הכלים.

לאחר חמש דקות לכל היותר, הסר את המשקל ונגב את התמיסה העודפת מסביב להחלקות הכיסוי. לאחר מכן מרחו לק על ארבע הפינות של החלקות הכיסוי והניחו את השקופיות בקופסת שקופיות, כשצד החלקה של הכיסוי כלפי מעלה. למחרת בבוקר השתמשי בלק נוסף כדי לאטום את החלקות הכיסוי לחלוטין ולדמיין את הכלים ברגע שהלק יבש.

כאן מוצגת תמונה טיפוסית של תפרחת חיסונית של אנדותל צבוע כפול עם אנטי VE cadherin ומולקולת הידבקות תאים אנטי וסקולריים נוגדנים אחד וממחישה קטע אופטי יחיד של אבי העורקים של עכבר שצולם ליד פתח עורק בין-צלעי. שימו לב לצביעת קווי המתאר הליניאריים הירוקים בצומת ההיצמדות של תאי האנדותל ולמולקולת ההידבקות האנטי-וסקולרית החזקה של תאי כלי דם צביעה אחת בפתח העורק הבין-צלעי שבו ידוע על הפרעה בזרימת הדם. בתמונות אלה ניתן להבחין בצביעת פנים של צוואר שמאל קשור חלקית ועורק ימני לא קשור בקרה יום לאחר הניתוח, עם מולקולת הידבקות מוגברת של תאים אנטי וסקולריים הנראית, צביעה אחת נראית בכלי הקשירה.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע קשירת עורק צוואר שמאלי חלקית ולבצע תכשירים פנים בכלי דם של עכברים. קח את זה עם האופטיקה שלך לבעלי חיים קטנים אחרים. השימוש בתכשירים לפנים מוגבל כיום לצביעה של תפרחת חיסונית, אך ניתן להשתמש בהם גם בשיטות אחרות, כגון למחקר של אותם אזורים שלמים לאחר צביעת אוריול, או לניסויי נגד ex vivo.