Name: דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: חקור שיטה לזיהוי שיירים קריטיים בקישור נוגדנים חד-שבטיים נטרלים ל-HA של וירוס שפעת A. הפרוטוקול משתמש בביצי תרנגולת מופרות ובתרביות תאים MDCK ליצירת וריאנטי בריחה ומיפוי אפיטופים לפיתוח חיסונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה יש כבר מומן בחלקו עם כספים פדרליים מן המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, מכוני הבריאות הלאומיים, מחלקת הבריאות ושירותי האנוש של, תחת CEIRS חוזה HHSN272201400008C (f. K); NIH U19AI109946-01 (F. K); P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

<ol><li>Shaw, M. L., Palese, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+ML+%22Orthomyxoviridae%3A+the+viruses+and+their+replication%22">Orthomyxoviridae: the viruses and their replication</a>. , (2013).</li>
<li>Nelson, M. I., Holmes, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+epidemic+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The evolution of epidemic influenza.</a> Nat Rev Genet. 8 (3), 196-205 (2007).</li>
<li>Lauring, A. S., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quasispecies+Theory+and+the+Behavior+of+RNA+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Quasispecies Theory and the Behavior of RNA Viruses.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001005(2010).</li>
<li>Henry Dunand, C. J., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preexisting+human+antibodies+neutralize+recently+emerged+H7N9+influenza+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Preexisting human antibodies neutralize recently emerged H7N9 influenza strains.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1255-1268 (2015).</li>
<li>Dunand, C. J. H., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Neutralizing+and+Non-Neutralizing+Human+H7N9+Influenza+Vaccine-Induced+Monoclonal+Antibodies+Confer+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection.</a> Cell Host Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).</li>
<li>Tan, G. S., Lee, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Broadly+Neutralizing+Monoclonal+Antibody+That+Targets+the+Fusion+Domain+of+Group+2+Influenza+A+Virus+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin.</a> J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).</li>
<li>Tan, G. S., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly-Reactive+Neutralizing+and+Non-neutralizing+Antibodies+Directed+against+the+H7+Influenza+Virus+Hemagglutinin+Reveal+Divergent+Mechanisms+of+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection.</a> PLoS Pathog. 12 (4), e1005578(2016).</li>
<li>Smith, K., Garman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li>
<li>Steel, J., Lowen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+vaccine+based+on+the+conserved+hemagglutinin+stalk+domain%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly+protective+stalk-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.</a> J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).</li>
<li>Wang, T. T., Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+a+synthetic+peptide+from+the+influenza+virus+hemagglutinin+provides+protection+against+distinct+viral+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vaccination with a synthetic peptide from the influenza virus hemagglutinin provides protection against distinct viral subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18979-18984 (2010).</li>
<li>Impagliazzo, A., Milder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+trimeric+influenza+hemagglutinin+stem+as+a+broadly+protective+immunogen%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.</a> Science. 349 (6254), 1301-1306 (2015).</li>
<li>Krammer, F., Palese, P., Steel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Universal+Influenza+Virus+Vaccine+Design+and+Antibody+Mediated+Therapies+Based+on+Conserved+Regions+of+the+Hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. , (2014).</li>
<li>Wohlbold, T. J., Nachbagauer, R., Margine, I., Tan, G. S., Hirsh, A., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+soluble+headless+hemagglutinin+protects+mice+from+challenge+with+divergent+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Vaccination with soluble headless hemagglutinin protects mice from challenge with divergent influenza viruses.</a> Vaccine. 33 (29), 3314-3321 (2015).</li>
<li>Ekiert, D. C., Bhabha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324 (5924), 246-251 (2009).</li>
<li>Ekiert, D. C., Friesen, R. H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li>
<li>Dreyfus, C., Laursen, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Conserved+Protective+Epitopes+on+Influenza+B+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses.</a> Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).</li>
<li>Tran, E. E. H., Podolsky, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+Microscopy+Structures+of+Chimeric+Hemagglutinin+Displayed+on+a+Universal+Influenza+Vaccine+Candidate%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron Microscopy Structures of Chimeric Hemagglutinin Displayed on a Universal Influenza Vaccine Candidate.</a> mBio. 7 (2), e00257(2016).</li>
<li>Wiley, D. C., Wilson, I. A., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+identification+of+the+antibody-binding+sites+of+Hong+Kong+influenza+haemagglutinin+and+their+involvement+in+antigenic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation.</a> Nature. 289 (5796), 373-378 (1981).</li>
<li>Gerhard, W., Yewdell, J., Frankel, M. E., Webster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+structure+of+influenza+virus+haemagglutinin+defined+by+hybridoma+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Antigenic structure of influenza virus haemagglutinin defined by hybridoma antibodies.</a> Nature. 290 (5808), 713-717 (1981).</li>
<li>Jackson, D. C., Murray, J. M., White, D. O., Gerhard, W. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+antigenic+sites+of+influenza+virus+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Enumeration of antigenic sites of influenza virus hemagglutinin.</a> Infect Immun. 37 (3), 912-918 (1982).</li>
<li>Matsuzaki, Y., Sugawara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+Mapping+of+the+Hemagglutinin+Molecule+of+A%2F%28H1N1%29pdm09+Influenza+Virus+by+Using+Monoclonal+Antibody+Escape+Mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Epitope Mapping of the Hemagglutinin Molecule of A/(H1N1)pdm09 Influenza Virus by Using Monoclonal Antibody Escape Mutants.</a> J Virol. 88 (21), 12364-12373 (2014).</li>
<li>Tan, G. S., Krammer, F., Eggink, D., Kongchanagul, A., Moran, T. M., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-H1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).</li>
<li>Geneva: World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+manual+on+animal+influenza+diagnosis+and+surveillance%22">WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance</a>. , (2002).</li>
<li>Brauer, R., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+Virus+Propagation+in+Embryonated+Chicken+Eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs.</a> J Vis Exp. (97), e52421(2015).</li>
<li>Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Recombinant+Influenza+Virus+from+Plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA.</a> J Vis Exp. (42), e2057(2010).</li>
<li>Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+primer+set+for+the+full-length+amplification+of+all+influenza+A+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22ArchVirol%22%5BJournal%5D)">Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses.</a> ArchVirol. 146 (12), 2275-2289 (2001).</li>
<li>Zhou, B., Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+Influenza+B+Virus+Genomic+Amplification+Facilitates+Sequencing%2C+Diagnostics%2C+and+Reverse+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Universal Influenza B Virus Genomic Amplification Facilitates Sequencing, Diagnostics, and Reverse Genetics.</a> J Clin Microbiol. 52 (5), 1330-1337 (2014).</li>
<li>Sidhu, S. S., Kossiakoff, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+and+designing+protein+function+with+restricted+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring and designing protein function with restricted diversity.</a> Curr Opin Chem Biol. 11, 347-354 (2007).</li>
<li>Chen, C. -W., Chang, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+Scanning-assisted+Identification+of+a+Monoclonal+Antibody-recognized+Linear+B-cell+Epitope%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope.</a> J Vis Exp. (121), e55417(2017).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

אמנם הרוב המכריע של שאריות מזוהה באמצעות מוטציות לברוח היה מדויק, אחד ההליכים העיקריים של גישה זו הוא כי מוטציות נקודה של בריחה משתנים עלול שלא בהכרח ממופה בתוך טביעת רגלו מולקולרית של הנוגדן כפי שנקבע על ידי ניתוחים מבנית. זאת בשל היכולת של מוטציה במשקע מסוימים להוביל לשינוי הסתגלותי דיסטלי למיקום של השאריות שעברו מוטציה, מקביל אפקט allosteric. מגבלה נוספת היא כי מתודולוגיה זו בלבד ניתן ליישם על נטרול נוגדנים; נוגדנים חסרי במבחנה הלחץ הסלקטיבי לא תוביל לברוח מוטציות. עם זאת, מגבלה זו ניתן להתגבר עם השימוש של פאנל של גרסאות לברוח שנוצר על ידי נוגדנים נטרול מאופיין בעבר. השיזוף. et al. בשימוש של וריאנט הבריחה של mAb נטרול הוירוס H7N9 למפות את epitope של נוגדן-נטרול7.
למרות זאת, שחקרתי את epitopes של נוגדנים דרך הדור של בריחה משתנים מספק אלטרנטיבה מעשית קריסטלוגרפיה, הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ, אשר שניהם דורשים השקעה נרחבת של ציוד. חלופות אחרות הן לקבוע האזור איגוד מינימלי של mAbs באמצעות מוטציות סריקה/חיתוך סריקה או פפטיד אלנין. אלנין סריקה מוטגנזה מכוונת עשויים לדרוש כמות משמעותית של עבודה על מנת לייצר מספר גדול של משתנים במהלך ההקרנה29, בעוד פפטיד סריקה מוגבלת ליניארי epitopes30. השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה דורש ציוד מיוחד או טכניקה, למעשה, עושה שימוש הקיים במבחנה ניטרול מבחני שונה כדי ליצור גרסאות הבריחה של נוגדנים עניין.
הפרוטוקול עבור גרסאות לברוח ביצירת הדורשים מעברים מרובים (למשל, נוגדנים ספציפיים גבעול) תלויה מאוד הריכוז ההתחלתי של נוגדן בקטע 0. עדיף במשנה זהירות, מתחילים ב יומן חצי ליומן רישום נמוך יותר מאשר חצי מקסימלי מעכבות ריכוז נוגדן ולאפשר לצמיחה וירוס חזקים. החוקר יכול לשער כי תרבות וירוס כייל נוגדנים גבוה בנוכחות לחץ חיסונית נמוך יהיה וריאציה גנטית גדולה באוכלוסייה ויראלי. הבריחה גרסאות שניתן לבחור עבור הגדלת בהדרגה את ריכוז נוגדן בקטע הבא. במקרה בו הגידול וירוס יורדת, כמות תגובת שיקוע נגיפי ניתן להגדיל ב המעבר הבא תוך שמירה על כמות זהה של ריכוז נוגדן במעבר הקודם.
המטרה של רוב של חיסונים שפעת אוניברסלי היא מביאות לתגובה נוגדנים חזקים לכיוון האזור גבעול הוואי. הניתוחים של בריחה משתנים כדי נוגדנים ספציפיים גבעול חשובים הגדרת קשרי הגומלין בין כושר וירוס שפעת ובלחץ אימונולוגי. מעניין, וירוסים מוטציה להימלט הנובע mAbs גבעול ספציפי היו כל הקלוש ויוו מאתר LD50 מחקרים4. מחקרים אלה מספקים תיק חזק לפלטפורמות החיסונים מבוסס על גבעול. בנוסף, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות מוטציות לברוח כדי תרכובות אנטי-ויראליות אחרות, כגון מעכבי מולקולה קטנה. לבסוף, מתודולוגיה זו אינה מוגבלת glycoproteins משטח של וירוס שפעת, אך גם ניתן באופן נרחב יותר להחיל כדי לקבוע את epitopes של אחרים glycoproteins ויראלי.

בדומה וירוסים אחרים, ה-RNA, שפעת A וירוסים בעלי של פולימראז לשגיאות המאפשר לדור של מספר רב של גרסאות antigenic עם כל סיבוב של שכפול-1,-2,-3. ה שפעת וירוס יש יכולת מדהימה להסתגל, להתחמק התגובה החיסונית האנושית באמצעות סחיפה antigenic, אשר מושגת באמצעות הצטברות של מוטציות על glycoproteins פני השטח שמוביל האובדן של הנוגדן מחייב. הסחף antigenic של נגיפי glycoproteins פני השטח, הא ו neuraminidase (NA), מחייבת את הצורך ננסח מחדש לנהל את החיסון מדי שנה.
התקדמות טכנולוגית בידוד, דור של אנטיגן ספציפי נוגדנים הניבו מספר גבוה של חיסון-induced mAbs4,5,6,7,8. בתורו, אפיון epitopes של mAbs זה בהרחבה לנטרל וירוסים שפעת A עזר במידה רבה את התפתחות מספר שפעת אוניברסלי חיסון מועמדים9,10,11, 12,13,14. שחקרתי antigenic טביעת רגלו של mAb חושף את גורמים מבניים של ניטרול ומאפשר גישה מושכלת לקראת עיצוב חיסון. עם זאת, זה לא מציאותי ולא חסכונית עבור מעבדות לאפיין מבחינה מבנית לוחות נרחבים של mAbs באמצעות קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או הקפאה-מיקרוסקופ כדי למפות epitopes אנטיגן ויראלי בכביש15, 16 , 17 , 18.
קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או הקפאה-מיקרוסקופ דורש ציוד יקר, טכניקות מיוחדות שעשויות להיות כמות נרחבת של זמן להפיק נתוני. גישה חלופית ומהירה הוא ניצול הדור מהירה של אוכלוסיות מגוונות ויראלי באמצעות תלויי-RNA לשגיאות RNA פולימראז ליצירת מוטציות לברוח כדי לקבוע את epitopes של mAbs19,20, 21,22,23. הדור של בריחה משתנים ואינו דורש שום ציוד מיוחד או טכניקה, יכול להתבצע עם ריאגנטים המעבדה קונבנציונליות וציוד.
כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת המיפוי של שאריות קריטי הנדרש עבור איגוד mAb לזהות את שפעת HA...

<table><tbody><tr><td>Falcon 96 באר שטוחה שטוחה שטופלה במיקרו-צלחת תרבית TC עם מכסה</td><td>קורנינג, בע"מ.</td><td>353072</td><td>שימוש בצלחת הבדיקה לבדיקת המיקרו-נטרול</td></tr><tr><td>Falcon 96-well צלחת V שקופה</td><td>קורנינג, בע"מ.</td><td>353263</td><td>שימוש בצלחת בדיקה לבדיקת עיכוב המגלוטינציה</td></tr><tr><td>1X מדיום חיוני מינימלי (MEM)</td> <td>מדיום זיהום</td><td>11095080</td> <td>גיבקו</td></tr><tr>טריפסין סיגמא-אולדריץ' T8802<td>מטופל בטריפסין</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>T8802</td><td>לא בשל <תת>0</תת> ל-HA<תת>1</תת> ונוגדנים</td></tr> <tr><td>ראשוניים אנטי-NP (IAV</td><td>) עם HA<תת>22</תת>ביוטינילEMD Millipore</td><td>MAB8258B</td><td>נוגדן המזהה את חלבון ה-NP של נגיפי שפעת A</td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני אנטי-NP ביוטינילטיבי (IBV)</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB8260B-5</td><td>נוגדן המזהה את חלבון ה-NP של נגיפי שפעת B</td></tr><tr><td>נוגדן Streptavidin-HRP</td><td>EMD Millipore</td><td>18-152</td><td>זה משמש כנוגדן משני למצע הנוגדן הביוטינילטיבי נגד NP</td></tr><tr><td>HRP (SIGMAFAST-OPD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9187-5SET</td><td>o-phenylenediamine dihydrochloride מצע מסיס במים עבור HRP</td></tr><tr><td>96 בארות צלחת תחתונה V</td><td>Nunc</td><td>249662</td><td>צלחת בדיקה המשמשת לבדיקת המגלוטינציה</td></tr><tr><td>תאי דם אדומים עוף</td><td>מעבדות ביולוגיות</td><td>7201403</td><td>משמש להערכת יכולתו של נגיף השפעת לצבור</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td>מיצוי RNA</td></tr><tr><td>Superscript III</td><td>Invitrogen</td><td>12574018</td> ערכת מיצוי ג'ל <td>טרנסקריפטאז הפוך</td></tr><tr><td></td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>בידוד של מוצר PCR מוגבר</td></tr><tr><td>ליפופקטמין 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>מגיב טרנספקציה</td></tr><tr><td>אנטי אנושי IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11013</td><td>נוגדן משני פלואורסצנטי לאדם נוגדנים</td></tr><tr><td>נגד עכבר IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>נוגדן משני פלואורסצנטי לנוגדנים לעכברים</td></tr><tr><td>6 בארות פוליסטירן מיקרופלייט</td><td>Corning, Inc.</td><td></td><td></td>353934</tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene אחסון לטווח ארוך Cryo-tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5012-0020</td><td>הקפאת תרבית ויראלית supernatant</td></tr><tr><td>reassortant A/California/04/09 (H1)</td>וירוס reassortant <td>במעבדה חיוורת</td><td>המבטא את ה-HA וה-NA של A/California/04/09 (H1N1) עם המקטעים הפנימיים של A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td><td></td></tr><tr><td>reassortant A/Shanghai/1/13 (H7)נגיף reassortant</td> <td>במעבדה</td><td></td> Palese <td>המבטא את ה-HA וה-NA של A/Shanghai/1/13 (H7N9) עם המקטעים הפנימיים של A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td></tr><tr><td>תמיסת אלבומין בסרום בקר (35%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979</td><td></td></tr><tr><td>ערכת תוספת ג'ל Qiagen</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>טיהור מבוסס קרום סיליקה של שברי DNA</td></tr></tbody></table>

דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

וירוסים שפעת להפגין יכולת מדהימה להסתגל, להתחמק את התגובה החיסונית של המארח. אחת הדרכים היא באמצעות antigenic שינויים המתרחשים glycoproteins משטח של הנגיף. הדור של גרסאות הבריחה היא שיטה חזקה שחקרתי כמה וירוסים לחמוק מגילוי המערכת החיסונית, זיהוי שאריות קריטי הנדרש עבור איגוד נוגדן. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול על איך ליצור גרסאות הבריחה של וירוס שפעת A על ידי ניצול אנושי או מאתר נוגדנים חד-שבטיים (mAbs) נגד את hemagglutinin ויראלי (HA). עם השימוש של הטכניקה שלנו, אנחנו בעבר אפיינו את שאריות קריטי הנדרש עבור האיגוד של נוגדנים מיקוד הראש או גבעול של הרומן העופות H7N9 HA. הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות למערכות אחרות וירוס. ניתוחים של בריחה משתנים חשובים עבור מידול antigenic להיסחף, קביעת פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחיד (SNPs) היוועצות ההתנגדות וכושר וירוס, ולא של עיצוב של חיסונים ו/או הרפוי.

השתמשנו בעבר וריאציות של שיטה זו כדי ליצור גרסאות לברוח כדי mAbs מאתר ואנושי המושרה על ידי חיסון נגד וירוס שפעת עונתית, H7N9 חיסון, או רציפים DNA/רקומביננטי HA חלבון חיסון4,5 ,6,7. כמתואר לעיל, נוגדנים קודם מאופיינים בעזרת את מבחני HI ו- microneutralization כדי להודיע לנו על איזה פרוטוקול ספציפי כדי להמשיך עם4,הבא5. נוגדנים ד 07-5 03, 07-5F01, 07-5 ג' 01, 07-4B03, 07-4E02 ו- 07-4D 05 נמצאו HI ופעילויות ניטרול נגד הנגיף H7N9 העופות (A/שנגחאי/1/2013) (טבלה 1), ובכך היה מנוצל פרוטוקול 1 (שלב 2.1). עבור mAbs עם לנטרל את חוסר פעילות HI, כגון 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 ו- S6-B01 (טבלה 1), פרוטוקול 2 (שלב 2.2) נעשה שימוש כדי ליצור גרסאות לברוח. מיפוי מוטציה להימלט חשף כי רבים של הנוגדנים מזהה שאריות קריטי במיקומים שונים על נגיפי HA4,5 (איור 4). בעוד רוב הנוגדנים HI-חיובית יש לברוח שאריות מוטציה ליד אתרי antigenic שדווח בעבר של H7 HA, הנוגדנים HI-שלילי שנוצר מוטציות לברוח עם מוטציות נקודה גבעול אזור4,5 .
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>נוגדן</td>
			<td>היי פעילות</td>
			<td>NEUT פעילות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5D 03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5F01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5 ג' 01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4B03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4E02</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4D 05</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41-5E04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>045-051310-2B06</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>042-100809-2F04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S6-B01</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: שולחן פעילות HI וניטרול נוגדן. MAbs H7 ספציפיים עשר מבודד מאנשים שחוסנו חיסון ניסיוני H7N9 התערוכה שונים במבחנה פעילות אנטי5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">פריימר לפנים (5' ל 3')</td>
			<td colspan="4">הפוך פריימר (5' ל 3')</td>
			<td colspan="2">תנאי Thermocylcer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV</td>
			<td colspan="4">TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG</td>
			<td colspan="4">ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT</td>
			<td colspan="2">ºC 42 עבור 60 דקות, ºC 94 2 min/5 מחזורים של 94 ºC עבור 20 s, ºC 50 על 30 s ו- 68 ºC במשך 3 דקות 30 s, ואחריו 40 מחזורי 94 ºC 20 s, ºC 58 על 30 s , ו- 68 ºC עבור 3 דקות 30 s עם זמן סיומת הסופי ב- 68 ºC 10 דקות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBV</td>
			<td colspan="4">GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC</td>
			<td colspan="4">CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC</td>
			<td colspan="2">ºC 45, 60 דקות, ºC 55 במשך 30 דקות, ºC 94 2 min/5 מחזורים של 94 ºC עבור 20 s, ºC 40 ל 30 s ו- 68 ºC במשך 3 דקות 30 s, ואחריו 40 מחזורי 94 ºC 20 s , ºC 58 על 30 s, ו- 68 ºC עבור 3 דקות 30 s עם זמן סיומת הסופי ב- 68 ºC 10 דקות</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
בטבלה 2: תחל וירוס שפעת אוניברסלי- פריימר זוגות עבור ההגברה של המקטעים HA של שפעת A27 , וירוסים28 B, מצבם thermocycler בהתאמה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig1.jpg"> 
איור 1: HI assay- מפרטים טכניים עבור ההגדרה למעלה assay HI לבדוק הפעילות של שני העכבר ספציפיים H1 mAbs 7B2 (ראש-ספציפי), 6F12 (גבעול-ספציפי) באמצעות צלחת V-התחתון 96-ובכן, ו- (B) דוגמה של תוצאות וזמינותו HI23(א) א. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig2.jpg"> 
איור 2: Microneutralization assay. מפרטים טכניים עבור הגדרת assay microneutralization לבחון את הפעילות של שני בני אדם mAbs 4D 055 ו CR911417. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig3.jpg"> 
איור 3: דור של מוטציות לברוח. המתודולוגיה הציע יהיו תלויים בגבוה הפעילות microneutralization הוצגו על ידי הנוגדן. הדור של בריחה מוטציות נגד (A) נוגדנים HI-חיוביות נטרול עשויים לדרוש קטע אחד קטן, ביצים, בעוד נוגדנים HI-שלילי נטרול (B) עשויה להיות כרוכה מעברים מרובים עם הגדלת סכומי נוגדן תרבית רקמת תאים. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig4.jpg"> 
איור 4: דוגמה של מפה של epitope של הרומן העופות H7N9 חה שנוצר עם משתנים מוטציה להימלט. חיסון-induced נוגדנים מבודדים מאנשים שחוסנו מועמד שפעת H7N9 חיסון שימשו כדי ליצור גרסאות מוטציה להימלט. כל שאריות שצוינו האדום מייצג את המיקום של חומצות אמינו קריטי הנדרש עבור איגוד יעיל של mAb. הנתונים היו ממאמרו של Dunand הנרי. et al., 20154. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

אנו מתארים שיטה שבאמצעותה אנו מזהים שאריות קריטי הנדרש עבור האיגוד של נוגדנים חד-שבטיים אנושית או מאתר שמכוונות את hemagglutinin נגיפי שפעת A וירוסים. הפרוטוקול ניתן להתאים glycoproteins משטח אחר וירוס, נוגדנים נטרול המתאימים שלהם.

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

המטרה הכללית של שיטה זו היא לספק פרוטוקול עבודה להבהרה של האפיטופ של נוגדן מונוקלונאלי מנטרל. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי האימונולוגיה והוירולוגיה, אשר עשויות לעזור בהגדרת אינטראקציות בין מאח ונגיף, ובפיתוח כלים טיפוליים ואבחנאיים, שכל זאת יכול לסייע בתכנון של חיסונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצעה באמצעות טכניקות בסיסיות של תרביות רקמה וביולוגיה מולקולרית, ללא צורך במכשירים או בציוד מיוחד.את הפרוצדורה יעגיל מארק ביילי (Mark Bailey), סטודנט לרפואה (MD) ולדוקטורט (PhD) מהמעבדה של פיטר פאלזה (Peter Palese). התחילו את הפרוצדורה באפיון של נוגדנים על בסיס עיכוב המגלוטינציה של כדוריות דם (hemoagglutination inhibition), או HI, ופעילות נטרול כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. נוגדנים מנטרלים בעלי פעילות HI מנותחים בהמשך על ידי הכנת ארבעה דילולות של הנוגדן המדובר בריכוזים עולים ב-1x PBS בנפח של 100 µL לכל דילול.בשלב הבא, הכינו תמיסת נגיף (virus stock) בריכוז של מיליון יחידות יוצרות פlaque (plaque-forming units) למילילטר ב-1x PBS בנפח של 400 µL. לאחר מכן, ערבבו 100 µL של תמיסת נגיף בריכוז של מיליון plaque-forming units למילילטר עם 100 µL מכל דילול של נוגדן או עם 100 µL של 1x PBS. דגרו את הדגימות למשך שעה אחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide.לאחר ערבול קצר בורטקס (vortex), מזריקים 200 µL מכל תערובת לתוך ביצי תרנגולת מופריות נקיות מפתוגנים ספציפיים. לאחר מכן, מדגרירים את הביצים בטמפרטורה של 37 °C ללא פחמן דו-חמצני למשך 40 עד 44 שעות. לאחר הדגירה, הריגים את הביצים המופריות שהודבקו בנגיף על ידי העברתן לטמפרטורה של 4 °C למשך שש שעות לפחות.בשלב הבא, קצרו את הנוזל האלנטואי (allantoic fluid) מהביצים כפי שתואר קודם לכן. לבסוף, אששו את וריאנטי הבריחה (escape variants) על ידי ביצוע בדיקת HI כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להפיק וריאנטי בריחה נגד נוגדנים מנטרלים החסרים פעילות HI, יש להעביר את הווירוס במעברים (passaging) בנוכחות כמויות עולות של נוגדנים.זריעו תאי MDCK בפלטה בעלת שישה בארות בצפיפות של מיליון תאים לבאר. הדגירו את התאים למשך ארבע שעות לפחות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5% carbon dioxide. במקביל, דללו את מלאי הנגיף לריכוז של מיליון plaque-forming units למיליליטר.הכינו דילול בודד של נוגדן בריכוז 0.02 milligrams per milliliter בתוך MEM בריכוז one times עם trypsin שעבר טיפול ב-TPCK, בנפח של 250-microliter. השתמשו בריכוזי נוגדנים גבוהים יותר עבור כל המעברים הבאים. ערבבו 250 microliters של נגיף מדולל עם 250 microliters של נוגדן מדולל, או עם 250 microliters של MEM בריכוז one times כביקורת ללא נוגדן.דגרו את תערובת הנוגדנים לנגיף למשך 30 דקות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5% carbon dioxide. לאחר דגירת התאים, שאבו את המצע באמצעות פיפט פסטור מזכוכית ושטפו את שכבת התאים המונו-שכבתית עם 1 mL של 1x PBS. הוסיפו 500 µL מהתערובות לבארות לפני דגירה באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5% carbon dioxide למשך שעה אחת.לאחר שעה אחת, הוסיפו לבארים שני מיליליטרים של MEM בריכוז פי אחד עם trypsin שעבר טיפול ב-TPCK. בדקו את התאים 48 שעות לאחר ההדבקה כדי לחפש סימנים לאפקט ציטופתי, או CPE, תחת המיקרוסקופ, או בצעו בדיקת המגלוטינציה כדי לזהות גידול ויראלי. אם קיים CPE של גידול בתרבית שהוסיפו לה נוגדן, אספו את העליון (supernatant) למספר קריו-מבחנות (cryotubes).סמנו את המבחנות במספר המעבר ואחסנו אותן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. שמרו 100 µL מהעליי (supernatant) כדי להדביק שכבה חדשה של תאי MDCK עם 2 mL של MEM בריכוז 1x, בתוספת TPCK trypsin ונוגדן. זכרו לכלול בקרת "ללא נוגדן" עבור כל מעבר.העלו את ריכוז הנוגדן בכל מעבר עוקב עד שצמיחת הנגיף עדיין תהיה חיונית, גם בריכוז הסופי של 0.6 milligrams per milliliter של נוגדן. הקפיאו מספר מבחנות של עלונוספנאנט מכל מעבר ואחסנו בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius. המשיכו לבידוד ולניתוחים של הווריאנטים שברחו כפי שמפורט בפרוטוקול הכתוב.נוגדנים שהושרה על ידי חיסון, אשר בודדו מאנשים שחוסנו בחיסון המועמד לשפעת A מסוג H7N9, שימשו ליצירת וריאנטים של מוטציות מילוט (escape mutants). מיפוי של מוטציות המילוט חשף כי רבים מהנוגדנים זיהו שאריות קריטיות במיקומים נפרדים על ה-HA הויראלי. כל שארית, המסומנת באדום, מייצגת את המיקום של חומצות אמינו קריטיות הנדרשות לקשירה יעילה של נוגדן מונוקלונלי, בעוד שמרבית הנוגדנים החיוביים ל-HI הראו שאריות של מוטציות מילוט סמוך לאתרים אנטיגניים של H7HA שדווחו בעבר. הנוגדנים השליליים ל-HI יצרו מוטציות מילוט עם מוטציות נקודתיות באזור המגוף (stalk region).לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן להשתמש בה כדי לה 규ש את הגורמים המבניים הקובעים את ההגנה מפני פתוגנים אחרים. טכניקה זו אינה מוגבלת רק ליצירת וריאנטים של בריחה (escape variants) של נוגדים מונוקלונליים, אלא יעילה גם נגד תרכובות אנטי-ויראליות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לה 규ש את האפיטופ של קישור נוגדים מונוקלונליים על ידי יצירת וריאנטים של בריחה in vitro.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנהוג בזהירות בעבודה עם וירוסים ולהשתמש בציוד הגנה אישי מתאים.

generation-escape-variants-neutralizing-influenza-virus-monoclonal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת גרסאות מילוט של נוגדנים חד-שבטיים של נגיף השפעת המנטרל. תרחיף וירוס מנוטרל נוגדנים מוזרק לביצי תרנגולת עובריות כדי להפיץ גרסאות בריחה באופן סלקטיבי. התוצאה היא אוכלוסיית וירוסים בעיקר של וריאנטים בריחה, שאושרו באמצעות בדיקת Hemagglutination.

יצירת וריאנטים של הימלטות מנגיף השפעת מפני נוגדנים מנטרלים

הסרטון מציג שיטה ליצירת נגיפי שפעת רקומביננטיים מותאמים לקור. היא כרוכה בהדבקת תאים אנושיים בפלסמידים דו-כיווניים, ולאחר מכן דגירה בטמפרטורה נמוכה יותר כדי להניב נגיפים המתאימים לייצור חיסונים, המאופיינים בשכפול מופחת בתנאים חמים יותר.

יצירת נגיפי שפעת חיים מוחלשים רקומביננטיים לחיסונים

הצלת Arenaviruses רקומביננטי מcDNAs המשובטים, גישה המכונה להפוך גנטיקה, מאפשרת לחוקרים לחקור את התפקיד של מוצרים גנטיים נגיפיים ספציפיים, כמו גם את תרומתו של תחומים ושאריות הספציפיים השונים שלהם, להיבטים רבים ושונים של הביולוגיה של arenavirus . כמו כן, להפוך טכניקות גנטיקה בשורות תאי ה-FDA (Vero) לפיתוח חיסון מספק אפשרויות חדשות לייצור חיסונים יעילים ובטוחים כדי להילחם Arenaviruses פתוגניים אדם.

דור של Arenavirus רקומביננטי לפיתוח חיסון בתאי Vero-FDA

כאן אנו מתארים את דרך להביע את פני השטח אנטיגנים וירוס שפעת בצורה נכונה מקופלים ופונקציונליים הנגזרים מנגיף H7N9 הרומן הסיני בתאי חרקים. הטכניקה יכולה להיות מותאמת להביע ectodomains של כל משטח חלבונים נגיפיים או סלולריים.

ביטוי של חלבונים רקומביננטי hemagglutinin וNeuraminidase פונקציונליים מוירוס רומן H7N9 שפעת שימוש במערכת ביטוי baculovirus

מוצג פרוטוקול אופטימלי ליצירת נוגדנים חד-שבטיים המבוססים על טכנולוגיית ההיברידומה. עכברים חוסנו בחומר חיסוני. תאי הטחול התמזגו על ידי PEG ודחף חשמלי עם תאי מיאלומה אלמותיים. תאי היברידומה המייצרים נוגדנים נבחרו על ידי HAT ובדיקת ELISA ספציפית לאנטיגן.

הדור של Murine חד-שבטיים נוגדנים על ידי Hybridoma טכנולוגיה

מחקר זה מתאר   מבוססי הדמיה assay מיקרו-נטרול לנתח את היחסים בין אנטיגני וירוסים. פרוטוקול מעסיקה וסורק ויש לו ארבעה שלבים, כולל טיטרציה, quantitation טיטרציה, נטרול, ו quantitation הניטרול. את assay עובד היטב עם שפעת A במחזור הנוכחי (H1N1) pdm09, A (H3N2), ווירוסים B.

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

אנו מתארים שיטה כדי למדוד ההפעלה של פונקציות אפקטור Fc בתיווך על ידי נוגדנים את המטרה hemagglutinin וירוס שפעת. ניתן גם להתאים assay הזה כדי להעריך את היכולת של נוגדנים חד-שבטיים או polyclonal סרה מיקוד אחרים glycoproteins משטח ויראלי לזירוז חסינות בתיווך Fc.

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

נוגדנים נטרול שפעת לתאם עם הגנה של דלקות שפעת. מבחני Microneutralization למדוד נוגדנים נטרול של sera אנושי, משמשים לעתים קרובות על שפעת אנושית סרולוגיה. אנו מתארים וזמינותו של microneutralization באמצעות MDCK-SIAT1 תאים כדי למדוד נטרול נוגדן titers עכשווי וירוסים A(H3N2) 3C.2a ו- 3C.3a בעקבות חיסון שפעת או זיהום.

מבחני מדידת שפעת בנטרול תגובות נוגדנים וירוסים A(H3N2) סרה האנושי על-ידי Microneutralization באמצעות תאים MDCK-SIAT1

מחקר זה מתאר של תפוקה גבוהה, assay מיקרו-ניטרול מבוססת הדמיה כדי לקבוע את כייל נוגדנים נטרול ספציפיות עבור הווירוס syncytial הנשימה (RSV). תבנית זו assay נבדקו על סוגי דגימה שונים.

Assay מיקרו-ניטרול קצב העברת נתונים משופר וגבוה הווירוס Syncytial הנשימה (RSV)

פרוטוקול זה מתאר תהליך ניסיוני כדי לייצר מעטפת מדבקת ויראלי מידבקת (עמ') עם גליקורופנים מעטפות משתי שפעת זנים וכיצד לקבוע את הנגועים. פרוטוקול זה מאוד להתאמה כדי לפתח pps של כל סוג אחר של וירוסים עטוף עם מעטפה שונה גליקורופנס.

ייצור של שפעת מדבקת גבוהה-Titer חלקיקים מוקלדים עם מעטפה גליקורופנס מH5N1 פתוגניים מאוד H7N9 וירוסים העופות

פרוטוקול זה מתאר את היישום של פסאודו-וירוס היברידי חדשני מסוג אלפא-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2) כפלטפורמה לכימות מהיר של הדבקה של וריאנטים של SARS-CoV-2 ורגישותם לנוגדנים מנטרלים.

יישום של Ha-CoV-2 Pseudovirus לכימות מהיר של גרסאות SARS-CoV-2 ונוגדנים מנטרלים

חקור שיטה לזיהוי שיירים קריטיים בקישור נוגדנים חד-שבטיים נטרלים ל-HA של וירוס שפעת A. הפרוטוקול משתמש בביצי תרנגולת מופרות ובתרביות תאים MDCK ליצירת וריאנטי בריחה ומיפוי אפיטופים לפיתוח חיסונים.

דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

גלה סרטונים נוספים