דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

המטרה הכללית של שיטה זו היא לספק פרוטוקול עבודה להבהרה של האפיטופ של נוגדן מונוקלונאלי מנטרל. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי האימונולוגיה והוירולוגיה, אשר עשויות לעזור בהגדרת אינטראקציות בין מאח ונגיף, ובפיתוח כלים טיפוליים ואבחנאיים, שכל זאת יכול לסייע בתכנון של חיסונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצעה באמצעות טכניקות בסיסיות של תרביות רקמה וביולוגיה מולקולרית, ללא צורך במכשירים או בציוד מיוחד.

את הפרוצדורה יעגיל מארק ביילי (Mark Bailey), סטודנט לרפואה (MD) ולדוקטורט (PhD) מהמעבדה של פיטר פאלזה (Peter Palese). התחילו את הפרוצדורה באפיון של נוגדנים על בסיס עיכוב המגלוטינציה של כדוריות דם (hemoagglutination inhibition), או HI, ופעילות נטרול כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. נוגדנים מנטרלים בעלי פעילות HI מנותחים בהמשך על ידי הכנת ארבעה דילולות של הנוגדן המדובר בריכוזים עולים ב-1x PBS בנפח של 100 µL לכל דילול.

בשלב הבא, הכינו תמיסת נגיף (virus stock) בריכוז של מיליון יחידות יוצרות פlaque (plaque-forming units) למילילטר ב-1x PBS בנפח של 400 µL. לאחר מכן, ערבבו 100 µL של תמיסת נגיף בריכוז של מיליון plaque-forming units למילילטר עם 100 µL מכל דילול של נוגדן או עם 100 µL של 1x PBS. דגרו את הדגימות למשך שעה אחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide.

לאחר ערבול קצר בורטקס (vortex), מזריקים 200 µL מכל תערובת לתוך ביצי תרנגולת מופריות נקיות מפתוגנים ספציפיים. לאחר מכן, מדגרירים את הביצים בטמפרטורה של 37 °C ללא פחמן דו-חמצני למשך 40 עד 44 שעות. לאחר הדגירה, הריגים את הביצים המופריות שהודבקו בנגיף על ידי העברתן לטמפרטורה של 4 °C למשך שש שעות לפחות.

בשלב הבא, קצרו את הנוזל האלנטואי (allantoic fluid) מהביצים כפי שתואר קודם לכן. לבסוף, אששו את וריאנטי הבריחה (escape variants) על ידי ביצוע בדיקת HI כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להפיק וריאנטי בריחה נגד נוגדנים מנטרלים החסרים פעילות HI, יש להעביר את הווירוס במעברים (passaging) בנוכחות כמויות עולות של נוגדנים.

זריעו תאי MDCK בפלטה בעלת שישה בארות בצפיפות של מיליון תאים לבאר. הדגירו את התאים למשך ארבע שעות לפחות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5% carbon dioxide. במקביל, דללו את מלאי הנגיף לריכוז של מיליון plaque-forming units למיליליטר.

הכינו דילול בודד של נוגדן בריכוז 0.02 milligrams per milliliter בתוך MEM בריכוז one times עם trypsin שעבר טיפול ב-TPCK, בנפח של 250-microliter. השתמשו בריכוזי נוגדנים גבוהים יותר עבור כל המעברים הבאים. ערבבו 250 microliters של נגיף מדולל עם 250 microliters של נוגדן מדולל, או עם 250 microliters של MEM בריכוז one times כביקורת ללא נוגדן.

דגרו את תערובת הנוגדנים לנגיף למשך 30 דקות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5% carbon dioxide. לאחר דגירת התאים, שאבו את המצע באמצעות פיפט פסטור מזכוכית ושטפו את שכבת התאים המונו-שכבתית עם 1 mL של 1x PBS. הוסיפו 500 µL מהתערובות לבארות לפני דגירה באינקובטור בטמפרטורה של 37°C עם 5% carbon dioxide למשך שעה אחת.

לאחר שעה אחת, הוסיפו לבארים שני מיליליטרים של MEM בריכוז פי אחד עם trypsin שעבר טיפול ב-TPCK. בדקו את התאים 48 שעות לאחר ההדבקה כדי לחפש סימנים לאפקט ציטופתי, או CPE, תחת המיקרוסקופ, או בצעו בדיקת המגלוטינציה כדי לזהות גידול ויראלי. אם קיים CPE של גידול בתרבית שהוסיפו לה נוגדן, אספו את העליון (supernatant) למספר קריו-מבחנות (cryotubes).

סמנו את המבחנות במספר המעבר ואחסנו אותן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. שמרו 100 µL מהעליי (supernatant) כדי להדביק שכבה חדשה של תאי MDCK עם 2 mL של MEM בריכוז 1x, בתוספת TPCK trypsin ונוגדן. זכרו לכלול בקרת "ללא נוגדן" עבור כל מעבר.

העלו את ריכוז הנוגדן בכל מעבר עוקב עד שצמיחת הנגיף עדיין תהיה חיונית, גם בריכוז הסופי של 0.6 milligrams per milliliter של נוגדן. הקפיאו מספר מבחנות של עלונוספנאנט מכל מעבר ואחסנו בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius. המשיכו לבידוד ולניתוחים של הווריאנטים שברחו כפי שמפורט בפרוטוקול הכתוב.

נוגדנים שהושרה על ידי חיסון, אשר בודדו מאנשים שחוסנו בחיסון המועמד לשפעת A מסוג H7N9, שימשו ליצירת וריאנטים של מוטציות מילוט (escape mutants). מיפוי של מוטציות המילוט חשף כי רבים מהנוגדנים זיהו שאריות קריטיות במיקומים נפרדים על ה-HA הויראלי. כל שארית, המסומנת באדום, מייצגת את המיקום של חומצות אמינו קריטיות הנדרשות לקשירה יעילה של נוגדן מונוקלונלי, בעוד שמרבית הנוגדנים החיוביים ל-HI הראו שאריות של מוטציות מילוט סמוך לאתרים אנטיגניים של H7HA שדווחו בעבר. הנוגדנים השליליים ל-HI יצרו מוטציות מילוט עם מוטציות נקודתיות באזור המגוף (stalk region).

לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן להשתמש בה כדי לה 규ש את הגורמים המבניים הקובעים את ההגנה מפני פתוגנים אחרים. טכניקה זו אינה מוגבלת רק ליצירת וריאנטים של בריחה (escape variants) של נוגדים מונוקלונליים, אלא יעילה גם נגד תרכובות אנטי-ויראליות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לה 규ש את האפיטופ של קישור נוגדים מונוקלונליים על ידי יצירת וריאנטים של בריחה in vitro.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנהוג בזהירות בעבודה עם וירוסים ולהשתמש בציוד הגנה אישי מתאים.